Técnicas de Aislamiento y Recuento

Fundamento

En el manejo de muestras contaminadas o cultivos mixtos en los que se encuentran

diversos microorganismos, el primer paso para proceder a su estudio es el aislamiento, es
decir la separación de cada uno de los posibles integrantes microbianos de la muestra.

Existen diversos métodos para conseguir esta separación, la mayoría de ellos basados en
la inmovilización de las células microbianas en la superficie de los medios de cultivo
sólidos. Al depositar una célula bacteriana o una levadura en un punto del medio de
cultivo, ésta quedará inmovilizada en ese punto y en él se reproducirá por absorción de los
nutrientes del medio. Las nuevas células generadas permanecerán igualmente inmóviles y
tras sucesivas generaciones conformarán lo que denominamos una «colonia» que no es
más que un montón de células derivadas de una sola célula madre inicial, es decir, un clon
de la bacteria o levadura depositada al sembrar. Esta colonia es visible al ojo humano y
presenta diferentes características según el microorganismo que la genera. Esto nos
permite distinguir las diferentes poblaciones microbianas que se encuentran en la muestra
sembrada y separarlas transfiriendo una colonia de cada tipo a un nuevo medio de cultivo
estéril, a estos cultivos los consideraremos «puros» por poseer un sólo tipo de
microorganismo. (El fundamento es válido teniendo en cuenta sólo microorganismos
cultivables).

Objetivos

1. Distinguir los conceptos de cultivo puro y cultivo mixto.

2. Aplicar técnicas de aislamiento para la localización de microorganismos
concretos en muestras contaminadas o con flora mixta.
3. Aplicar las técnicas del agotamiento y las estrías escocesas como las más
habituales en aislamiento de microorganismos cultivables.
4. Observar la influencia de la temperatura sobre el desarrollo de los
microorganismos.

Realización práctica

Técnicas de aislamiento. Se realiza un aislamiento de los microorganismos presentes en

un cultivo mixto en caldo ordinario, sobre agar nutritivo. Se siembran dos placas de agar
nutritivo, una mediante la técnica del agotamiento de asa y otra mediante la de estrías
escocesas y en cuadrante.

Estas técnicas pretenden diluir la carga microbiana que se deposita sobre el medio de
cultivo de forma que, en los últimos trazos de la siembra, haya tan pocas células que
queden suficientemente separadas unas de otras y puedan desarrollar colonias
independientes.
Técnica de aislamiento y recuento: el banco de diluciones. Se realizan una serie de
diluciones seriadas a partir del cultivo mixto Con esta técnica conseguimos además de
aislar colonias, obtener un recuento del número de bacterias que tenemos en el cultivo.

Agotamiento de asa

Tomar el tubo con el cultivo mixto, agitar para homogeneizar su contenido. Flamear el asa
bacteriológica y tomar una muestra del cultivo. Flamear la boca del tubo tanto al abrirlo
como antes de cerrarlo.

En una placa con agar nutritivo y tocando con suavidad la superficie del medio, extender la
muestra siguiendo el esquema de la figura. El recorrido del asa debe ser lo más largo
posible con el fin de conseguir al final del mismo células aisladas que darán lugar a
colonias. Al destapar la placa de Petri mantener la tapa en la mano, abriéndola sólo lo
necesario para realizar la siembra. Después de sembrar cerrar la placa y dejar en posición
invertida para llevar a incubar a 37ºC.
 Tras 24 horas de incubación podemos observar las colonias formadas por los distintos
tipos de microorganismos del cultivo mixto con sus diferentes características Se observa
una mayor densidad de crecimiento al principio del agotamiento sin poder diferenciar
colonias, sin embargo, al final de éste las colonias están mejor aisladas y se aprecian las
diferencias entre ellas como son el tamaño, color y forma.

Crecimiento de colonias bacterianas mediante la técnica del agotamiento de asa

ESTRÍAS ESCOCESAS

Técnica de las estrías escocesas

El procedimiento es igual al del agotamiento de asa pero la muestra de cultivo se siembra

siguiendo el esquema de la figura. Después de realizar la primera descarga se cierra la
placa y se flamea el asa. Sin cargarla de nuevo, se gira la placa unos 45º y arrastrando del
final de las estrías realizamos la segunda fase de las mismas, se repite el procedimiento
dos veces más hasta la última estría que finaliza con un pequeño agotamiento en el centro
de la superficie del medio de cultivo. La placa se cierra y se invierte para llevar a incubar a
37ºC.
Siembra en estrías escocesas Siembra en cuadrante
Tras 24 horas de incubación observamos que en las primeras descargas realizadas con el
asa de siembra hay un crecimiento mayor con pocas colonias diferenciadas, y estas van
disminuyendo en densidad en las siguientes estrías observándose finalmente las colonias
aisladas y apreciándose la diferencia entre ellas.

Crecimiento de colonias bacterianas mediante la técnica

de estrías escocesas

BANCO DE DILUCIONES

Técnica de aislamiento y recuento: Banco de diluciones

Esta técnica nos permite un doble objetivo, el aislamiento de colonias y además el

recuento de los microorganismos que tenemos en el cultivo inicial.

Se trabaja con cinco tubos con suero fisiológico estéril, uno de ellos con 10 ml y el resto
con 9 ml, en el orden que se muestra en la figura. Mediante una pipeta estéril tomar 1 ml
del cultivo mixto y depositarlo en el primer tubo. Agitar hasta conseguir una suspensión
homogénea. Tomar otra pipeta estéril y de este primer tubo transferir 0,1 ml al segundo
tubo, agitar y repetir la operación transfiriendo 1ml del segundo al tercer tubo, del tercero
al cuarto y del cuarto al quinto.
Una vez realizado el banco de diluciones procederemos a sembrar de los tres últimos
tubos (diluciones 104, 105 y 106) 0,1 ml en placas de agar nutritivo, mediante la técnica de
siembra por extensión (ver video). Se depositan los 100 microlitros en la superficie del agar
y se debe extender la muestra en toda la superficie del mismo, utilizando para ello el asa
de vidrio.

Para esterilizar el asa de vidrio, en primer lugar se introduce en alcohol y se flamea

encendiéndola con la llama del mechero bunsen. Dejar que se consuma la llama y
abriendo la placa lo justo para introducir el asa, extender la muestra arrastrándola con

la base del triángulo por toda la superficie del medio hasta que éste absorba toda el agua.
Incubar a 37ºC durante 24 horas y realizar el recuento de las colonias calculando la
concentración de células en el tubo inicial mediante la fórmula:

ufc / ml = N x D x 10

Donde:

ufc = unidades formadoras de colonias

D = dilución
N = nº de colonias
Ejemplo de resultados tras la realización de un banco de diluciones

Recuento del número de colonias en las placas sembradas con las diluciones 104, 105 y
106, (para facilitar el recuento se utiliza un rotulador de vidrio punteando una a una cada
colonia)