AMINOÁCIDOS: CURVAS DE TITULACIÓN Y
SEPARACIÓN POR INTERCAMBIO IÓNICO
Jonathan A. Ortiz F*a; Tatiana Organista T. **a
a
Universidad Nacional de Colombia, Pregrado en Química, Laboratorio de Bioquímica (Ed. 451), av.
carrera 30 No. 45 – 03, Bogotá, Colombia. Fecha de realización de la práctica: 11 de junio de 2019.
Objetivos
Comprobar el carácter anfotérico de los
aminoácidos y determinar los valores de pK de
los grupos ionizables, calcular el punto
isoeléctrico y separar una mezcla de aminoácidos
por cromatografía de intercambio iónico.
➔ Realización de las curvas de titulación
para alanina y glicina.
➔ Realizar separación de una mezcla de
histidina, ácido aspártico y arginina, sobre una
resina de intercambio catiónico.
➔ Seguir la separación, a través de reacción
con ninhidrina, para detectar la presencia de
aminoácidos.
1. INTRODUCCIÓN
La cromatografía de intercambio iónico es un
método de separación de moléculas basado en sus
propiedades de carga eléctrica. [1] Como toda
cromatografía se compone de dos fases: la fase
estacionaria o intercambiador iónico, y la fase
móvil. La fase estacionaria es insoluble y lleva en
la superficie cargas fijas que retienen contraiones
móviles, los cuales pueden intercambiarse por
iones de la fase móvil, la cual suele ser una
disolución acuosa con cantidades moderadas de
algún disolvente orgánico miscible, que contiene
especies iónicas generalmente en forma de
buffer. Los iones de la fase móvil compiten con
los analitos por los sitios activos de la fase
estacionaria.
El principio básico de la cromatografía de
intercambio iónico es que las moléculas cargadas
se adhieren a los intercambiadores de forma
reversible de modo que dichas moléculas pueden
ser asociadas o disociadas cambiando el ambiente
iónico. La separación mediante intercambiadores
iónicos se realiza por lo general, en dos fases: en
la primera las sustancias a separar se unen al
intercambiador utilizando condiciones que
originan una unión fuerte y estable; a
continuación, se eluye de la columna con buffers
de diferentes pH o diferente fuerza iónica,
compitiendo los componentes del buffer con el
material por los sitios de unión.
La mayoría de las proteínas son estables dentro
de un margen de pH determinado, en el que están
cargadas positiva o negativamente. Por lo tanto si
una proteína es estable a valores de pH por
encima del punto isoeléctrico, se debe utilizar un
intercambiador aniónico y si es estable a valores
de pH situados por debajo del punto isoeléctrico,
debe utilizarse un intercambiador catiónico.
Intercambiadores aniónicos son aquellos
portadores de grupos con cargas positivas que
unen aniones de forma reversible. Si el grupo ● Gradiente: Aumentando la concentración
cargado es positivo, es un intercambiador de de la fase móvil, los iones compiten cada
aniones. Los intercambiadores catiónicos son vez más favorablemente con la muestra
portadores de grupos con carga negativa que
por los sitios activos cargados de la fase
unen cationes de modo reversible. Un grupo
típico que se utiliza en los intercambiadores de estacionaria. Es muy importante definir el
cationes es el grupo sulfónico, SO-3. Si se une un gradiente de pH para eluir correctamente
H+ al grupo, se dice que el intercambiador se los compuestos, es decir, que no se
encuentra en forma ácida y puede, por ejemplo, presenten mezclas de estos en las
intercambiar un H+ por un Na+ o dos H+ por un fracciones; se debe manejar un gradiente
Ca+2. El grupo ácido sulfónico es un en el cual solo un aminoácido disminuya
intercambiador de cationes fuertemente ácido.
su interacción por la fase estacionario por
Factores que afectan la retención: cada buffer con el que se eluya.
● Porosidad: El tamaño del poro de la resina
● Tiempo de retención (Tr): En la
al que se une el compuesto móvil por
cromatografía de intercambio iónico la
intercambio iónico influye directamente
retención está basada en la atracción
en la capacidad de unión. En membranas
electrostática entre iones del soluto y la
cuyo tamaño de poro es pequeño no hay
carga complementaria de la fase
espacio suficiente para unir el ión dentro
estacionaria. Los intercambiadores
de dichos poros, por lo que la cantidad de
iónicos favorecen la unión de iones de
intercambiador por unidad de superficie
mayor carga y menor radio. Cuando la
es menor. Sin embargo, en membranas
retención de los compuestos se ve
con tamaño de poro mayor, se puede unir
