Electroforesis

Qu es la electroforesis?
La electroforesis es una tcnica de separacin que

puede ser utilizada con fines analticos y que fue

introducida por el qumico sueco Arne Tiselius. El
inters principal de este investigador fue la qumica de
las protenas sricas. Por su trabajo pionero en este
campo, Tiselius recibi el Premio Nobel en 1948.

 Los mtodos electroforticos son de alta sensibilidad, eficacia,

poder de resolucin y versatilidad.

Mtodo de separacin de:

Protenas

cidos nucleicos

Otras biomolculas
Permite determinar:
Peso molecular de una protena
Punto isoelctrico
Distinguir molculas por su carga neta o su forma

Es una tcnica de separacin que consiste en el transporte de iones a

travs de una disolucin por accin de un campo elctrico.

Cada molcula se desplaza por efecto

del campo, alcanzando rpidamente
una velocidad constante al
equilibrarse la fuerza impulsora
(fuerza del campo elctrico) con la
resistencia al avance (fuerza de
friccin o rozamiento) impuesta por el
medio en el que se desplaza.

 La velocidad de migracin en un sistema electrofortico es:

Inversamente proporcional a la viscosidad del medio.
Proporcional a la fuerza aplicada al campo.
Proporcional a la carga neta de la molcula
Inversamente proporcional al tamao de la molcula.
Inversamente proporcional al coeficiente de friccin.


1)
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Tenemos:
Parmetros externos
Campo elctrico
Temperatura
Parmetros relacionados con el solvente y con el sistema
electrofortico
Viscosidad
Fuerza inica
La naturaleza de los iones componentes
El pH
Parmetros relacionados con el soluto
La carga
La forma y tamao de los iones

fuente de
alimentacin

cable

ctodo

nodo

electrodo

muestra
gel

electrodo

Componentes:
* Fuente de alimentacin
* Dos

(E. horizontal)
tampn

cubeta
muestra

electrodo

ctodo

cubeta

cable
nodo

* Cubeta
* Tampn de electroforesis
* Soporte electrofortico
(gel)

gel
fuente de
alimentacin

(E. vertical)

electrodos
nodo (+)
ctodo (-)

tampn

Tipos de Electroforesis
De frente mvil: los componentes de la muestra

estn presentes en toda la disolucin y se

determina pticamente la posicin del frente de
avance
o
frontera
con
el
disolvente
Zonal: la muestra se aplica como una mancha o

banda y sus componentes migran a travs de un

disolvente, utilizando adems un medio que soporta
a ste. En este caso no se determina la movilidad,
sino que el nico objetivo de la tcnica es separar
los
componentes
de
la
muestra.
Continua: la muestra se aplica tambin en una zona,

pero se suministra continuamente a lo largo del

proceso

Frente mvil
Aquella en la cual las partculas se mueven de forma libre en el

medio en el que se encuentran dispersas.

Las sustancias a separar se introducen en un tubo en forma de U,
disueltas en un tampn de pH y fuerza inica adecuados. Se
colocan los electrodos en sendos brazos del dispositivo, entre
los que se crea un campo elctrico, provocando que las
molculas de la muestra (por ejemplo: protenas) cargadas
emigren hacia los electrodos de polaridad opuesta.

De zona
La disolucin a tratar se aplica como una mancha, o como una
banda, y las partculas migran a travs de un disolvente,
utilizando adems un medio soporte inerte y homogneo, tal
como el papel o ciertos tipos de geles. Esta tcnica es utilizada
para analizar mezclas, para determinar la pureza de una muestra,
para detectar cambios de movilidad o de conformacin de
sustancias.

Medios de soporte para la

electroforesis
La muestra debe situarse en o sobre un medio soporte,

principalmente para evitar perturbaciones mecnicas y

corrientes de conveccin durante la separacin. En algunos
soportes (papel o similares) la muestra queda sobre la
superficie y avanza a lo largo de ella, con escasa friccin,
por lo que el mecanismo principal de separacin es la
magnitud de la carga de cada componente de la muestra.

