AISLAMIENTO

En la naturaleza, la mayoría de los

microorganismos no se encuentran aislados,
sino integrados en poblaciones mixtas. Para
llevar a cabo el estudio de estos
microorganismos y de sus propiedades, es
necesario separar unos de otros y trabajar con
especies aisladas, obteniendo cul$vos axénicos
o puros
Un cul&vo axénico o puro es aquel que con&ene
un sólo 'po de microorganismo y que procede
generalmente de una sola célula; el crecimiento
de ésta origina, en medio sólido, una masa de
células fácilmente visible que recibe el nombre de
colonia.

Para obtener cul'vos puros a par&r de una

población microbiana mixta, se u&lizan las
denominadas técnicas de aislamiento.
Sembrar o inocular es introducir ar&ficialmente
una porción de muestra (inóculo) en un medio
adecuado, con el fin de iniciar un cul&vo
microbiano, bajo condiciones asép&cas.

La siembra puede realizarse en medio líquido, sólido o

semisólido, u&lizando asa, hilo, o bien hisopo o pipeta
estéril. Se debe esterilizar en la llama (hasta que todo el
filamento se haya puesto al rojo vivo) el asa o el hilo y
enfriar, antes y después de realizada la siembra
Para realizar la siembra se puede u.lizar
el ansa, realizando un movimiento suave
sobre la superficie del agar en forma de
zigzag, desde el fondo hasta la parte
superior, cuidando de no dañar el agar.
También se puede u.lizar el hilo. En este
caso, se realiza la punción y luego se
siembra en la superficie de manera similar
Siembra en tubo
a lo descripto, pero extremando los
cuidados para no romper la superficie
inclinado
 Siembra en caja petri

Puede ser en superficie (u&lizando

espátula de Drigalski, ansa o hisopo) o
por mezcla (el inóculo con el medio de
cul&vo agarizado aún fundido, a
temperatura de unos 45oC, se mezclan
y se vierte en la placa de Petri.
 Iden1ficacion de morfologia de la colonia

Al cul&var un microorganismo en un
medio de agar determinado en una
placa de Petri, este desarrolla un
aspecto dis&n&vo. Es lo que se conoce
como morfología bruta, y engloba la
forma de la colonia, el tamaño, el
color y las caracterís&cas de la
superficie
 CULTIVO EN MEDIO
LIQUIDO

En los cul&vos líquidos no &ene lugar la

formación de colonias, por lo tanto, no sirven
como técnica de aislamiento. La u&lización de
medios de cul&vo líquidos permite la obtención
de una población microbiana grande, con un
elevado número de microorganismos, para ser
u&lizados posteriormente. En estos cul&vos se
examinará la existencia de enturbiamiento más
o menos intenso, la formación de una película o
velo sobre la superficie, la aparición de
sedimento en el fondo del tubo, etc
 TÉCNICAS DE AISLAMIENTO

En hábitats naturales raramente encontramos un solo >po de

microorganismo en una muestra, por lo tanto, es necesario
hacer algún procedimiento de aislamiento para separar e
iden>ficar los dis>ntos >pos de microorganismos presentes.

El obje.vo del aislamiento es obtener

Aislar es separar un .po de
colonias bien separadas (las colonias se
microorganismo a par.r de una
forman a par.r de una sola “unidad
población heterogénea de
formadora de colonias”) de las que se
micoorganismos
conseguirá un cul$vo puro

Una vez obtenidos los cul.vos puros se

Hay que tener en cuenta que siempre
podrán estudiar las caracterís.cas
el aislamiento se da en un medio
macroscópicas, microscópicas,
sólido. El medio líquido sirve para
fisiológicas, etc. de un microorganismo
enriquecer, pero no para aislar.
en par.cular
 Se lleva a cabo un
procedimiento que involucra
El aislamiento se puede Cuando el microorganismo
una primera etapa de
lograr directamente a par.r que se desea aislar e
aumento del número de
de una muestra cuando el o iden.ficar se encuentra en
microorganismos del .po
los microorganismos están baja proporción en la
que se desea aislar en
en una proporción muestra, o interesa un solo
relación al resto de la
adecuada. .po de microorganismo
población
(enriquecimiento).