afectada, cambia la elusión de ellos y por
el compuesto móvil dentro de dichos
consiguiente sus tiempos de retención, al
poros, con lo que se incrementa la
tener una mayor afinidad en la fase
cantidad de intercambiador por unidad de
estacionaria el tiempo de retención
superficie. La porosidad busca una mayor
aumenta, lo cual puede favorecer la
superficie de intercambio.
correcta elusión de los aminoácidos.
● pH: el pH de los buffer eluyentes es
● Reacción con ninhidrina
esencial para tener una correcta
separación de los compuestos, ya que
dependiendo de este, los grupos iónicos
de los aminoácidos, se protonan o
desprotonan lo que genera mayor o menor
afinidad por la resina, y
consecuentemente eluyen en la secuencia
esperada.
● Cargas: Dado que la base del método son
las interacciones electrostáticas, entre más
cargado se encuentre un compuesto, ya
sea negativa o positivamente, aumentará
la fuerza de retención y disminuirá la de
Imagen 1. Reacción presentada en la prueba con
elución (dependiendo de si se trata de una nihidrina.
resina de intercambio aniónico o
catiónico).
A pH entre 4 y 8 la ninhidrina es un oxidante
fuerte y reacciona específicamente con el grupo
alfa-amino de los aminoácidos. Una molécula de
ninhidrina reacciona con el aminoácido, dando
una molécula intermedia que después se
deshidrata y descarboxila para formar un
zwitterion, el cual se hidroliza para formar una
amina, que se condensa con otra molécula de
ninhidrina para formar un producto coloreado
conocido como púrpura de Ruhemann, el cual se
estabiliza por resonancia. La reacción de la
ninhidrina es una reacción útil para establecer la
presencia de aminoácidos y cuantificar los
mismos, sin embargo, no caracteriza los
aminoácidos presentes, ya que reacciona con
todos de igual manera. Debido a sus enlaces
conjugados tiene una absorbancia máxima a
570nm por lo tanto es especialmente útil durante
la cromatografía, pues al realizarse en las
diferentes fracciones recolectadas se puede
obtener un perfil de elución en función de la
absorbancia de las mismas.
2. METODOLOGÍA
Los procedimientos se llevaron a cabo teniendo
en cuenta lo planteado por López & Anzola [4,
pp. 44–45]. Se realizan pequeñas modificaciones
las cuales se irán mostrando a continuación:
Se siguieron dos procedimientos: En el primero
se realizaron titulaciones con ácido (HCl) y base
(NaOH) en concentración 0,1 N para ambos
casos con el fin de establecer curvas de titulación.
Imagen 2. Esquema general de los procedimientos
llevados a cabo.
2.1 Curvas de titulación:
 En un vaso de 100 mL adicionaron 10 mL de
la solución del aminoácido (Alanina o
Glicina) 0.1 M
 Se determinó el pH inicial de la solución.
 Con una bureta se agregó HCl 0.1 N, en
volúmenes de 0.5 mL determinando el pH
después de cada adición.
 Se añadió HCl hasta pH 1.5 Los valores de
pH y volumen de titulante adicionado fueron
registrados.
 Se lavó el electrodo con agua destilada y se
tituló de la misma manera otros 10 mL de la
solución del aminoácido seleccionado,
agregando para este caso NaOH 0,1 M hasta
pH 12.5 registrando el volumen de titulante
añadido y el pH registrado.
 Al final se tituló un aminoácido polar y uno
apolar con HCl y NaOH. (4 experimentos en
total)
 Se determinó pK y pI.
2.2 Separación de aminoácidos por
cromatografía de intercambio iónico:
Alistamiento de la columna para
separación
 En un vaso de 10 mL se suspendieron 10 g de
la resina en HCl 0.1 M, se agitó por varios
minutos para aumentar el contacto del ácido
con la resina y posterior se dejó sedimentar.
 Se descartó el HCl y se realizaron varios
lavados con agua.
 Se suspendió la resina lavada en tres
volúmenes de buffer citrato pH 3.5, se agitó
por varios minutos y se dejó sedimentar.
 Se hace necesario medir el buffer del
sobrenadante, y no dejar de pasar buffer
citrato hasta que este tenga el mismo pH que
el del buffer.
 Se empacó la columna con la resina, se dejó
que el líquido (buffer) bajara hasta quedar
justamente por encima del nivel de la resina.
 Se cierra la llave de la columna y se equilibra
el nivel de la resina, pasando unos 50 mL de
 buffer citrato. No dejar secar la resina, por lo
cual es necesario estar añadiendo buffer de
manera continua hasta culminar el
experimento.
Separación de aminoácidos
 Se añadieron 2 mL de agua destilada a cada
tubo.
 Se realizaron medidas de absorbancia a 570
nm.
 Se prepararon blancos con los respectivos
buffer para cada serie de elución.