Otros medios de soporte (geles, medios

semislidos o gelatinosos) estn formados por

polmeros que forman una malla, matriz o red
tridimensional a travs de la cual deben
avanzar las molculas de la muestra, que
queda embebida en el medio de soporte
electrofortico. Como consecuencia, la friccin
es notable y los factores de forma y tamao
adquieren una alta relevancia en la
Medios de baja
Medios de elevada friccin
separacin.
friccin
gel de poliacrilamida
gel de
agarosa+poliacrilami
da

papel
acetato de celulosa

gel de almidn
gel de agarosa

separacin
principalmente por
carga

separacin por carga, tamao y forma

Papel
PapelFiltro
Filtro

Mtodo sencillo y rpido

Se usa para la separacin de

protenas

oligonucletidos

carbohidratos

lpidos

Desventajas
Si el papel es fino, se puede desgarrar con facilidad.
Si el papel es grueso, las bandas se distorsionan.
Se produce interaccin entre las protenas y los grupos

hidroxilos de la celulosa del papel, por lo tanto la migracin se

frena.
Calidad del papel: 90% de celulosa absorcin de agua y
conductividad elctrica.

 Se usa en anlisis de fluidos

biolgicos.

Acetato
Acetatode
decelulosa
celulosa

Tiempo de anlisis corto

Sencillez de la tcnica.

Su aplicacin principales para separar las protenas del

suero, lo que se denomina una proteinograma.
Gran parte de los grupos hidroxil de la celulosa se han
esterificado por acetilacin
no hay interaccin
con las protenas.
Desventaja:
Desventaja:
Su dbil resolucin

Gel
Gel

Son polmeros de red tridimensional

El uso de geles como medio de soporte en electroforesis,

constituye una alternativa para solucionar algunos problemas
asociados con el uso de papel y de acetato de celulosa como
la adsorcin, la difusin y poca resolucin de los compuestos
separados.
Factor que influyen en la migracin de la muestra en los geles:
Resistencia o friccin a este
movimiento

Tamao del poro del gel

Radio de la molcula

Almidn

Geles
Geles

Poliacrilamida

Tcnica barata,
fcil y rpida
Soporte ms usado en
electroforesis.
De alta resolucin
Sus componentes son txicos
Buena resolucin

Agarosa

Separacin de molculas
grandes (virus, cidos
nucleicos, lipoprotenas)

Posicin de soportes

Anlisis cualitativo. (Revelado)

Consiste en identificar, visualizar o localizar, en el

medio de soporte, los componentes del espcimen

separados por electroforesis. Se puede realizar por
medio de colorantes o por mtodos inmunolgicos. Lo
ms frecuente es teir el medio de soporte con una
colorante.

Se pueden emplear sustancias coloreadas o

fluorescentes que se unan a las protenas o los

cidos nucleicos
.En el primer caso suelen ser colorantes orgnicos
que interaccionan con las protenas de forma poco
selectiva, principalmente electrosttica. Ejemplos:
azul brillante de Coomassie, negro amido, rojo
Ponceau.
Para los cidos nucleicos se usa el azul de metileno
o, ms frecuentemente, compuestos fluorescentes
e intercalantes, como el bromuro de etidio.

Tras la electroforesis, el gel se sumerge en un

recipiente con una disolucin del colorante y

se espera a que aqul se impregne y as el
colorante se una a las molculas separadas en
el gel. Tras lavar el gel para eliminar el exceso
de tincin no unida especficamente, se
observa, fotografa o cuantifica mediante
densitometra.

Ensayo enzimtico

Autorradiografia

Tanto protenas como cidos

Si entre las molculas separadas hay una

enzima, se puede detectar aadiendo sus
sustratos (naturales o sintticos) y sus
cofactores, y detectando la aparicin del
producto, generalmente coloreado.

nucleicos pueden marcarse

isotpicamente previamente a la
electroforesis, en cuyo caso la
deteccin se hace mediante
autorradiografa del gel.

