Exámenes en fresco

Los exámenes en fresco permiten visualizar los microorganismos sin necesidad

de fijarlos ni teñirlos, y por tanto vivos. Los microorganismos en general no
presentan demasiado contraste respecto al medio que les rodea. A pesar de
ello es posible verlos sin necesidad de teñirlos gracias a la refringencia que
despiden y sobre todo a su capacidad de movimiento en medios líquidos.

La visualización de bacterias en fresco puede realizarse mediante la técnica de

la gota pendiente. Consiste en colocar una gota de la solución con la bacteria
en suspensión en un cubreobjetos que se coloca invertido sobre un
portaobjetos excavado. Con el objetivo de 40 aumentos pueden detectarse las
bacterias en movimiento por la refringencia que desprenden. Es una técnica
que apenas se utiliza en el diagnóstico microbiológico, porque ofrece muy poca
información en cuanto a la estructura y composición de las bacterias.
Solamente puede tener utilidad en la comprobación de la motilidad de los
microorganismos.

Los exámenes en fresco si constituyen un arma potente de diagnóstico en las

infecciones producidas por parásitos intestinales. Pueden detectarse huevos,
quistes y trofozoitos que por sus características morfológicas pueden generar
por si solas un diagnóstico definitivo. Las muestras de heces deben pretratarse
antes de realizar la preparación en fresco con el fin de aclarar y concentrar los
parásitos. Las infecciones producidas por Tricomonas vaginalis, un protozoo
flagelado responsable de infecciones urogenitales, también se diagnostican
mediante la visualización en examen en fresco directo del exudado uretral.

Tinciones
En muchas ocasiones la visualización en fresco es completamente insuficiente
para distinguir a los microorganismos. Se hace necesario aumentar su
contraste respecto al medio donde se encuentran. Para ello se utilizan las
tinciones, que posibilitan la observación de la cantidad, tamaño, morfología y
disposición relativa de los microorganismos.

Las tinciones suponen la muerte de los microorganismos. No puede detectarse

la capacidad de movimiento en las preparaciones teñidas. Todas las tinciones
tienen un paso previo de fijación al portaobjetos que se realiza con calor o con
lavado en alcoholes (metanol). A continuación se aplican sustancias coloreadas
que tiñen la superficie de los microorganismos.

Las tinciones se denominan simples cuando utilizan un solo colorante, o bien

diferenciales cuando usan más de uno y tiñen de forma específica distintas
estructuras bacterianas. Las tinciones diferenciales son las más utilizadas ya
que ofrecen más información diagnóstica.

Todas las tinciones tienen el mismo esquema de realización. Pueden variar los
colorantes, los tiempos de exposición o las técnicas de fijación:

Extensión. Consiste en obtener una película fina de la muestra sobre el

portaobjetos. Si se parte de medio líquido simplemente se extiende una
pequeña gota. Si se trata de una colonia nos ayudaremos de suero fisiológico
estéril.

Fijación. Tras secar el porta las bacterias deben adherirse al cristal. Debe
intentar conservarse lo más posible las estructuras nativas del microorganismo.
Puede utilizarse calor (flameado), o bien alcoholes.
 Coloración. Aplicación de los colorantes. Su elección depende del tipo de
tinción. Es necesario controlar la concentración y el tiempo de exposición para
que los microorganismos queden suficientemente teñidos y el fondo
suficientemente claro

Lavado del exceso de colorante con agua. Tras el secado está listo para ver
en el microscopio.

Tinción de gram

A pesar de que fue desarrollada en el siglo XIX la tinción de gram es la más

utilizada en el diagnóstico microbiológico. De hecho la información que ofrece
relativa a la composición de la pared bacteriana es la base de todas las
taxonomías en este reino.

Se trata de una tinción diferencial que distingue entre bacterias con pared
gruesa (gram positivas) y bacterias con pared fina y membrana externa (gram
negativas). La mayoría de las bacterias presentan una de estas dos
morfologías generales.

