Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Ciencias.

Departamento de Química
Laboratorio de Fisicoquímica II. Prof. Marco Fidel Suarez Herrera

Descomposicion enzimatica de peroxido de hidrogeno

Fecha realizacion: 9 Noviembre 2016
Nota 5,0
Juan Camilo Monroy Garzón.1
Estudiante de Química – Universidad Nacional de Colombia. jcmonroyg@unal.edu.co, cod. 25191216
1

Abstract: The decomposition of hidrogen peroxide into water and oxigen was performed with the catalase of two varieties of
potato: criolla and pastusa. With the measurement of the produced oxigen trought time was posibble to obtain data of the
velocity of the enzyme-catalazied reaction at different concentrations of hidrogen peroxide. The data obtained was fitted with
the Michaelis-Menten model of enzime kinetics and it was posible to obtain the two caracteristic parameters of this model:
the max. velocity and the KM constant. It was concluded that the criolla variety has a higher max. velocity and K M constant:
1,4*10-4 mol/s vs 1,23*10-5 mol/s and 2,5 M vs 0,80 M, respectvely.

Introducción: El peróxido de hidrogeno se forma en Vmax y KM son parámetros de la ecuación: la velocidad

organismos aeróbicos como un derivado del radical
superoxido, este se forma a su vez en reacciones donde
interfiere el oxigeno y en las cuales se transfiere de 1
electrón a la vez, la fuente más importante de oxígeno
reactivo en condiciones normales en organismos
aeróbicos es probablemente la pérdida de oxígeno
activado de las mitocondrias durante el funcionamiento
normal de la respiración oxidativa. El gran problema del
peróxido como subproducto es que este reacciona con
metales de transición, tal como en la reacción de Haber-
Weiss [1], liberando el radical oxidrilo, el cual es tan
toxico como el radical superoxido y promueve la
formación de otros radicales dañinos dentro del
organismo. Para mantener bajas las concentraciones de
estos compuestos tóxicos las células poseen dos enzimas:
la superoxido dismutasa y la catalasa, que controlan la
concentración de superoxido y de peróxido de hidrogeno
que se produce continuamente en la célula.
El objetivo del experimento propuesto en este informe
será estudiar cuantitativamente la descomposición
enzimática del peróxido de hidrogeno mediada por la
catalasa, que será extraída de dos tipos de papa: papa
pastusa y papa criolla. También será evaluada la validez
de uno de los modelos mejor conocidos para la cinética
enzimática: el modelo de Michaelis-Menten [2], cuya
derivación matemática puede ser consultada en un sin
número de referencias bibliográficas. El modelo permite
describir la cinética de la reacción catalizada mediante
dos parámetros: la velocidad máxima y la constante KM,
que se obtienen al ajustar los datos obtenidos a la ec. 1,
conocida como la ecuación de Michaelis-Menten.
máxima y la concentración de sustrato en la cual la
velocidad de la reacción es la mitad de la velocidad
máxima, respectivamente.
La ec. 2 corresponde a la reacción de interés. La medida
de la producción de oxigeno al descomponerse el
peróxido permitirá realizar el estudio cinético de la
enzima.
Materiales y métodos: Para la extracción de catalasa a
partir de papa primero se retiro la cascara y luego se corto
la papa en pequeños trozos, que fueron licuados usando
una licuadora y un buffer acuoso de fosfatos pH 7 (cuya
molaridad no superaba 0,01 M con el objetivo de
mantener la fuerza iónica del medio en relativo baja y no
afectar la enzima). Como se propuso comparar la
actividad de dos tipos de papa diferente, se peso la misma
cantidad de papa pelada y se uso la misma cantidad de
buffer para la extracción de catalasa de cada tipo de papa,
en concreto se pesaron aproximadamente 103,0 g de cada
papa y se usaron 30,0 ml del buffer para la extracción. La
solución grumosa resultante se filtro y se recibió en un
vaso de precipitados sumergido en un baño de agua fría,
mientras la enzima no era usada se mantenía en este baño.
El experimento consiste en la cuantificación del oxigeno
producido por la catalasa respecto al tiempo. Para ello se
uso el montaje de la Fig. 1, que permite determinar la
cantidad de oxigeno producido en el reactor A al medir el
desplazamiento de agua en el material volumétrico B.