Inmunoensayo y Detencin de cidos

nucleicos con sondas
Western

North & Southern

Las molculas con una secuencia

En caso de disponer de ellos, los anticuerpos

permiten la deteccin selectiva del
componente de inters (protena o grupo
marcador unido qumicamente a la protena o
al cido nucleico antes de la electroforesis). La
permeabilidad de los geles para el acceso del
anticuerpo es limitada, por lo que se hace una
transferencia de las molculas separadas en
el gel hacia una membrana de nitrocelulosa o
de nailon, la cual se somete luego a la
disolucin que contiene el anticuerpo.

determinada de nucletidos se
pueden detectar mediante
hibridacin con sondas especficas,
pequeas molculas de
oligonucletidos con la secuencia
complementaria a la buscada y
marcadas con un istopo radiactivo,
un grupo fluorescente, etc. Para
llevar a cabo con xito la hibridacin
se requiere tambin la transferencia
desde el gel a una membrana de
nitrocelulosa o nailon.

Isoelectroenfoque
(Tambin se llama enfoque isoelctrico o IEF, de

isoelectrofocusing). Se trata de una variante de

electroforesis en la que el gel (poliacrilamida) posee un
gradiente de pH fijado en su estructura. Esto se consigue
incluyendo en su preparacin molculas ionizables con
valores de pK diferentes. Como consecuencia, al avanzar
los componentes de la muestra a lo largo del gel se
encuentran en entornos de pH diferente, y eventualmente
alcanzan una regin en la cual el pH es igual al punto
isoelctrico de la molcula muestra y, en consecuencia,
sta detiene su avance. Se alcanza, pues, un equilibrio y se
consigue la separacin de los componentes de la muestra
de acuerdo con su punto isoelctrico, que adems se puede
medir, pues se conoce el gradiente de pH del gel.

Electroforesis Bidimensional
Tras realizar una primera separacin su resultado se somete a otra

de diferente mecanismo en direccin perpendicular. Generalmente

la primera es un isoelectroenfoque en un gel cilndrico. Se
obtienen as mapas complejos de bandas, muy caractersticos de
cada muestra, cuya utilidad principal es la comparacin con el
obtenido de otra muestra similar pero conocida.

Electroforesis de Campo
pulsante
Se emplean geles de agarosa al 1%, pero se altera peridicamente la

orientacin del campo elctrico aplicado, activando alternativamente

dos pares de electrodos. El frecuente cambio de direccin del campo
elctrico consigue que las molculas se desplieguen y avancen a
travs de los poros en conformacin extendida. A mayor tamao, se
reorientan con ms dificultad, por lo que avanzan ms despacio

Aplicaciones
La principal aplicacin en la caracterizacin y anlisis

cuantitativo de molculas biolgicas, principalmente protenas,

pptidos y aminocidos.
Tambin encuentra aplicacin para la separacin de otras
sustancias bioqumicas (insulina, histonas, fibringeno,
lipoprotenas, enzimas).
Aplicaciones de los geles de poliacrilamida en electroforesis
es la separacin de molculas circulares y lineales de DNA.

WESTERN BLOT
Desarrollada en el laboratorio de George

Stark, en Stanford, es una tcnica analtica

que se usa para detectar y cuantificar
protenas especificas en una muestra
determinada, una muestra que por norma
general tiene una gran cantidad de protenas,
unas que nos interesarn, y otras que no.

Cmo se prepara y realiza un

Western Blot, y en que se basa?
Paso 1. Preparacin de la muestra.
Lo primero de todo, como es obvio, es

disponer de una muestra, ya sean muestras

tomadas de un tejido (cerebro de rata, por
ejemplo), o de un cultivo celular directamente.
Debemos asegurarnos que en dicha muestra
tenemos una cantidad de protenas
suficientemente alta como para poder
trabajar.

Paso 2. Cuantificacin de
protenas
Porqu cuantificar protenas? Es muy simple,

cuando ms adelante debamos cargar

protenas, para que los resultados tengan algo
de sentido, tendremos que saber cuanta
protena tenemos, para cargar lo mismo y que
los resultados no dependan de cuanta
protena hemos cargado, si no de las
caractersticas de la protena cargada.

Paso 3. Electroforesis en gel.

La funcin de la electroforesis es separar,

basndose en uno o varios criterios, las

protenas. Estos criterios suelen ser: peso
molecular, punto isoelctrico, y carga
elctrica.

Paso 4. Tincin del gel

Simplemente se coloca el gel, en un (para entendernos),

con un colorante de protenas, el Azul de Coomassie u

otro igualmente vlido, que nos dir, segn la intensidad,
la cantidad de protena existente , o si directamente no
existe protena. El Azul de Coomassie es de tipo aninico
y se une a protenas de forma inespecfica.

