PRÁCTICA Nº3.

TINCIÓN DE ENDOSPORAS, CÁPSULA Y

RESUMEN
Las diversas técnicas de coloración se emplean para distinguir entre diferentes tipos de
células o para revelar la presencia de determinados constituyentes de la misma, como lo son
las esporas o las cápsulas. La práctica se realizó con el objetivo de facilitar la observación de
las estructuras bacterianas a través de las técnicas de coloración. Se pudieron observar los
resultados de las tinciones esporas en el cultivo de bacterias ​Klebsiella pneumoniae ​al que se
le aplicó el método de tinción de Anthony ​y cápsulas en el cultivo bacteriano de ​Bacillus
cereus al que se le aplicó la tinción de Wirtz Conklin. Además, se llevó a cabo una prueba de
motilidad en la bacteria ​Proteus debido a la presencia de flagelos. Se concluye que las
bacterias tienen diferentes características y esto lleva a encontrar diferentes métodos para
conocer estas características propias de cada microorganismo.

Palabras clave:​ Tinción, Cápsula, Espora, Estructura, Flagelos, Motilidad, Esporulación.

INTRODUCCIÓN
Aunque los microorganismos vivos se pueden observar directamente en fresco al microscopio
óptico, ​el tamaño y la estructura de la mayoría de las células bacterianas resultan difíciles de
visualizar debido a la carencia de contraste en la misma y el medio que la rodea, la mayoría
de las veces es necesario teñirlas por medio del uso de colorantes y por ello se utilizan las
técnicas de coloración que permiten la identificación de la bacteria y sus estructuras
morfológicas internas y externas
https://www.researchgate.net/publication/281102865_Las_tinciones_basicas_en_el_laborator
io_de_microbiologia​, entre estas se encuentran las tinciones especiales ya que son métodos
sencillos que ayudan a mejorar la imagen observada incrementando el contraste entre la
celula y el medio, además, cumplen la función de detectar ciertos componentes de la bacteria
como son: cápsulas, esporas y flagelos.
https://books.google.com.co/books?id=OaSu2eowg_wC&pg=PA23&dq=tinciones+de+capsu
la&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwjtiruM8MTjAhXQuVkKHeMED58Q6AEIOTAD#v=onepa
ge&q=tinciones%20de%20capsula&f=false

OBJETIVOS GENERALES
Facilitar la observación de las estructuras bacterianas a través de las técnicas de coloración
Mostrar la importancia de las técnicas de tinción, para la diferenciación, observación y
clasificación de estructuras bacterianas.
 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Conocer la coloración de cápsulas mediante método de Anthony y tinción de endosporas
mediante el método de verde de malaquita o también conocido como tinción de Wirtz
Conklin y realizar la prueba de motilidad en microorganismos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Inicialmente, se realizó la coloración de cápsulas formadas en el cultivo de ​Klebsiella

empleando el método de Anthony. Primeramente, se preparó un extendido uniforme con un
portaobjetos en ángulo recto y se coloreo con una solución de cristal violeta al 1% durante 2
minutos, seguidamente, se lavó con solución de sulfato de cobre al 20% y se dejó secar al
aire en posición vertical para luego observar al microscopio.
Continuando con la práctica, en la coloración de esporas se usó una colonia ​Bacillus cereus​,
se preparó un extendido de la colonia y se dejó secar, seguidamente se cubrió la lámina con
una tira de papel filtro y se le agrego verde de malaquita al 5%, se calentó durante 6 minutos,
agregando constantemente verde de malaquita, pasado el tiempo se enjuago con agua
destilada, posteriormente, se contra colorea la lámina con safranina al 0,5% por 1 minuto, se
lavó con agua destilada y se dejó secar para observar al microscopio.
Finalmente, al realizar la prueba de motilidad se colocó una gota de agua sobre la lámina
portaobjetos y con un asa esterilizada se tomó un poco de muestra de cultivo de ​Proteus,
realizando el extendido, luego agregando un cubreobjetos y se llevó al microscopio para
observar el movimiento de esta bacteria.

