Técnica de tinción.

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de

ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la
célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es
la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos
diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes
celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de
actividad respiratoria, etc.

Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de

teñirlas, proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más
corriente, aunque también puede fijarse con sustancias químicas como
formaldehido, ácidos y alcoholes. Después de la fijación, si se añade el colorante,
no se producen ulteriores cambios estruturales en el protoplasma. La fijación se
realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre un portaobjetos,
tratando después éste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso
de tinción. La fijación produce habitualmente el encogimiento de las células; la
tinción, por el contrario, hace que las células aparezcan mayores que lo que son
realmente, de manera que las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas
no pueden realizarse con mucha precisión.

Medios de cultivos.

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es

observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio
de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado
más de 10.000 medios de cultivo diferentes.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe
reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y
presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad.
Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento
necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.

La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en

composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de
muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que
se añadirán otros ingredientes.
Técnica de aislamiento.
Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos métodos
que permiten cultivarlos bajo condición artificiales, en los que es posible cultivarlos
bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo de microorganismo. Una de
las técnicas más usadas en el laboratorio de microbiología consiste en transferir una
muestra microbiológica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que
permite obtener cultivos microbianos. Al efectuar este procedimiento, es necesario
considerar que en el área de trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido
a esto, es necesario tomar precauciones para impedir que éstos penetren y
contaminen los cultivos en estudio. Por otra parte, para considerar no sólo el
aspecto nutricional, sino también las condiciones ambientales de su hábitat natural,
por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar el pH y concentración de sales y
durante la incubación condiciones tales como la temperatura, aireación, la
luminosidad. La aplicación de estos procedimientos ha permitido propagar a los
microorganismos en cultivos mixtos, así como su aislamiento y la obtención de
cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio, caracterización, aplicación y
control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de
microorganismo y propósito específico del estudio.
Propagación actualmente utilizada.
Un método fundamental para estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio
líquido o en la superficie de un medio sólido de agar. Los medios de cultivo
contienen distintos nutrientes que van, desde azúcares simples hasta sustancias
complejas como la sangre o el extracto de caldo de carne. Para aislar o purificar
una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos de
bacterias, se siembra en un medio de cultivo sólido donde las células que se
multiplican no cambian de localización; tras muchos ciclos reproductivos, cada
bacteria individual genera por escisión binaria una colonia macroscópica compuesta
por decenas de millones de células similares a la original. Si esta colonia individual
se siembra a su vez en un nuevo medio crecerá como cultivo puro de un solo tipo
de bacteria.

Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfológicamente que es imposible