Luego se aísla por el método de estrías o

por dilución y se iden6fica.
TÉCNICAS DE SEMBRADO
Para aislar se u>liza alguno de los siguientes procedimientos:

A) Métodos generales
1) Por diseminación en superficie (agotamiento de ansa,
depósito y posterior quemado y dilución)
2) Por mezcla.
B) Métodos especiales
(calentamiento, agregado de álcali o ácido, por temperatura de
incubación, cambios en el pH y presencia de sales o
colorantes). Estos métodos sirven cuando se desea aislar un
microorganismo que posea una caracterís>ca especial
(resistente al calor, anaerobio, etc)
METÓDOS GENERALES
Por diseminación en la superficie de un medio sólido en placa de Petri

Es la técnica más u&lizada. Con un ansa de siembra, calentada al rojo vivo en el

mechero y enfriada cerca del mismo, se toma una muestra del cul&vo de
microorganismos y se ex&ende sobre la superficie de la placa con el medio
agarizado, pero sin hacer presión para no dañar el agar.

Se lleva la placa a incubar a la temperatura adecuada, siempre en posición inver&da

lo que evitará que el agua de condensación se deposite sobre la superficie del
medio, dificultando la obtención de colonias aisladas.

Mediante estas técnicas se ob&enen colonias aisladas a par&r de una muestra que
contenga un elevado número de bacterias.
Existen dis1ntos 1pos de trazados tendientes a lograr
una
buena separación entre los gérmenes sembrados, Se
puede sembrar por:
I. Agotamiento de asa: Se flamea el ansa, se enfría y
después de rozar la siembra realizada previamente, se
realizan estrías en dos placas en forma consecu&va sin
recargar el ansa.
II. Depósito y posterior quemado: Se carga el ansa con la muestra y las estrías se ex&enden sobre un
área pequeña de la superficie de la placa. Se re&ra el ansa, se quema a la llama, y luego de enfriarla en
el interior de la placa se hacen nuevas estrías por otra zona tocando ligeramente la muestra sembrada
anteriormente. Este proceso puede repe&rse sucesivamente, flameando y enfriando el ansa al
comienzo de las sucesivas siembras en estría, de acuerdo a la carga inicial de microorganismos. Tras la
incubación, se observarán las colonias aisladas en alguna región de la placa inoculada, donde se puede
estudiar la morfología colonial.
III. Dilución previa en solución fisiológica o
caldo: Se toma la muestra para aislar y se la
resuspende en solución fisiológica o caldo
nutri>vo, preparando luego diluciones seriadas
decimales en condiciones asép>cas. Se toman
las diluciones y se estría con ellas una placa
para cada una. En la dilución adecuada se
obtendrán colonias aisladas.
IV. Extensión en superficie con espátula de
Drigalski: Aquí también pueden
prepararse diluciones decimales. Se
deposita sobre la superficie de la placa una
gota ó 0,1 ml de una determinada dilución
del cul>vo de microorganismos y se
ex>ende con ayuda de la espátula,
previamente esterilizada por flameado, en
todas las direcciones hasta que esté
completamente seco.
Tras el período de incubación las
colonias aparecen sobre la superficie,
distribuidas uniformemente si la
siembra se ha realizado de forma
correcta. Podrán diferenciarse las
colonias de acuerdo a su tamaño,
forma, color, textura, etc. Esta técnica
de siembra, además de permi>r el
aislamiento de colonias, permite el
recuento de bacterias viables en la
muestra, si conocemos exactamente el
volumen de muestra sembrado.
 Esta técnica &ene la ventaja de permi&r el cálculo del número de
bacterias presentes en la muestra, si se trabaja con exac&tud. Se
realizan diluciones seriadas de la muestra y se coloca en tubos
estériles, por separado, el mismo volumen de cada una.
POR MEZCLA
Luego se vierte en el tubo, medio de cul&vo fundido y atemperado
aproximadamente a 45oC. El contenido se homogeneiza por rotación,
y luego se lo vierte sobre la superficie de una placa de Petri.

Tras la homogeneización, se dejan enfriar las placas hasta que se

solidifique el medio y posteriormente se incuban a la temperatura
adecuada (siempre en posición inver&da).
Otra variación de esta técnica consiste en depositar en una
placa de Petri vacía un pequeño volumen conocido de muestra
y a con.nuación añadir el medio de cul.vo fundido y
atemperado, mezclando por rotación suave de la placa. De esta
forma los microorganismos se distribuirán homogéneamente
en el medio de cul.vo, permi.endo el desarrollo de colonias
separadas por todo el agar.