RESULTADOS

En primera instancia, se observa el cultivo de bacterias ​Klebsiella pneumoniae ​Figura 1​, ​en
donde se realizó la tinción por el método de Anthony, esta tinción se considera negativa
debido a que se observa un contraste en las muestras, ya que la cápsula aparece sin colorear
esta se puede evidenciar como el halo morado del cual rodea a la bacteria que están teñidas de
violeta intenso.
 Figura 1​. Tinción de cápsulas de las bacterias de ​Klebsiella pneumoniae​.

En la Figura 2, se observa la coloración de esporas , el cual se empleó el método de tinción de

verde de malaquita o también conocido como la tinción de Wirtz Conklin, al observar bajo el
microscopio se denotan las esporas como esférulas verdes y el citoplasma teñido de fucsia,
también se puede decir que según la ubicación de las esporas estas se encuentran en los
terminales del citoplasma de la bacteria.

Figura 2. ​Tinción de esporas de ​Bacillus cereus

Por último, se realizó la prueba de motilidad para las bacterias ​Proteus ​, al observar al
miicroscopio los flagelos de esta bacteria son muy poco visibles debido a que no se realizó
ninguna tinción, sin embargo estas bacterias se podían denotar debido a la turbulencia del
agua destilada producida por el movimiento de estas.
 Figura 3. ​Prueba de motilidad de bacterias ​Proteus

DISCUSIÓN

Sobre las paredes celulares de muchas bacterias se desarrolla una sustancia llamada
glicocálix, es sustancia que rodea la pared de la célula, también llamada cápsula, a pesar que
estas no son vitales para las bacterias, disponer de una cápsula hace que algunas bacterias
patógenas sean resistentes a la fagocitosis e incrementa su virulencia
http://www.elementos.buap.mx/num94/pdf/35.pdf​.[1] Estas capsulas se componen de
polisacáridos y se pueden desempeñar como barrera de permeabilidad o pueden evitar la
desecación o la fagocitosis, de la misma manera pueden bloquear la infección de
bacteriófagos y promover la adhesión bacteriana a superficies, entre otras funciones.[2]
http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/MorfologiayEstructuraBacteriana.pdf

La tinción de cápsulas es más difícil que otras tinciones porque los materiales capsulares son
solubles en agua y pueden ser removidos durante el lavado, por ello es necesario usar sulfato
de cobre al 20% para lavar la bacteria y poder diferenciar la cápsula como se ve en la Figura
1. La cápsula polisacárida de ​Klebsiella previene la fagocitosis y permite que la bacteria se
adhiera al tracto respiratorio y lo colonice.[3]

Las endosporas se forman por la esporulación que hace referencia a la formación de la

endosporas dentro de la bacteria, esta contiene ADN, ribosomas, entre otros; que se rodean de
varias capas protectoras. La razón por la que se forman las endosporas es que estas son una
estructura de resistencia que presenta la bacteria ​(Bacillus cereus) ​ya que cuando estas son
liberadas al ambiente pueden sobrevivir en condiciones adversas y factores como: falta de
nutrientes, altas temperaturas, desecación, agentes químicos
https://books.google.com.co/books?id=Nxb3iETuwpIC&pg=PA97&lpg=PA97&dq=formaci
on+de+endosporas&source=bl&ots=za2mpK4ZpB&sig=ACfU3U2nh1LsxMylsW-tyifM12q
n_Nm84g&hl=es&sa=X&ved=2ahUKEwj_vePy277jAhVDpFkKHcOOCYU4ChDoATAJeg
QIBxAB#v=onepage&q=formacion%20de%20endosporas&f=false​. En cuanto a la ubicación
de las endosporas, se puede observar en la Figura 2 que puede ser distinta dentro de la
bacteria, debido a que durante la esporulación es posible que las esporas se forman en
diferentes partes de la bacteria (central, terminal y subterminal), y cuando se observan
aisladas posiblemente se debe a que la bacteria no resistió alguno de los factores
mencionados anteriormente (Villanueva, 1996). De acuerdo a los resultados obtenidos en la
coloración de esporas, se puede observar por medio del microscopio, las endosporas teñidas
de color verde debido al verde malaquita y el citoplasma de color rojo debido a la safranina,
de acuerdo a la ubicación de la endospora estas se encontraron mayoritariamente en los
terminales del citoplasma.