diferenciarlas sólo con el uso del microscopio; en este caso, para identificar cada
tipo de bacteria, se estudian sus características bioquímicas sembrándolas en
medios de cultivo especiales. Así, algunos medios contienen un producto que inhibe
el crecimiento de la mayoría de las especies bacterianas, pero no la de un tipo que
deseamos averiguar si está presente. Otras veces el medio de cultivo contiene
determinados azúcares especiales que sólo pueden utilizar algunas bacterias. En
algunos medios se añaden indicadores de pH que cambian de color cuando uno de
los nutrientes del medio es fermentado y se generan catabolitos ácidos. Si las
bacterias son capaces de producir fermentación, generan gases que pueden ser
apreciados cuando el cultivo se realiza en un tubo cerrado.
TECNICAS DE TINCIÓN
TIPOS
a) Simples: utilización de un solo tinte con el cual podemos evaluar solamente
la morfología. Las tinciones simples es cuando toda la muestra se tiñe del
mismo color y se utiliza un solo colorante.
b) Compuestas o especiales: constituidas por 2 o más tintes o reactivos y
sirven para clasificar las bacterias u observar sus características especiales.
c) Positivas: se observa teñida la célula sobre un fondo claro.
d) Negativas: El fondo se tiñe de oscuro para observar la célula o estructuras
refringentes.
Tinciones compuestas.
TINCION DE GRAM
Composición de la pared celular de las bacterias, las bacterias G+ está compuesta
por varias capas de peptidoglicanos, las bacterias G- tienen una membrana externa
con un componente estructural único que son los lipopolisacáridos. Las bacterias
G+ retienen el cristal-violeta después de la decoloración y aparecen de color azul
intenso (purpura), las bacterias G- no son capaces de retener el cristal-violeta
después de la decoloración y son teñidas de rojo con safranina.
PASOS
a) Preparar la extensión del cultivo: En un portaobjetos limpio, libre de grasa, y
con un asa bacteriológica colocar una pequeña cantidad de la colonia
bacteriana. a. Muestra solida: colocar solución salina previamente a colocar
la colonia, igual en muestra semisólida. b. Muestra liquida: colocar la colonia
directamente.
b) Dejar secar al aire, luego fijar la preparación pasando la placa rápidamente
por el mechero (2 ó 3 veces) La fijación, procedimiento que permite preservar
estructuras celulares, se puede llevar a cabo con diferentes tratamientos:
fijación por calor o fijación química. La fijación por calor es la más utilizada
para la observación de bacterias. Este procedimiento consiste en pasar el
portaobjetos, con la suspensión bacteriana extendida y seca, a través de una
llama de un mechero. La fijación por calor preserva la morfología externa de
los microorganismos, pero no las estructuras internas. La fijación química con
agentes como etanol, formaldehído y ácido acético entre otros muchos, se
utiliza para preservar las estructuras celulares.
c) Agregar violeta cristal durante 20 a 30 segundos (Colorante primario),
enjugar con agua seguidamente.
d) Agregar yodo Gram durante 40 a 60 segundos (mordente), enjuagar con
agua seguidamente.
 e) Agregar alcohol acetona y enjuagar con agua inmediatamente (decoloración,
disuelve lípidos de la pared de G- ).
f) Agregar safranina durante 20 segundos, enjuagar con agua seguidamente.
TINCION DE MOLLER (ESPORAS)
Se suspende una bacteria del género Bacillus, evidencia capsula incolora en un
contraste morado.
Pasos:
a) Se prepara el extendido de la muestra.
b) Se deja secar y se fija con calor.
c) Se tiñe con carbol-fuschina hasta llenar por completo el portaobjetos.
d) Pase un mechero por debajo de la placa calentando hasta que vea que se
emiten vapores y sin dejar que hierva por 3 minutos. Si la placa se va
secando, ir agregando más tinte hasta cumplir el tiempo. (Se calienta el tinte
para que penetre la espora que contiene dipecolinato de calcio).
e) Se enjuaga con agua y se coloca ácido sulfúrico al 1% por 2 minutos
(decolorante para retirar el carbol-fuchina).
f) Se enjuaga con agua y se tiñe finalmente con azul de metileno por 1 minuto
g) Dejar secar.
Las esporas permiten a las bacterias pasar a un estado latente en condiciones
ambientales adversas. Su principal componente es Ca2+ fijado a ácido dipicolínico.
El calor después de la tinción con carbol-fuscina con permite que rompa la
estructura que protege la espora para que así pueda penetrar el colorante. Con el
lavado de agua se retira todo tinte que se adhirió a la bacteria, para después teñirse
con azul de metileno.
TINCION DE ANTHONY (CAPSULAS)
Es una tinción negativa en donde vemos la cápsula no teñida sobre un fondo
morado y se visualiza la bacteria en el centro de la cápsula, esta pude ser de
glicoproteínas o polisacáridos.
La cápsula es una sustancia viscosa producida por algunas especies que la
sintetizan a partir de polipéptidos, polímeros de glucosa u otros amino azúcares que
contienen nitrógeno, que después de combinarse con el agua es segregada por
todo el contorno de la pared celular como un moco gelatinoso. Cuando la cápsula
ha sido producida puede observarse en el frotis coloreado por el método de Gram
como un halo incoloro alrededor de la bacteria. Cuando se requiere ver la cápsula
con más detalle o inducir su producción se recurre a coloraciones especiales.
PASOS
a) Colocar leche descremada al 20% o leche litmus en un extremo del
portaobjetos.
b) Agregar la muestra de bacteria en la leche del borde.
c) Realizar un extendido con la ayuda de otro portaobjetos.
d) Se deja secar al aire (no se fija con calor ya que la leche se pega al
portaobjetos).