Ecuación 1: donde v es la velocidad de producción del

producto ( d[P]/dt ), [S] la concentración del sustrato y

Fig. 1. Montaje diseñado para medir la cantidad de
oxigeno producido durante la reacción en el erlenmeyer A
El procedimiento consiste en: 1) agregar en A la solución
de peróxido que corresponda, 2) introducir el tapón con la
jeringa previamente llenada con extracto enzimático en A,
3) con el bulbo C establecer el nivel del agua adecuado
para poder empezar las mediciones, 4) introducir una
alícuota de enzima mediante la jeringa e iniciar
simultáneamente el cronometro, 5) mantener el bulbo a la
misma altura hasta que se haya medido un mililitro de
agua, luego bajar el bulbo una altura correspondiente a un
mililitro y esperar a que el nivel del agua vuelva a llegar a
la marca, hacer esto repetidas veces, cada vez que se haya
desplazado un mililitro de agua medir el tiempo
transcurrido (es ideal usar la función “vuelta” del
cronometro), en el caso que la producción de oxigeno sea
muy rápida se mide cada dos mililitros o incluso cada
cuatro, según sea posible.
El procedimiento descrito se realiza usando siempre la
misma cantidad de solución total (incluyendo la enzima) y
misma cantidad de extracto enzimático en el erlenmeyer
A, de esta manera la concentración de la enzima se
mantiene constante. Se varía la concentración de
peróxido, la concentración máxima trabajada fue de
peróxido al 4%, que correspondía a la concentración
reportada en las botellas de agua oxigenada usadas. La
solución de peróxido se preparaba in situ al agregar una
alícuota del agua oxigenada y completando a 20,0 mL con
agua destilada.
Toxicidad de los reactivos utilizados: El peróxido de
hidrogeno es capaz de actuar como agente reductor u
oxidante. Las disoluciones de peróxido hasta el 6% son
reconocidas como seguras y se usan como agente
microbiano, agente oxidante y blanqueador. Produce
radicales libres que atacan una amplia variedad de
compuestos orgánicos, como lípidos y proteínas, el
contacto directo con la piel puede generar irritaciones en
caso que se tengan pequeñas cortaduras y puede
blanquear la queratina del pelo de manera irreversible. La
ingestión puede provocar ardor en la garganta, dolor en el
pecho y vomito, la formación espontanea de oxigeno en el
esófago o estomago puede ocasionar heridas.
Resultados y análisis de los resultados
Los datos obtenidos experimentalmente corresponden a
mL de oxigeno producido en función del tiempo, en las
Fig. 2 y 3 se pueden ver las graficas obtenidas para la
papa pastusa y la papa criolla, respectivamente. Las
graficas son construidas para mostrar que la velocidad con
la que se produce el oxigeno no es constante y mientras el
sustrato es consumido la velocidad es más lenta, una de
las razones por las que este comportamiento es obtenido
es que a medida que se consume peróxido de hidrogeno la
concentración de este cambia, la ecuación de Micchaelis-
Menten (ec. 1) es válida mientras la concentración del
sustrato sea constante, para poder aplicar la ecuación se
usa el método de velocidades iniciales, pues por un lado
se puede considerar que la concentración de sustrato se ha
mantenido constante (pues muy poco ha sido convertido)
y por otro lado también se asume que el complejo enzima-
sustrato se ha formado y su concentración no cambia,
aproximación conocida como aproximación del estado de
cuasi-equilibrio. Otra observación importante consiste en
los tiempos medidos según cada tipo de papa, claramente
el extracto de papa criolla tenía una actividad mucho más
alta, tan solo comparando los datos correspondientes a la
concentración de peróxido más alta (4% en ambas) vemos
que la papa criolla produce 20ml de O2 en 10 s mientras el
extracto de papa pastusa hubiera necesitado cerca de 100
s, esto repercute directamente en los errores relativos que
se obtendrán para cada parámetro de la ecuación, pues
como se puede ver en las barras de error, el error relativo
es más alto en las determinaciones con papa criolla.
Fig. 2. Producción de oxigeno por descomposición de peróxido de hidrogeno debido a catalasa de papa pastusa a 293.0 K ±
0.5 K y 74.66 kPa (560 mmHg, presión atmosférica de Bogotá). Cada curva representa una concentración de sustrato
diferente: 4%, 3%, 2%, 1% y 0,5% para los datos en negro, cian, rojo, verde y morado respectivamente.

Fig. 3. Producción de oxigeno por descomposición de peróxido de hidrogeno debido a catalasa de papa criolla a 293.0 K ±
0.5 K y 74.66 kPa (560 mmHg, presión atmosférica de Bogotá). Cada curva representa una concentración de sustrato
diferente: 4%, 2%, 1%, 0,5% y 0,2% para los datos en morado, negro, rojo, cian y verde respectivamente.