Las bacterias poseen apéndices celulares como los flagelos que permiten la movilidad de las
bacterias, cuando se mueven en dirección opuesta a un punto determinado se denomina
tactismo. Las células bacterianas pueden alterar la velocidad y la dirección de rotación de los
flagelos y estos son capaces de tener varios patrones de motilidad, la habilidad de un
organismo de moverse por sí mismo. Cuando el organismo se mueve en una dirección por un
tiempo se llama natación, la natación es interrumpida por cambios periódicos en una
dirección llamada tambaleó, luego la natación continua. El tambaleo se ve afectado por una
rotación flagelar reversa. Proteus, es una bacteria que tiene muchos flagelos, entonces puede
nadar y mostrar rápidos movimientos como olas, en un medio de cultivo, también se
caracteriza por moverse hacia afuera en las esquinas de la colonia y luego revertirse a las
células sin flagelos y reducir la motilidad. Periódicamente nuevas generaciones de Proteus se
desarrollan y el proceso se repite. Esta bacteria está implicada en varias infecciones del tracto
urinario y en heridas (Tortora,
2010).​https://books.google.com.co/books?id=Nxb3iETuwpIC&pg=PA324&lpg=PA324&dq
=flagelos+en+proteus&source=bl&ots=za2mpM7Viy&sig=ACfU3U08zDPzYNgUVcH7JV
G_urcdiqj1OA&hl=es&sa=X&ved=2ahUKEwj9-6jor7_jAhXQuVkKHSncAzw4ChDoATA
EegQIChAB#v=onepage&q=flagelos%20en%20proteus&f=false

CONCLUSIONES
Las bacterias tienen diferentes características y esto lleva a encontrar varios métodos para
conocer estas características propias de cada microorganismo.
Por medio de la tinción de esporas, el cual requirió del calor durante aproximadamente 7 min
para la penetración; se pudo observar la estructura interna de la célula bacteriana,
particularmente las endosporas y con esto darnos cuenta de que los microorganismos tienen
la capacidad de adaptarse para sobrevivir a diferentes condiciones.

Se logró visualizar las esporas de ​Bacillus cereus ​aplicando la tinción de verde malaquita,
para esta técnica se necesito del calor para que el colorante penetra la célula y teñir la espora.
El colorante primario utilizado no destiñe al ser lavado la placa debido a la composición de la
membrana de la espora, se determinó que la espora es un método por el cual el
microorganismo lo emplea, para sobrevivir largas cantidades de tiempo entrado en un estado
latente hasta que los medios sean adecuados para su esporulación.

ANEXOS
1. Investigue otro método de coloración de cápsulas y explíquelo.

Tinción con tinta china: ​En este método se emplea tinta china (suspensión de de partículas
de carbón) o nigrosina (colorante negro insoluble en agua), que constituyen una suspensión
coloidal, que no puede penetrar a través de la cápsula, sino que precipita alrededor de ella, de
tal manera que se observa un halo alrededor de los microorganismos en un fondo oscuro.
El procedimiento de este método consiste en colocar sobre un extremo de un portaobjetos
colocar una gota de suspensión microbiana y agregar una gota de tinta china o nigrosina,
hacer un frotis con el asa, seguidamente realizar un frotis con otra portaobjetos por último
observar al microscopio con el diafragma ligeramente cerrado [1].