e) Teñir por 2 minutos con violeta-cristal.
f) Lavar con sulfato de cobre.
g) Se deja secar al aire.
Las cápsulas no se tiñen normalmente con colorantes básicos como el cristal violeta
o la safranina. Tinción negativa de cápsulas en que la leche litmus se tiñe con violeta
cristal como contraste de un fondo morado con el halo transparente de la cápsula
incolora.
TINCIÓN DE ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENCIA
Se trata de un procedimiento de tinción diferencial, conocido como método de Ziehl-
Neelsen, que tiene gran relevancia por su aplicación clínica. Permite poder distinguir
aquellos microorganismos cuya coloración resiste la acción de alcoholes y ácidos
suaves (ácido-alcohol resistentes) de otros que no resisten la decoloración (no
ácido-alcohol resistentes).
Dentro de las bacterias ácido alcohol resistentes encontramos dos importantes
patógenos: Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae, microorganismos
responsables de la tuberculosis y la lepra respectivamente. Estas bacterias
pertenecen al Phyllum Actinobacteria, un grupo grande y complejo de bacterias
gram positivas, que incluye a la Familia Mycobacteriaceae caracterizada por
contener en sus paredes celulares un alto contenido lipídico, ceras con una gran
diversidad de ácidos micólicos, moléculas de 60 a 90 átomos de carbono. La
presencia de estos lípidos, en la cara externa de la pared, hacen que estas bacterias
sean muy resistentes a la acción de compuestos químicos presentes en su entorno,
característica que se utiliza para aislar estos microorganismos: uno de los medios
más frecuentes es el Loewenstein-Jensen con verde malaquita que permite el
crecimiento selectivo de estos microorganismos.
PASOS
a) Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequeña porción de un
cultivo bacteriano con el asa de siembra estéril.
b) Hacer el frotis, formando una película homogénea sobre el portaobjetos con
el asa de siembra. Dejar secar.
c) Fijar la preparación, pasando a través de la llama del mechero el
portaobjetos.
d) Cubrir con unas gotas de fuchina fenicada y aplicar calor con un hisopo de
lana.
e) de vidrio, mantener 5 minutos desde el comienzo de la emisión de vapores
f) Lavar el exceso de colorante con agua.
g) Añadir unas gotas de ácido nítrico al 33% durante 30-40 segundos.
h) Lavar el exceso de colorante con agua.
i) Lavar la preparación con alcohol de 96º durante 30 segundos.
j) Lavar con abundante agua.
k) Cubrir con el colorante de contraste, azul de metileno durante 1 minuto.
l) Lavar el exceso de colorante con agua.
m) Dejar secar al aire.
n) Añadir una gota de aceite de inmersión.
o) Observar con objetivo de inmersión (100 x).
Estas bacterias son resistentes al tratamiento con alcoholes y ácidos suaves
conservando el colorante fundamental, mientras que organismos que no posean
esta característica son rápidamente decolorados y pueden teñirse con el colorante
de contraste en este caso azul de metileno.
TINCIÓN DE AZUL ALGODÓN DE LACTOFENOL
El examen microscópico es de gran importancia en micología para la observación
de las diferentes especies de hongos de interés clínico. Se deben utilizar tinciones
que logren preservar la integridad de las estructuras fúngicas.
La tinción de azul algodón de lactofenol no es considerada una tinción diferencial,
sin embargo, posee características tintoriales que permiten observar cada uno de
los componentes fúngicos y apreciar fácilmente las estructuras para una adecuada
identificación.
El fenol inactiva las enzimas líticas de la célula e impide que ésta se rompa; de igual
forma, destruye la fl ora acompañante e inactiva a la célula, quitándole el grado de
patogenicidad; además, actúa como mordiente cuando se usa en combinación con
colorantes. El ácido láctico preserva las estructuras fúngicas al provocar un cambio
de gradiente osmótico con relación al interior fúngico, lo que genera una película
protectora. El azul de algodón es un colorante ácido, que tiñe el citoplasma y la
quitina presente en las células fúngicas, mientras que el glicerol mantiene húmeda
la preparación. Una vez preparado el colorante, se debe colocar la muestra
microbiológica en un portaobjetos por medio de una impronta (proceso en el cual se
coloca una impresión de la muestra sobre una estructura utilizando una cinta
adhesiva transparente).
PREPARACION
a) Colocar el material necesario en la campana de seguridad tipo 2A.
b) Seleccionar las colonias para realizar las improntas.
c) Cortar segmentos de cinta adhesiva transparente aproximadamente de 1 cm.
d) Pegar los segmentos de cinta en un asa micológica.
e) Poner una gota de azul de algodón en el portaobjetos.
f) Con el lado adhesivo de la cinta, tocar la parte superior de hongo.
g) Colocar la cinta sobre la gota de azul de algodón y poner otra gota de azul
de algodón.
h) Poner un cubreobjetos sobre la preparación.
i) Observar en 40x.
Las estructuras fúngicas se observarán de color azul sobre un fondo blanco.
BIBLIOGRAFIA
Luis Esaú López-Jácome, Melissa Hernández-Durán, Claudia Adriana Colín-Castro,
Silvestre Ortega-Peña, Guillermo Cerón-González, Rafael Franco-Cendejas.
(marzo, 2014) Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Obtenido de
http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf
Covadonga Vázquez, Ana Martín, Mª Isabel de Silóniz, Susana Serrano,
Departamento de Microbiología III. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad
Complutense. Madrid. (2010). Técnicas básicas de Microbiología, Observación de
bacterias. Obtenido de
http://revistareduca.es/index.php/biologia/article/view/819/834