Se determinan las velocidades iniciales de producción de tiempo, usando solo los primeros datos de cada curva
oxigeno para cada concentración de sustrato y para cada obtenida, que efectivamente siguen una tendencia lineal.
tipo de papa. Las velocidades iniciales se obtienen al Las velocidades obtenidas se encuentran en unidades de
determinar la pendiente de las graficas de ml de O2 vs ml de O2 por unidad de tiempo, están son convertidas a
mol de O2 por unidad de tiempo usando la ley de los gases
ideales y las condiciones de presión y temperatura que se
reportan en las Fig. 2 y 3. Con estos datos se construyen
las graficas de velocidad vs concentración de sustrato, que
se encuentran en la Fig. 4 y Fig. 5, con las cuales es
posible obtener los parámetros de Michaelis-Menten a
partir del ajuste de los datos obtenidos con la ec. 1 y con
la ayuda de la herramienta de cálculo: Solver de Excel. El
error asociado a cada dato es simplemente el error
asociado a la pendiente hallada multiplicada por dos (2σ),
para asegurar una confianza de al menos 95%.

Fig. 4. Datos cinética Michaelis-Menten para la catalasa en papa pastusa a 293.0 K ± 0.5 K y 74.66 kPa. La linea solida
corresponde a la ecuacion de la forma de la ec. 1 cuyos parámetros mejor se ajustan a los datos experimentales.

Fig. 5. Datos cinética Michaelis-Menten para la catalasa en papa criolla a 293.0 K ± 0.5 K y 74.66 kPa. La linea solida
corresponde a la ecuacion de la forma de la ec. 1 cuyos parámetros mejor se ajustan a los datos experimentales.
Se obtuvieron los siguientes parámetros a partir del
modelo de Michaelis-Menten (tabla 1):
Tabla 1. KM y Vel. Max de la catalasa de las variedades
de papa estudiada.
Variedad de Pastusa Criolla
papa
KM 1,23*10-5 mol/s 1,4*10-4 mol/s
-5
Δ KM 0,03*10 mol/s 0,2*10-4 mol/s
Vel. maxima 0,80 M 2,50 M
Δ Vel. maxima 0,01 M 0,08 M
Teniendo en cuenta que la misma cantidad de papa fue
usada para obtener el extracto de catalasa y también la
misma cantidad de buffer pH 7 fue usado para la
extracción, se analiza que la papa criolla en definitiva es
más eficiente para la catálisis de la reacción de
descomposición, esto puede deberse a que la
concentración de catalasa en la papa criolla es mayor o a
que la catalasa de la papa criolla es más eficiente, no es
posible concluir con seguridad cual de las dos razones es
la real, para ello se necesitaría separar la enzima y
cuantificarla, pero se puede argumentar que debido a que
la producción de una enzima requiere de energía,
sabiendo que la constante Km es igual a Kcat.*[E], se
necesitaría 10 veces más catalasa en la papa criolla que en
la papa pastusa y por tanto 10 veces más energía para
producirla, por lo que es más probable que simplemente la
catalasa en la papa criolla es más eficiente.
Se obtuvo en definitiva que la papa criolla cataliza la
reacción con más eficiencia, para racionalizar porque este
tipo de papa requiere tener una actividad de catalasa
mayor que la papa pastusa se debe pensar en las
condiciones a las cuales cada variedad sobrevive. En
concreto, a cuanto oxigeno está expuesta cada una de las
variedades. Se concluye que por el piso térmico en el que
cada papa es cultivada se puede explicar la diferencia en
su actividad, pues la papa criolla se obtiene en alturas
menores, pisos térmicos más calientes, por lo que además
de estar expuesta a una mayor cantidad de oxigeno
además se encuentra a una temperatura mayor.
Conclusión
A partir de la cuantificación del oxigeno producido por el
extracto de catalasa de papa criolla y pastusa fue posible
estudiar la cinética de la descomposición de peróxido
catalizada enzimáticamente. La cinética de la catálisis
enzimática fue estudiada bajo el modelo de Michaelis-
Menten, permitiendo obtener los parámetros
característicos del modelo: la velocidad máxima y la
constante KM, cuyos valores fueron más altos para el
extracto de catalasa obtenido de papa criolla, en concreto:
1,4*10-4 mol/s vs 1,23*10-5 mol/s y 2,5 M vs 0,80 M.
Bibliografía y referencias
[1] The Haber–Weiss reaction and mechanisms of
toxicity. Toxicology. Volume 149, Issue 1, 14 August
2000, Pages 43–50
[2] The Original Michaelis Constant: Translation of the
1913 Michaelis–Menten Paper. Biochemistry, 2011, 50
(39), pp 8264–8269