La tinción de gram utiliza violeta de genciana como colorante primario. Tras su

aplicación todos los microorganismos se tiñen de violeta. Después el lugol
actúa como mordiente, acentuando la penetración del colorante primario. El
tercer paso consiste en la aplicación del decolorante, una mezcla de alcohol y
acetona que elimina el violeta excepto en las bacterias con pared gruesa. Por
último el colorante secundario o de contraste, la safranina, tiñe de rojo las
bacterias decoloradas, es decir las de pared fina. En resumen las bacterias
gram positivas quedan teñidas de violeta y las gram negativas de rojo.

Tinción de Ziehl-Neelsen
También es una tinción diferencial. Se denomina tinción ácido-alcohol
resistente y es específica para una serie de bacterias con estructura de pared
particular, las micobacterias. La pared de las micobacterias no está basada en
peptidoglicano como las bacterias gram positivas y gram negativas, sino en
ácidos micólicos. Esta particularidad las hace resistentes a la decoloración con
ácido y alcohol que no se produce en casi ningún otro tipo bacteriano.

La tinción de Ziehl-Neelsen utiliza tres reactivos. El colorante primario es la

fucsina que tiñe toda la preparación de rojo brillante. Como mordiente se
utiliza flameado de la preparación con el colorante. La solución decolorante
elimina el colorante primario excepto el los bacilos ácido alcohol resistentes.
(BAAR). Por último el azul de metileno tiñe de azul el resto de la preparación.

Esta tinción es útil en la detección de bacterias del género Micobacterium en

muestras de esputo. La presencia de bacilos rojos sobre fondo azul constituye
un diagnóstico casi definitivo de tuberculosis.

Tinción de esporas

Alunas bacterias son capaces de desarrollar formas de resistencia denominadas

esporas como mecanismo de defensa a agresiones ambientales. Son
estructuras de pared gruesa en las que el microorganismo logra soportar las
condiciones desfavorables de calor, desecación, acidez, etc. Cuando las
condiciones ambientales vuelven a ser favorables las esporas "germinan" y
vuelven a generarse formas vegetativas. Sólo algunas bacterias son capaces de
formar esporas y esta característica puede en algunos casos orientar el
diagnóstico.
Están descritos varios métodos para teñir esporas. Quizás el más utilizado sea
el de Wirtz-Conklin o tinción con verde malaquita. Este colorante se une
fuertemente a las esporas gracias a la utilización de calor como mordiente. La
fase de decoloración en este caso se realiza con agua abundante. Las formas
vegetativas pierden el color verde y se tiñen con el colorante de contraste
(fucsina o safranina).

La detección de esporas debe realizarse en cultivos con condiciones estresantes

para la célula. Suelen utilizarse cultivos viejos en los que la escasez de
nutrientes provoca la esporulación de las bacterias.

La presencia de esporas en el ámbito clínico no dirige hacia los géneros

Clostridium y Bacillus. Algunas esporas se desarrollan sin deformar a la célula
vegetativa. Otras si lo hacen y generan según la disposición formas centrales o
terminales (palillo de tambor). La posición relativa y la morfología de la espora
constituyen caracteres taxonómicos en las especies de ambos géneros.

Tinción negativa de cápsulas

Algunas bacterias presentan una capa externa a la pared denominada cápsula.

Está compuesta de azúcares y proteínas. No es una estructura vital para la
bacteria, de modo que es posible que bajo determinadas condiciones
ambientales o del propio desarrollo genere cápsula y bajo otras no lo haga. Se
ha comprobado que la presencia de cápsula dificulta de algún modo la
fagocitosis de las bacterias, es decir las cápsulas constituyen un factor de
virulencia de los microorganismos.
 La detección de cápsulas en las bacterias también puede orientarnos en el
diagnóstico de laboratorio, y es especialmente importante en el diagnóstico de
meningitis producida por Cryptococcus neoformans.. Se trata de una levadura
que provoca graves cuadros de meningitis en personas inmunocomprometidas,
y su detección en LCR lo más precozmente posible es vital para la
supervivencia del paciente.

