 CURSO: Microbiología

 DOCENTE: John Víctor López Orbegoso

 PRACTICA: Técnicas de siembra y aislamiento

 ALUMNA: Guevara Campos Jesús María Coraima

 GRUPO: A4 jueves de 2pm a 4pm

 CICLO: IV

 FECHA:

2019
 Técnicas de siembra y Aislamiento
UNIVERSIDAD NACIONAL DE CAJAMARCA
En el manejo de muestras contaminadas o cultivos mixtos en los que se encuentran
diversos microorganismos, el primer paso para proceder a su estudio es el aislamiento, es
decir la separación deFACULTAD
cada uno de los
DEposibles integrantes
CIENCIAS microbianos de la muestra.
AGRARIAS
Existen diversos métodos para conseguir esta separación, la mayoría de ellos basados
en la inmovilización de las células microbianas en la superficie de los medios de cultivo
sólidos. Al depositar ACADEMICO
ESCUELA una célula bacteriana o una levadura en
PROFESIONAL DEun INGENIERIA
punto del medio de
EN
cultivo, ésta quedará inmovilizada en ese punto y en él se reproducirá por absorción de
INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
los nutrientes del medio. Las nuevas células generadas permanecerán igualmente
inmóviles y tras sucesivas generaciones conformarán lo que denominamos una "colonia"
que no es más que un montón de células derivadas de una sola célula madre inicial, es
decir, un clon de la bacteria o levadura depositada al sembrar. Esta colonia es visible al
ojo humano y presenta diferentes características según el microorganismo que la genera.
Esto nos permite distinguir las diferentes poblaciones microbianas que se encuentran en
la muestra sembrada y separarlas transfiriendo una colonia de cada tipo a un nuevo
medio de cultivo estéril, a estos cultivos los consideraremos "puros" por poseer un sólo
tipo de microorganismo. (El fundamento es válido teniendo en cuenta sólo
microorganismos cultivables)

Objetivos

 Distinguir los conceptos de cultivo puro y cultivo mixto.

 Aplicar técnicas de aislamiento para la localización de microorganismos concretos
en muestras contaminadas o con flora mixta.
 Aplicar las técnicas del agotamiento y las estrías escocesas como las más
habituales en aislamiento de microorganismos cultivables.
 Observar la influencia de la temperatura sobre el desarrollo de los
microorganismos.

SIEMBRA Y FORMAS PARA REALIZAR LA TRANSFERENCIA

 CULTIVO EN MEDIO SÓ LIDO

 Tubos con agar inclinado Previo a la siembra y con posterioridad a ésta es

importante pasar la boca del tubo (sin la tapa) por la llama del mechero
(flameado). Esta operación genera corrientes de convección que previenen
que los contaminantes del aire caigan dentro de los recipientes. El
calentamiento puede también matar los microorganismos que se
encuentren en la boca de los recipientes. Para realizar la siembra se puede
utilizar el ansa, realizando un movimiento suave sobre la superficie del agar
en forma de zigzag, desde el fondo hasta la parte superior, cuidando de no
dañar el agar. También se puede utilizar el hilo. En este caso, se realiza la
punción y luego se siembra en la superficie de manera similar a lo
 descripto, pero extremando los cuidados para no romper la superficie.
Luego de la incubación, se observará el aspecto general del medio y la
aparición de crecimiento sobre su superficie. Este tipo de siembra permite
el cultivo de microorganismos aerobios o anaerobios facultativos y además
se utiliza para almacenar cultivos durante cortos períodos de tiempo a
temperaturas de 4ºC, o para la amplificación de un inóculo pequeño.

 Siembra en placas Puede ser en superficie (utilizando espátula de

Drigalski, asa o hisopo) o por mezcla (el inóculo con el medio de cultivo
agarizado aún fundido, a temperatura de unos 45ºC, se mezclan y se vierte
en la placa de Petri, como se explica en detalle más adelante). Las placas
se incuban invertidas, ya que la alta concentración de agua en el medio
puede provocar condensación durante la incubación y si cae sobre la
superficie del agar, se extiende dando un crecimiento confluente. En medio
sólido cada célula viable dará origen a una colonia y por lo tanto la siembra
en placas se puede utilizar, no solo para cultivar microorganismos, sino
además para contar y aislar. En general cuando se quieren tener colonias
aisladas a partir de un material determinado, es necesario diluir la muestra
en tubos con suero fisiológico estéril.