2. ¿Como se vería reflejado la contaminación de bacterias con cápsulas en un alimento?

La contaminación de bacterias con cápsulas en un alimento sería de muy alta riesgo debido a
que estas bacterias que poseen cápsulas son muy resistentes frente a los agentes nocivos,
también la cápsula permite que este se puedan adherir a ciertas superficies produciendo lo
que se conoce como biofilms estos en la industria alimentarias son muy frecuentes y de muy
alto riesgo debido a su adherencia a equipos de las industrias alimentarias se pueden producir
contaminaciones cruzadas.
Las bacterias con cápsulas también les permite retener grandes cantidades de agua, por
consiguiente estas son resistentes a las desecaciones [2].

3. ¿En qué consiste la coloración positiva y negativa en las tinciones microbiológicas?

Tinción positiva: ​Es la tinción de los microorganismo efectuados con colorantes básicos que
poseen afinidad con los constituyentes celulares y se con el citoplasma microbiano, estas
tinciones son las que se utilizan después de hacer el frotis y la fijación, dentro de las tinciones
positivas se puede encontrar las siguientes soluciones:
● Fucsina
● Violeta de genciana
● Azul de metileno
El azul de metileno al momento del uso se le agrega un álcali (KOH), el cual actúa como
intensificante haciendo más rápida e intensa la coloración.
Tinción negativa: ​Este es un proceso contrario a la tinción positiva, al agregar el colorante
los microorganismos quedan incoloros y solo se tiñe el medio que los rodea, por lo tanto lo
que se ve es el perfil de las células.
Las sustancias usadas para las tinciones negativas son sustancias que tengan poca afinidad
con los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, dentro de la tinción
negativa se puede encontrar las siguientes sustancias:
● Nigrosina
● Tinta china

https://es.scribd.com/doc/15024971/Cap-5-Coloraciones

4. Investigue la presencia de bacterias con endosporas en los alimentos, ¿En qué

alimentos se reporta con mayor frecuencia? ¿Qué tratamiento existe en la industria
para la eliminación de estos microorganismos?

Las bacterias tienen muchas estrategias para sobrevivir al ambiente, estas estrategias implican
con frecuencia cambio los cambio rápidos en las expresión de los genes que alteran
temporalmente el fenotipo de la célula y le permite sobrevivir. Las endosporas se forman y
nutren completamente dentro de una célula madre, la cual debe romper su membrana para
liberar la espora al medio ambiente,mediante un proceso llamada esporulación dentro de los
microorganismos formadoras de esporas en los alimentos encontramos los siguientes
géneros[3]:

1. Bacillus: Dentro de este género se encuentran muchas especies, uno de los más
conocidos son los ​Bacillus cereus e​ stas son bacterias capaces de formar esporas, distribuida
de forma amplia son aeróbicas, esta bacteria se encuentra en una amplia gama de alimentos,
pero esta es muy fácil encontrarla: hortalizas, especies o cosechas de cereales, debido a que
esta bacteria es proveniente del suelo[4].
a. Sporolactobacillus: ​Este tipo de bacteria también pertenecen al género de los
Bacillus ​, esta crece en almidones, frutas secas, verduras granos, leche en
polvo y cereal [6].
2. Clostridium: ​Dentro del género de los ​Clostridium​, se encuentran muchas especies
una de las más conocidas son el ​Clostridium botulinum , ​esta es una bacteria anaeróbica,
gram positivo, en forma de bacilo formadora de esporas y de neurotoxinas. Este tipo de
bacterias como su nombre lo indica son las causantes de la enfermedad del botulismo, dentro
de la gama de alimentos que pueden tener esta bacteria se encuentran: alimentos mal
enlatados como: maíz, espárragos, embutidos, aceitunas, atún y esta bacteria también se puede
encontrar en alimentos empacados al vacío o envueltos[5].
3. Desulfotomaculum: E ​ s una especie integrada por bacilos Gram negativos, formadores de
endosporas, se encuentran habitualmente en suelos, agua dulce y en la pasa de los animales
rumiantes. Esta bacteria es la causante del olor hediondo debido a la producción de sulfuro de
hidrógeno en alimentos enlatados.
 También se encuentra en alimentos bajos en pH como lo son los guisantes y el maíz, aparte de
esto las bacterias ​Desulfotomaculum s​ on termoresistentes, su presencia se puede
descubrir debido a que esta forma colonias negras[7].