La tinción de cápsula se denomina tinción negativa porque tiñe el fondo de la

preparación y no el microorganismo. Desde el punto de vista formal no es una
tinción propiamente dicha, porque no fija los microorganismos. Se parece más
a una preparación en fresco. Su realización es sencillísima, consiste en colocar
la muestra húmeda sobre el porta objetos y mezclarla con tinta china. La tinta
cubre toda la preparación a excepción de las cápsulas. En el microscopio se
observa el fondo negro y los microorganismos con cápsula sin color.

Existen otras técnicas de tinción que ponen de manifiesto más estructuras

bacterianas. Es el caso por ejemplo de las tinciones de flagelos. No obstante no
tienen demasiado interés desde el punto de vista del diagnóstico, y suelen
realizarse más a menudo en investigación básica.

Las partes de un microscopio Los dos sistemas de lentes de un microscopio

óptico compuesto se denominan lente objetivo, la que está mas cercana al
espécimen, y lente ocular, que está en la pieza del ocular del microscopio.
Los microscopios modernos llevan la fuente de luz incorporada. En la Figura
3.6se puede observar el recorrido de la luz desde la f'uente luminosa, en la
base del microscopio, hasta el ojo del obsenador. La luz pasa frecuentemente a
través de un filtro azul (para eliminar Iongitudes de onda largas) y a través de
otra serie de lentes que constituven el condensador. El condensador tiene
como función dirigir la luz sobre el espécimen, donde parte de la misma es
absorbida y parte difractada. La luz transmitida entra en la lente objetivo, que
forma una imagen en el tubo del microscopio. Posteriormente la lente ocular
aumenta la imagen y la proyecta en la última lente de la serie la de nuestro
propio ojo. El ojo forma una imagen en la retina y el cerebro la percibe.

Un microscopio compuesto ordinario proporciona una iluminación de campo

claro. Esto es debido a que el condensador dirige la luz a través del
espécimen, y el fondo queda iluminado de forma brillante. Los microscopios
compuestos pueden ser modificados para ver un espécimen mediante (1)
contraste de fases, (2) campo oscuro, (3) fluorescencia, o (4) por contraste
diferencial de interferencia (Nomarsky); todos estos métodos se describirán
más tarde.

Poder total de aumento Casi todos los microscopios compuestos poseen

varias lentes objetivos, cada una con un poder de aumento diferente.
Normalmente, existe una lente de bajo poder (objetivo débil seco) que
aumenta un objeto 10 veces (l0x), una de alto poder (objetivo fuerte seco), que
aumenta 40 veces (40x) y el objetivo de inmersión, 100 veces (l00x). Casi
todas las lentes del ocular proporcionan un aumento adicional de 10 veces
(l0x). Se puede calcular el poder total de aumento de un microscopio
multiplicando cl aumento que proporcionan las dos lentes, objetivo y ocular,
en uso. (Véase la Tabla 3.1, en la cual se incluyen tres ejemplos.) Si se desea
observar la apariencia general de un espécimen es recomendable usar un
objetivo de bajo poder, porque su campo de visión es grande. El objetivo de
inmersión tiene un campo de visión pequeño, pero proporciona mas detalles
de la imagen (Figura 3.7).

Casi todos los microorganismos requieren, antes de ser examinados en un

microscopio óptico, una preparación especial; esto es debido a que poseen
poco contraste natural. La preparación y la tinción (tratamiento con
colorantes) de un espécimen son fundamentales si se desea obtener buenas
imágenes. Muchas décadas de esfuerzos y errores han conducido a métodos
generales de preparación que resultan idóneos. A continuación describiremos
la observación en fresco de microorganismos vivos y varios tipos de tinciones.