Paso 5. Transferencia.
Paso que permite que las protenas sean accesibles a la

deteccin por anticuerpos. Simplemente, los resultados

son mucho mejores, y desde siempre se ha hecho as, se
se transfiere a las protenas desde el gel de poliacrilamida,
a una membrana que, normalmente, es de nitrocelulosa o
PVDF.
TRANSFERENCIA DE DIFUSION Y TRANSFERENCIA DE VACIO
Paso 6. Bloqueo.
Con este paso simplemente se trata de bloquear la unin
de protenas a la membrana, que puedan unirse a esta en
los lugares que hayan quedado libres, posteriormente a la
transferencia

Paso 7. Deteccin.
Se trata de buscar en la membrana una

determinada protena, y por este mismo

motivo se usa un anticuerpo especfico, unido
a una enzima, que si encuentra su sustrato

Paso 8. Anlisis
Simplemente, dependiendo del tipo de anticuerpo secundario

que hayamos usado, lo analizaremos de una determinada

forma.
Anlisis colorimtrico
Considero que el ms sencillo. La deteccin colorimtrica
depende de la incubacin del Western blot con un sustrato
unido al anticuerpo
Anlisisquimioluminiscente
La deteccin quimioluminiscente requieren la incubacin de la
membrana con un sustrato que trae unido el anticuerpo
secundario, que emitir luminiscencia al ser expueto

Paso 9. Resultado
Resultado del Western blot: una membrana

con las protenas separadas en la

electroforesis unidas, de las que slo se
disciernen aquellas contra las se ha aadido
un anticuerpo. Despus de esto podemos
escanearlas y estudiarlas de mil maneras
diferentes.

NORTHERN BLOT

Es una tcnica de deteccin de

molculas decido
ribonucleico(ARN) de una
secuencia dada dentro de una
mezcla compleja .

Procedimiento northern blot

PROCEDIMIENTO
El procedimiento general

comienza con la extraccin del

RNA total de una muestra de
tejido homogenizado.

Los sistemas de capilaridad

inica se utilizan para

transferir el ARN desde un gel
de electroforesis a una
membrana de Northern blot.

Las muestras de ARN son

entonces separadas
porelectroforesis en gel.

Dada la fragilidad de los geles y la

incapacidad de las sondas para

penetrar en la matriz, las
muestras de RNA, separadas por
tamao tras la electroforesis,
sern transferidas a una
membrana de Nailon por medio
de capilaridad o un sistema de
transferencia al vaco.

Despus del marcaje de la

sonda, sta se hibrida con el

RNA en la membrana.

Finalmente, la membrana debe

de lavarse para asegurar que

la sonda se ha unido de forma
especfica y para evitar ruido
de fondo en las seales
emitidas por la misma.

APLICACIONES
El northern Blot permite observar

un patrn particular de expresin

gentica entre tejidos, rganos,
estadios del desarrollo, niveles de
estrs ambiental, infecciones
causadas por patgenos y
durante el curso del tratamiento
de las mismas.

Esta tcnica se ha utilizado para

mostrar la sobreexpresin de
oncogenes y la desregulacin de
genes supresores tumorales en
clulas cancerosas cuando son
comparadas con tejidos
normales.

Los patrones de expresin

obtenidos nos ayudan a conocer

las funciones de los genes. Desde
que el RNA se separ por su
tamao, las sondas contra el
mismo pueden darnos una idea de
su tamao, sugerir ayuste
alternativo, o motivos repetidos en
la secuencia.
La variacin en el tamao del
producto de un gen puede adems
indicarnos delecciones o errores en
el proceso de transcripcin.
Alterando la sonda podemos

conocer la secuencia e incluso

determinar que regin del RNA ha
sido deleccionada.

Southern blot

Edwin Southern
Sir Edwin Mellor Southern.
Naci el 07 de junio 1938

en Burnley , Lancashire y
fue educado en Burnley
Grammar School.
Premiado por la invencin

de la transferencia
Southern.

de

Fue conocido durante muchos aos.