Las colonias aparecen distribuidas por toda la masa del agar. Aquellas que están en la superficie tendrán
dis&ntas caracterís&cas, dependiendo del &po microbiano, mientras que las colonias que se desarrollan
en el interior, bajo la superficie del agar, &enen forma len&cular, aunque los microorganismos que formen
las dis&ntas colonias sean de dis&nto &po. Por tanto, las colonias que aparecen en la profundidad del agar
son siempre biconvexas y no se diferencian unas de otras por su morfología. Aunque con esta técnica se
ob&enen colonias aisladas, generalmente sólo se u&liza para determinar el número de microorganismos
viables en una muestra, cuando éstos son anaerobios faculta&vos o microaerófilos.
 CONSERVACIÓN DE
CEPAS

Los tres obje&vos que hay que alcanzar para conservar

correctamente las cepas microbianas en los laboratorios
de microbiología son: que el cul&vo a conservar sea puro,
evitando que se produzcan contaminaciones durante el
proceso de conservación; que durante el &empo de
conserva- ción sobrevivan al menos el 70-80% de las
células, y por úl&mo, que estas células permanezcan
gené&camente estables.
 1. MÉTODOS DE
LARGO PLAZO
Son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento de las células microbianas, pero éstas
no han muerto. Así se garan&za al máximo la estabilidad gené&ca, por evitarse la aparición de
generaciones sucesivas. Aún así no se puede descartar algún cambio originado por el método
pre- paratorio en si mismo.

1. CONSERVACIÓN POR CONGELACIÓN:

Se congelan las células en suspensión en un líquido con un
agente crioprotector y se guardan a temperaturas inferiores a
cero grados cenRgrados, con lo que el agua se congela. De esta
forma, al no disponer las células de agua en forma líquida, no
hay crecimiento.
2. EDAD DE CÉLULAS.
En la mayoría de los casos conviene u&lizar células
maduras del inicio de la fase estacionaria de la curva de
creci- miento, pero cuando se trate de organismos que
presenten en su ciclo vital algún estado que les prepare
para la resistencia a condiciones adver- sas, es preferible
alcanzar este estado.

3. VELOCIDAD DE EN LA CONGELACIÓN Y DESCONGELACIÓN.

Aunque hay programas de congelación bien estandarizados
para determinados casos o circunstancias, en general es
mejor que las variaciones de la temperatura sean rápidas,
tanto para la congelación como para la descongelación, por lo
que para descongelar conviene poner las células a 37oC.
4. TEMPERATURA DE ALMACENAMIENTO.
Debe ser lo más baja posible. Lo mejor es guardar tubos
cerrados o sellados, que contengan las células
microbianas, sumergidos en nitrógeno líquido, que &ene
una temperatura de –195oC, o bien en la fase gaseosa del
nitrógeno líquido, con una temperatura de –140oC

5. EMPLEO DE AGENTES CRIOPROTECTORES.

Estas sustancias protegen del daño que se pueda producir en las
células microbianas en el momen- to de la congelación. Existen
muchos compuestos que se pueden u&lizar como crioprotectores,
pero el que se u&liza con más frecuencia es el glicerol, a una
concentración del 15 al 20%. También se pueden u&lizar el
dime&lsulfóxido, la leche des- cremada y carbohidratos como
glucosa, lactosa, sacarosa, inositol, etc. En su elección influye el &po
de microorganismo que se quiera conservar.
 2. POR LIOFILIZACIÓN
Tampoco se da crecimiento en las células conservadas por este método, puesto que se les ha quitado el agua mediante
la liofilización, que es un proceso suave. Con ello la estabilidad gené.ca es alta, pero a veces no tanto como en la
congelación, porque la liofilización se consigue por sublimación del hielo de las células. Por lo tanto, primero tenemos
que congelar el agua libre de las células y después eliminarla mediante el vacío, sin que haya necesidad de subir la
temperatura, lo que acabaría afectando a la viabilidad del microorga- nismo.
 EFICACIA EN LA
LIOFILIZACIÓN
Tipo de microorganismo. Hay algunos microbios que no resisten la liofilización y
lógicamente serán aquellos que contengan más agua en su interior. Algunos hongos
filamentosos, especialmente los no esporulados, no se pueden guar- dar liofilizados y
hay que recurrir a otros métodos.

Concentración celular. Lo mejor es liofilizar suspensiones celulares con

una concentración del orden de 108-109 células/ml en el caso de las
bacterias y algo inferior en el caso de hongos filamentosos y levaduras.

Temperatura durante la sublimación. Debe ser lo más baja posible, sin subir
por encima de –50oC.
Grado de deshidratación alcanzado. Debe ser lo más alto posible, aunque la concen-
tración de solutos puede conllevar una pequeña can.dad de agua remanente que no
es perjudicial.

Atmósfera del tubo. Las células liofili- zadas se guardan en tubos

cerrados al vacío para evitar, tanto la rehidratación como la presencia de
algún gas dentro del tubo, como el oxígeno que puede dañar a las
células.

Condiciones de almacenamiento. La temperatura debe ser constante,

preferentemente a 18oC y sin bajar de los 0oC. Los liófilos se deben guardar
en la oscuridad.