 CULTIVO EN MEDIO SEMISÓLIDO

Se utilizan tubos sin inclinar. Se siembra por picadura o punción utilizando un hilo.
Este tipo de medio contiene una proporción menor de agar que los medios sólidos.
El medio queda inoculado al introducir el hilo en profundidad, pero sin tocar el
fondo del tubo, retirándolo posteriormente por la misma trayectoria utilizada al
realizar la picadura. En medio semisólido se podrá comprobar si el
microorganismo es o no móvil, ya que en el primer caso se observará que el
crecimiento difunde alrededor de la zona donde se hizo la picadura, detectándose
turbidez (ver ejemplo tubo 1 de la figura). Los microorganismos inmóviles crecerán
únicamente a lo largo de la picadura (ver ejemplo tubo 2 de la figura). Una siembra
con ansa o con un cierto movimiento de vaivén podría originar un patrón de
crecimiento que se interpretaría erróneamente como movilidad bacteriana. Este
tipo de siembra en picadura sirve, también, como otro método de conservación de
microorganismos anaerobios facultativos.

 CULTIVO EN MEDIO LÍQUIDO

Habitualmente se realiza en tubos, frascos o erlenmeyers. Antes y después de
realizada la siembra, se debe pasar la boca del recipiente (sin tapa) por la llama
del mechero (flameado). 5 En los cultivos líquidos no tiene lugar la formación de
colonias, por lo tanto, no sirven como técnica de aislamiento. La utilización de
medios de cultivo líquidos permite la obtención de una población microbiana
grande, con un elevado número de microorganismos, para ser utilizados
posteriormente. En estos cultivos se examinará la existencia de enturbiamiento
más o menos intenso, la formación de una película o velo sobre la superficie, la
aparición de sedimento en el fondo del tubo, etc.
Técnicas de aislamiento. 
Se realiza un aislamiento de los microorganismos presentes en un cultivo mixto en caldo
ordinario, sobre agar nutritivo. Se siembran dos placas de agar nutritivo, una mediante la
técnica del agotamiento de asa y otra mediante la de estrías escocesas.
Estas técnicas pretenden diluir la carga microbiana que se deposita sobre el medio de
cultivo de forma que, en los últimos trazos de la siembra, haya tan pocas células que
queden suficientemente separadas unas de otras y puedan desarrollar colonias
independientes.

Agotamiento de asa

Tomar el tubo con el cultivo mixto, agitar para homogeneizar su contenido. Flamear el asa
bacteriológica y tomar una muestra del cultivo. Flamear la boca del tubo tanto al abrirlo
como antes de cerrarlo.
En una placa con agar nutritivo y tocando con suavidad la superficie del medio, extender
la muestra siguiendo el esquema de la figura. El recorrido del asa debe ser lo más largo
posible con el fin de conseguir al final del mismo células aisladas que darán lugar
a colonias.  Al destapar la placa de Petri mantener la tapa en la mano, abriéndola sólo lo
necesario para realizar la siembra. Después de sembrar cerrar la placa y dejar en posición
invertida para llevar a incubar a 37ºC.
Tras 24 horas de incubación podemos observar las colonias formadas por los distintos
tipos de microorganismos del cultivo mixto con sus diferentes características Se observa
una mayor densidad de crecimiento al principio del agotamiento sin poder diferenciar
colonias, sin embargo, al final de éste las colonias están mejor aisladas y se aprecian las
diferencias entre ellas como son el tamaño, color y forma.

Estrías escocesas

El procedimiento es igual al del agotamiento de asa pero la muestra de cultivo se siembra

siguiendo el esquema de la figura. Después de realizar la primera descarga se cierra la
placa y se flamea el asa. Sin cargarla de nuevo, se gira la placa unos 45º y arrastrando
del final de las estrías realizamos la segunda fase de las mismas, se repite el
procedimiento dos veces más hasta la última estría que finaliza con un pequeño
agotamiento en el centro de la superficie del medio de cultivo. La placa se cierra y se
invierte para llevar a incubar a 37ºC.

Tras 24 horas de incubación observamos que en las primeras descargas realizadas con el
asa de siembra hay un crecimiento mayor con pocas colonias diferenciadas, y estas van
disminuyendo en densidad en las siguientes estrías observándose finalmente las colonias
aisladas y apreciándose la diferencia entre ellas.

https://conalepfelixtovar.wordpress.com/2012/09/26/tecnicas-y-metodos-de-aislamiento-y-
seleccion-de-microorganismos/

https://es.slideshare.net/AndresGonzalezDeVivero/practica-n-2-metodos-de-siembra-y-
aislamiento

https://www.fbioyf.unr.edu.ar/evirtual/pluginfile.php/169626/mod_resource/content/1/2019%20
TP2%20BIOQ%20Y%20LCTA.pdf

https://es.wikibooks.org/wiki/Microbiolog%C3%ADa/Obtenci
%C3%B3n_de_cultivos_puros:_siembra_y_aislamiento

https://www.ugr.es/~pomif/pom-bac/pb-iv/pb-iv-2-introduccion.htm