Esta tcnica se implemento por
primera ves en los aos 1950 y 1960
en diversos tipos de estudios de
hibridacin de cidos nucledos.
En la dcada de 1970 se empezaron a
implementar
los
mtodos
de
electroforesis en gel Permiten la
separacin de los fragmentos de ADN
segn su tamao.

etodologa Original Del Southern Bl

Un gel de electroforesis de agarosa, se coloca en un papel de

filtro, se forma una conexin entre el gel y un depsito de
tampn de alta salinidad. La membrana de nitrocelulosa se
coloca en la parte superior del gel y se cubre con una torre de
toallas de papel que se mantienen en su lugar con un peso. la
memoria intermedia pasa a travs del gel y los fragmentos de
ADN se obtienen en la membrana.

Southern Blot

Principio de la tcnica

Pasos de la tcnica

ADN digerido con enzima de restriccin.

Fragmentos son separados por tamaos
Electroforesis en gel.

Mecanismo de accin de la
enzima
Rompe el ADN en la secuencia GGCC.
Corte entre 2 y 3 nucletido. (G y C).
El ADNt conocido como fragmentos de restriccin.
HaeIII corta las cadenas de ADN en la misma localizacin .
La desnaturalizacin caliente ocurre a los 80C despus de 20

minutos.

Electroforesis

Hibridacin

La doble hebra de ADN se forma por

complementariedad SONDA-muestra
Los nucletidos de la sonda est marcados P
32 (radiactivos)

Si al revelar hay marcador radiactivo presente,

est en la muestra analizada la secuencia
complementaria a la sonda Southern Blot

Tipos De Sondas De Hibridacin

Sonda Scorpion
Sonda Molecular Beacon
Sonda TaqMan
Sonda LNA (Locked Nucleic Acid)
Cycling Probe Technology (CPT)

SondasScorpion
Molculas mixtas Contienen un cebador
especfico para el amplicn unido a una horquilla
similar a la sonda del tipo beacon

Posee un elemento complementario al amplicn (Clon molecular).

Conjunto de molculas de ADN idnticas Resultado de PCR.

Los fluorforos se encuentran en la horquilla

Cuando se cierra no se produce emisin de fluorescencia.
Cuando se separan se produce fluorescencia Amplicn
en la horquilla.

Sonda Molecular Beacon

Son oligonucletidos de cadena simple Poseen una zona
deapareamiento
de
basesinternas,
formando
una
horquilla.
En presencia del amplicn la sonda se abre y se unen
Formando una emisin de fluorescencia.
Segn su estructura poseen:
La zona complementaria al amplicn en el giro de
la horquilla.
Complementariedad interna en el cuello.
Fluorforos en extremos: Donador en el 5' y
aceptor en el 3'.

Que son los RFLPs ?

Descubiertos por Sir Alec Jefrreys en 1985.
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism o

polimorfismos en la longitud de los fragmentos de

restriccin.
Son secuencias de nucletidos en DNA reconocidas

y cortadas Por enzimas de restriccin.

En humanos esta puede producir gran numero de

cortes en secuencias especificas.

http://www.youtube.com/watch?v=VmCTsm
hx2_w

http://www.youtube.com/watch?v=NaDGkF1
6Jm8

Aplicaciones de la tcnica
Utilizado para clonacin basada en homologa en base a

secuencia de aminocidos de protena producto del gen

diana.
Se

disean oligonucletidos similares a la secuencia

diana, se sintetizan qumicamente.

Usados para cribar biblioteca de ADN.

Identificacin de sitios metilados en genes particulares.

Diferencias entre los 3 tipos de Blot

Problema 1
En una electroforesis de alto voltaje en papel a

pH=4,0 qu aminocidos de la relacin

siguiente migrarn hacia el nodo y cules hacia
el ctodo?:
Gly (pK1=2.34,pK2=9.60)
Cys (pK1=1.96,pK2=8.18)
Asp (pK1=1.88,pK2=9.60)
Lys (pK1=2.18,pK2=8.95)
His (pK1=1.82,pK2=9.17)

Problema
Se ha determinado la movilidad relativa de la

lactato deshidrogenasa y de varias protenas

patrn en electroforesis en gel de
poliacrilamida al 7,5% en presencia de SDS,
obtenindose los valores de la tabla. Calcule
la masa molecular estimada de la LDH.