Para la microbiología de los alimentos los ​Bacillus y los ​Clostridium son de suma
importancia debido a los problemas que causan. Actualmente se sabe que los ​Bacillus cereus ,​
de dos tipos de enfermedades trasmitida por los alimentos , un síndrome diarreico de aparición
relativamente tardía y un síndrome emético de aparición relativamente rápida. No solo esta especie de
Bacillus s​ e ha relacionado con enfermedades trasmitida por alimentos, se han aislado algunas otras
especies como: ​B. subtilis, B.licheniformis y B.pumilus, ​que han dado gran importancia al tipo de
patología que producen, todas estas especies se encuentran en el suelo, agua y vegetales.
Las hierbas secas y las especies que se utilizan pueden ser de un origen importante de los ​Bacillus,
los jugos y las carnes son vehículos de los otros tipos de especies causantes de intoxicación
alimentaria.
De los alimentos con mayor frecuencia contaminados con esporas encontramos los siguientes:

Microorganismo Alimento en Características Referencia

mayor frecuencia

B. subtilis Pan y bollos Esta especie es responsables del defecto [3]

blandos conocido como el pan viscoso

Clostridium Carnes rojas Es muy común encontrarlas en carnes en [8]

frigidicarni descomposición o carnes empacadas al vacío,
está también deteriorada la carne incluso si
esta se encuentra refrigerada.

B.cereus Arroz y pasta Estas esporas pueden contaminar el arroz [9]

desde el cultivo y germinan cuando este
alimento ha sido sometido a procesos de
cocción.

Clostridium Alimentos Estos microorganismos son los causantes de [10]

botulinum enlatados la enfermedad del botulismo

Una de las tecnologías emergentes que mayor desarrollo y uso comercial ha experimentado
ha sido el procesado mediante altas presiones hidrostáticas, esta tecnología se basa en la
aplicación sobre el alimento envasado de presiones hasta 600 MPa, estos niveles de presión
provocan alteraciones en las macromoléculas como las proteínas, afectando sus enlaces
débiles. A pesar de su alto potencial como tecnología de descontaminación y conservación, la
alta presión por sí sola no es capaz de inactivar las esporas bacterianas, por estas razones en
el proceso de alta presión se considera un tratamiento de pasteurización, de tal manera que
para alcanzar la inactivación de las esporas es por ello que la combinación es un buen método
para producir alimentos estables a temperaturas ambientes. La combinación de la alta
temperatura con alta presión recibe el nombre de Tratamiento Térmico asistido por Altas
Presiones (TTAP) [11].
También es necesario implementar acciones de control y prevención en toda la cadena
alimentaria basadas en buenas prácticas agrícolas, buenas prácticas de higiene en la
manipulación, elaboración y conservación de alimentos, así como sistemas de control,
análisis de peligros y puntos críticos de control​ [12].

5. ¿Qué otros métodos de coloración de endosporas existen?, nombre al menos dos y

explíquelos.
Técnica de Dorner: ​El método consiste, en preparar un tubo de ensayo una suspensión
concentrada en agua destilada y agregar volumen igual de fucsina, seguidamente colocar el
tubo en baño maría durante 5 y 10 minutos. Sobre un portaobjetos mezclar una gota de la
suspensión anterior con una gota de nigrosina al 10%, extender y secar rápidamente con calor
suave [13].