 Se abrió la llave de la columna y se dejó que

el líquido llegara al mismo nivel de la resina.
 Se cerró la llave y se aplicó 0.9 mL de la
mezcla de aminoácidos (ácido aspártico,
histidina y lisina). Se deja un tiempo mientras
la mezcla penetra en la columna.
 Se lavaron las paredes de la columna con
pequeñas fracciones de buffer citrato.
 Se cerró la columna y se esperó 10 minutos
aproximadamente a que ocurriera el
intercambio.
 Se eluyó con el mismo buffer, recogiendo 20
fracciones de 2 mL, en tubos de ensayos
pequeños y rotulados.
 Se cerró la columna y se retiró el buffer
citrato que estaba encima de la resina, se
cambió por buffer pH 8.0. Posteriormente se
eluyó con este buffer recogiendo 25
fracciones de 3 mL cada una.
 Se cambió el buffer por buffer fosfatos 11.5 y
se procedió a recoger 20 fracciones de 2 cada
una.
 Con cada fracción se realiza la prueba de
nihidrina como se muestra a continuación.
Prueba de nihidrina
3. RESULTADOS Y CÁLCULOS
3.1Titulación de aminoácidos:
A partir de las regiones donde el pH tiende a
mantenerse constante, se obtiene el valor de pK
experimental. Se obtienen a partir del gráfico. Se
tomó la diferencia entre valores consecutivos de
pH y se evaluó su diferencia elevada al cuadrado.
Los valores más cercanos a cero son los que
tienden a ser más cercanos.
El pK experimental se obtuvo considerando el
promedio de valores de pH de la zona buffer
(pHj), teniendo en cuenta la siguiente ecuación:
n
1
pK i= ∑ ( pH j ) (1)
n j=1
Donde n es el número total de valores de pH en la
zona buffer.
A continuación se muestran los valores obtenidos
a partir de la ecuación 1 y se representan en los
gráficos 1 y 2.

 Se rotularon tubos de ensayos pequeños. Aminoácido Alanina Glicina

 Se tomaron muestra de 0.5 mL de cada pK1 experimental 1,62 1,47
fracción y 0.5 mL de nihidrina, dicha mezcla pK1 reportado 2,34 2,34
es añadida en los tubos previamente pK2 experimental 10,57 10,62

marcados. pK2 reportado 9,69 9,66

 Se calentaron los tubos por 15 minutos en pI experimental 6,12 6,05

pI reportado 6,01 6
baño de maría a ebullición.
 Se retiraron los tubos y se enfriaron a
Tabla 1. Valores de pK determinados a partir de titulación de
temperatura ambiente.
a.a. Se comparan con datos reportados.
Ahora bien, el punto isoeléctrico se determina a Resina AG-50W-XB
partir de la ecuación 2. Tamaño de la columna 7,5cm x 1,3cm
Volumen resina (mL) 10
pK a 1 + pK a 2
pI = (2) Muestra Asp+His+Lys
2 Volumen muestra (mL) 0,9 mL