Tabla 3.1. Aumento Total

Lente Ampliación
Microscopio Lente ocular
objetivo total
Microscopios ópticos
Debil seco 10x x 10x = l00x
Fuerte seco 40x x 10x = 400x
Aceite de inmersión 100x x 10x = 1000x
Microscopios electrónicos
Transmisión (MET) ~200000x
Barrido (MEB) ~10000x

Figura 3.6 El camino de la luz en el microscopio compuesto. La luente de luz

está en la base. El condensador enfoca el haz de luz sobre el espécimen, donde
parte se absorbe, parte se refracta, y parte se transmite. La luz transmitida
penetra en la lente objetivo, que aumenta la imagen. El prisma hace que la
imagen se forme en el tubo del microscopio, haciendo la visión más cómoda.
La lente ocular vuelve a aumentar la imagen y la enfoca en el ojo.

3.1.4 Preparaciones en fresco

La forma más simple de preparar un espécimen para su examen microscópico

es hacer una preparación en fresco. Existen dos técnicas, una preparación
en fresco simple ("entre porta y cubre") consiste en colocar una gota de
líquido con los microorganismos sobre un portaobjetos y a continuación
cubrirla con un cubreobjetos. Una preparación en gota pendiente se realiza
colocando una gota del material en un cubreobjetos y cubriéndolo con un
portaobjetos (invertido) con una excavación central (portaobjetos
excavado) (Figura 3.8). Hay que sellar la preparación con vaselina alrededor
de la excavación. La ventaja de esta última técnica, es que la preparación no
se seca y puede ser observada durante un tiempo más largo.

Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos.

Por ejemplo, para la búsqueda de Trichomonas vaginalis en secreciones
vaginales. Este protozoo de gran movilidad causa inflamación de la vagina y
la uretra. Si en la preparación se observan células en forma de huso que se
mueven mediante contracciones o sacudidas cruzando el campo,
probablemente se tratará de T. vaginalis, pudiéndose efectuar el diagnóstico.

Sin embargo, el inconveniente de la observación en fresco es que no permite

aumentar el contraste de la preparación. Por tanto, su uso, con un microscopio
óptico de campo claro, está bastante limitado. Normalmente, para observar
microorganismos vivos se utiliza alguno de los otros microscopios ópticos que
hemos mencionado anteriormente.

Figura 3.7 El microscopio compuesto tiene tres lentes objetivos (tres sistemas
de lentes). Se muestra el mismo campo de Bacillus subtilis visto con el
objetivo débil seco (100x), fuerte seco (400x), y con el de inmersión (l000x).
Los aumentos mayores revelan progresivamente más detalle de una porción de
campo menor.
 Figura 3.8 Preparación en gota pendiente. Esta preparación se realiza
colocando una gota de la suspensión bacteriana en un cubreobjetos en el cual
se ha hecho previamente un círculo con vaselina o parafina (a). La vaselina
actúa como sellador. (b) Sobre el cubreobjetos se coloca un portaobjetos con
una excavación central que queda adherido gracias a la vaselina (c). Se
invierte la preparación y se observa colocándola en la platina del microscopio
(d). Las preparaciones en gota pendiente se utilizan para observar
microorganismos vivos.

3.1.5 Tinciones

El microscopio de campo claro es más útil para la observación de especímenes

teñidos. Los colorantes son compuestos químicos utilizados para aumentar el
contraste. Existen algunos, llamados colorantes vitales, que pueden añadirse
directamente a una preparación en fresco; por tanto, colorean células vivas.
No obstante, la mayoría de los colorantes son solamente efectivos después de
que los microorganismos hayan sido fijados, es decir, se encuentren muertos y
adheridos al portaobjetos. Para la fijación por calor, se realiza una
fina extensión de una gota de muestra líquida sobre un portaobjetos y se deja
secar al aire; a continuación, se pasa la preparación de Forma rápida sobre la
llama de un mechero. El calor de la llama mata las células microbianas por
desnaturalización de sus proteínas. Las proteínas coaguladas unen las células
al porta. Cuando se desea fijar especimenes delicados se utiliza la fijación
química, va que es menos lesiva que el calor. Para ello se añade una gota del
fijador, por ejemplo, ácido ósmico, formaldehído, o glutaraldehído, sobre la
muestra líquida con los microorganismos.