Técnica de Möeller: La técnica de Möeller consiste en cubrir el frotis con cloroformo por 2
minutos seguidamente se lava el cloroformo con agua destilada. Cubrir con ácido crómico al
5% durante 5 minutos seguidamente se lava con agua destilada posteriormente se cubre con
fucsina y se expone a la llama del mechero hasta la emisión de vapores, se retira unos
instantes, se repetir este proceso hasta los 10 minutos se lava con agua destilada por último se
cubre con azul de metileno por 5 minutos se lava con agua destilada y se deja secar [14].

REFERENCIAS
1 ​http://www.elementos.buap.mx/num94/pdf/35.pdf
2​http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/MorfologiayEstructuraBacteriana.pdf
2- Tortora, G. J., Funke, B. R., & Case, C. L. (2010). Microbiology. An introduction
(10th ed.). San Francisco: Pearson.

Villanueva, J. (1996). Microbiología, Reverte. Barcelona. pág 509-530

Tortora, G. J., Funke, B. R., & Case, C. L. (2007). Introduccion a la Microbiologia (9a
ed.). Argentina: Médica Panamericana.

REFERENCIAS DEL CUESTIONARIO

[1]​https://books.google.com.co/books?id=Gxmui-vjZBgC&pg=PA548&dq=Tincion+de
+capsulas&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwi20aKY4sTjAhWFwFkKHcuDDY8Q6AEILTA
B#v=onepage&q=Tincion%20de%20capsulas&f=false

[2]​https://books.google.com.co/books?id=-dUEZSXaz2UC&pg=PA364&dq=para+qu
e+sirven+las+bacterias+en+las+capsulas&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwjzutf4hcXjAh
UQzlkKHYj4D7oQ6AEIKTAA#v=onepage&q=para%20que%20sirven%20las%20bac
terias%20en%20las%20capsulas&f=false

[3]​http://web.udlap.mx/tsia/files/2015/05/TSIA-81-Huesca-Espitia-et-al-2014.pdf

[4]​https://www.scielosp.org/article/rcsp/2010.v36n1/128-138/es/

[5]​https://books.google.com.co/books?id=Wv026CUhR6YC&pg=PA951&dq=Clostridi
um+botulinum+en+alimentos&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwioo9a41sbjAhXkt1kKHd8
yBlgQ6AEILTAB#v=onepage&q=Clostridium%20botulinum%20en%20alimentos&f=f
alse

[6]​http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1981-67232019000100423&script=sci_artte
xt&tlng=pt

[7]​https://books.google.es/books?hl=es&lr=&id=Tq8nBgAAQBAJ&oi=fnd&pg=PA9&d
q=Desulfotomaculum+en+alimentos&ots=duelFrVW_3&sig=F5gjds_8yiOrZSTQil7z8
T0rtRg#v=onepage&q=Desulfotomaculum%20en%20alimentos&f=false

[8]​https://ijs.microbiologyresearch.org/content/journal/ijsem/10.1099/00207713-49-4-
1539

[9]​https://www.minsalud.gov.co/sites/rid/Lists/BibliotecaDigital/RIDE/IA/INS/Perfil-bac
illus-cereus.pdf

[10]​https://books.google.com.co/books?id=zy0hd4zDL78C&pg=PA80&dq=alimentos
+botulismo&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwixgZ_L28fjAhUMrVkKHUUWCLsQ6AEINjA
C#v=onepage&q=alimentos%20botulismo&f=false

[11]​http://www.interempresas.net/Alimentaria/Articulos/126821-Combinacion-alta-pre
sion-temperatura-inactivacion-microorganismos-esporulados.html

[12]​https://cibnor.repositorioinstitucional.mx/jspui/bitstream/1001/1122/1/PUB-ARTIC
ULO-3995.PDF

[13]​repositorio.utmachala.edu.ec/.../9%20MICROBIOLOGIA%20GENERAL%...
(el link permite descargar el pdf)

[14]​http://www.aranzadi.eus/fileadmin/docs/Munibe/2002247251CN.pdf