En las siguientes tablas, se muestran los

resultados para la separación de la mezcla de
aminoácidos (ácido aspártico, histidina y lisina)
en información de los buffer usados para cada
separación.

Tabla 3.Absorbancias a 570 nm de las fracciones

en la primera elución.

 Elución con: Buffer Citrato

 pH 3,5
Gráfica 1. Curva de titulación para la alanina 0.1M  Velocidad del flujo: 1,5 mL/min
(1meq), valorada con NaOH y HCl.

Fracción Abs 570 Fracción Abs 570

No. nm No. nm

1 0,060 11 0,297

2 0,110 12 0,172

3 0,412 13 0,105

4 1,680 14 0,100

5 1,915 15 0,084

6 2,147 16 0,095
Gráfica 2. Curva de titulación para la glicina 0.1M
(1meq), valorada con NaOH y HCl. 7 1,520 17 0,046

3.2 Separación de aminoácidos: 8 0,918 18 0,099

9 0,847 19 0,110
En la tabla 2 se muestran las características de la
columna empleada para la cromatografía de 10 0,453 20 0,880
intercambio iónico y de la mezcla de
aminoácidos empleada.
Tabla 4.Absorbancias a 570 nm de las fracciones
Tabla 2. Características de la columna empleada para la en la segunda elución.
cromatografía.

 Elución con: Buffer Fosfatos

 pH 8
 Velocidad del flujo: 1,5 mL/min
 Fracción Abs 570 Fracción Abs
No. nm No. 570 nm 7 0,190 17 0,099

1 0,949 13 0,613 8 0,163 18 0,057

2 0,919 14 0,525 9 0,140 19 0,026

3 0,502 15 0,410 10 0,110 20 0,015

4 0,447 16 0,280

5 0,662 17 0,125

6 0,721 18 0,117 En la gráfica 3 se muestra el cromatograma de

7 0,893 19 0,109 elución obtenido a partir de los resultados
presentados en la tabla 3.
8 0,925 20 0,090

9 0,987 21 0,050 PERFIL DE ELUCIÓN CROMATOGRÁFICA

1.600
10 1,290 22 0,050
1.400
11 0,863 23 0,038
1.200
12 0,910 24 0,008 1.000
Abs (570nm)

25 0,075 0.800

0.600

0.400
Tabla 5.Absorbancias a 570 nm de las fracciones
0.200
en la tercera elución.
0.000
10 20 30 40 50 60 70
 Elución con: Buffer Fosfatos Fracción
 pH 11
 Velocidad del flujo: 1,5 mL/min
Citrato Fosfato pH 8 Fosfato pH 11

Gráfica 3. Cromatograma de elución de la mezcla de aminoácidos

(Asp, His y Lys) variando el pH de la fase móvil, usando una fase
Fracción Abs Fracción Abs estacionaria de intercambio iónico AG-50W-XB.
No. 570 No. 570 nm
nm 4. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN

1 0,210 11 0,124 Teniendo en cuenta las curvas de titulación

2 1,342 12 0,152 mostradas en los gráficos 1 y 2 se puede observar
que para ambos aminoácidos se presenta un
3 1,011 13 0,114 comportamiento similar al realizar las
titulaciones con ácido y base y esto a su vez se ve
4 0,767 14 0,112
reflejado en los valores de pK y pI obtenidos lo
5 0,470 15 0,095 cual puede estar asociado en un principio a la
similitud de las estructuras de los a.a analizados.
6 0,288 16 0,110
Teniendo en cuenta lo anterior, la presencia de un
grupo R metilo en la alanina, no afecta
significativamente las interacciones
intermoleculares en comparación con la glicina,
al ser tituladas con ácido o base fuertes por lo
cual no existirá gran diferencia entre los
parámetros antes señalados.
Ahora bien, se puede observar teniendo en cuenta
los datos mostrados en la tabla 1, en donde El
punto isoeléctrico determinado en cada caso es
cercano al reportado, debido a que se trata de un
promedio entre las constantes pK del analito.
Es importante mencionar que las zonas de la
curva de titulación donde se determina el pK para
cada aminoácido corresponden al pH al cual la
concentración de la especie protonada y
desprotonada es la misma, y es por esto que en
estos puntos el pH y el pK son iguales o similares
para el caso del experimento llevado a cabo.
Por otro lado Se llevó a cabo la separación
cromatografica de una mezcla de aminoácidos
(ácido aspártico, histidina y lisina) usando
intercambiador aniónico y tres soluciones
amortiguadoras a diferentes pH. (3.5, 8, 11).
Antes de realizar la siembra se verificó que la
columna se encontraba en un pH de 3,5 o
cercano, posteriormente se procedió a hacer la
siembra de 0,9 mL de la mezcla de aminoácidos,
tras esperar 10 minutos se procedió a iniciar la
recolección de las fracciones 20 por cada buffer,
expto el de fosfatos de pH 8, el cual, se tomaron
25 fracciones las cuales una vez recolectadas se
procedió a realizar la prueba de ninhidrina la cual
permitía seguir la elución por medio de
espectroscopia UV y construir el perfil
cromatográfico que se muestra en la gráfica 3,
donde el azul corresponde a la fracción de pH
3,5, la naranja a la fracción de pH 8,0 y la gris a
la fracción de pH 11,5; en esta se puede observar
que de las fracciones del 4 al 7 recolectadas del
buffer 3,5 presentan la mayor absorbancia
indicando que en estas se encuentra el primer
aminoácido, el cual corresponde al ácido
aspártico ya que este tiene un pI de 2,97 (3) por
tanto a un pH de 3,5 tiene carga negativa y es
repelido por la resina, posteriormente tras
recolectar las 20 fracciones se procedió a cambiar
el buffer por uno de pH 8,0 haciendo que el
siguiente aminoácido cambiara su carga, en este
caso la histidina con un pI de 7,58 y eluyera junto
con el buffer, a diferencia del caso anterior, el
número de fracciones en las que se encuentra el
buffer aumenta (fracciones 9-11) lo que hace que
el pico en el perfil se vea más ancho, finalmente
se cambia el pH por última vez para que el último
aminoácido eluya, el pH usado al final fue de
11,5 y el aminoácido eluido fue la lisina con un
pI de 9,74, en el perfil se puede observar que en
las primeras fracciones se encuentra el
aminoácido de interés disminuyendo de forma
paulatina la absorbancia hacia las ultimas
fracciones, donde ya no se encuentra nada.
5. CONCLUSIONES
 Los puntos isoeléctricos determinado por
medio del perfil de titulación para la
alanina y glicina son 6, y 6,0
respectivamente, los cuales son cercanos
a valores reportados para los mismos a.a.
 El orden de elución de la mezcla de
aminoácidos es ácido aspártico, histidina
y lisina y la resolución de los picos
cromatográfico aumenta a medida que
aumenta el número de fracciones.
 Los aminoácidos analizados: alanina y glicina
presentan curvas de titulación y valores de pK
y pI muy cercanos, teniendo en cuenta su
parentesco estructural.
 Se separararon los componentes de una
mezcla de aminoácidos por cromatografía en
columna de intercambio iónico, variando el
pH del eluyente teniendo en cuenta los puntos
isoeléctricos de los aminoácidos en la mezcla,
obteniéndose un cromatograma producto de la
reacción de los aminoácidos separados con
ninhidrina. El orden de elución fue: ácido
aspártico, histidina, lisina.
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aminoacidos-neutros-acidos-basicos.png