La fijación posee algunos inconvenientes. Por ejemplo, a menudo distorsiona

la apariencia real de las células, lo cual dificulta la identificación; además, no
permite la observación del movímiento de los microorganismos. Después de
la fijación, se añade el colorante, que debe permanecer el tiempo suficiente en
contacto con el espécimen, para que pueda ser absorbido. A continuación, se
retira el exceso de colorante, normalmente lavando con agua.

Tipos de colorantes Casi todos los colorantes son sales, compuestos

formados por iones cargados. Los colorantes básicos son aquellos en los
cuales el agente que tiñe es el ion cargado positivamente, mientras que en los
ácidos, el colorante es el ion cargado negativamente. Los colorantes más
utilizados son los de tipo básico, va que la mayor parte de las células
microbianas Poseen cargas débilmente negativas en su superficie, lo cual
facilita su unión. Entre los colorantes básicos más comunes se encuentran la
safranina, la fucsina básica, el cristal violeta y el azul de metileno. Los
colorantes ácidos se unen a las partes de las células cargadas positivamente.
Se utilizan para teñir tejidos animales infectados con microorganismos. Entre
los más frecuentes están la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo.

TABLA 3.2 Técnicas de tinción para bacterias

Tinción Uso Técnicas
Tinciones Un colorante; proporciona Se tine con un colorante básico
simples contraste para observar mejor un (azul de metileno, cristal violeta, o
organismo completo fucsina básica) durante unos 5
minutos. Aclarar brevemente con
agua. Se tiñen casi todas las
bacterias; la rnayoría de los tejidos
no se tiñen.
Tínciones
diferenciales
Tinción de Dos o más colorantes; distingue Se cubre la preparación de
Gram entre bacterias Gram positivas y bacterias fijadas con cristal violeta
Gram negativas y después con una solución de
iodo (mordiente). Todas las células
quedan tenidas de color violeta
oscuro. Se decolora con acetona al
95%.

Las células Gram positivas

permanecen tenidas, pero las
 negativas pierden el colorante. Se
tiñe con safranina (contraste). El
color violeta de las Gram positivas
se vuelve más oscuro y las Gram
negativas se tiñen de rosa.
Tinción de Dos colorantes; distingue entre Se tiñen las células con fucsina
ácido-alcohol las micobacterias (ácido-alcohol básica y se calienta a emisión de
resistencia resistentes) y el resto de las vapores durante 5 minutos. Todas
(Ziehl- bacterias las bacterias se tinen de rojo. Se
Neelsen) decolora brevemente con una
mezcla de alcohol-HCl. Las
bacterias resistentes permanecen
teñidas de rojo; todas las demás se
decoloran. Se trata con el colorante
de contraste azul de metileno. Las
bacterias ácido-alcohol resistentes
continúan tenidas de rojo, las otras
se tiñen de azul.
Tinciones
especificas
Tinción de Tiñe selectivamente las Se cubre la preparación con verde
esporas de endosporas de malaquita y se calienta a
Wirtz-Cortitlin emisión de vapores durante 60
segundos. Se lava con agua
durante 30 segundos y se tiñe con
safranina. Las endosporas retienen
el color verde; el resto de la célula
toma el color rosa.
Tinción de Permite observar los flagelos A las células previamente fijadas,
flagelos de se le añade una mezcla de ácido
Leifson tánico (mordiente) y del colorante
rosanilina. El mordiente engruesa
los flagelos y el colorante los fine.
Tinción Revela la presencia de cápsulas Se utiliza tinta china o nigrosina
negativa para tenir una preparación en
fresco del espécimen. Las
particulas de colorante no pueden
penetrar en la cápsula, que se
observa como una región clara
alrededor de la célula.