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12/03/2015
PREPARACIN DE MUESTRA PARA OBSERVACIN MICROSCPICA
(MONTAJES Y TCNICAS DE COLORACIN).
RESUMEN
El microscopio es una herramienta esencial debido a que nos facilita el estudio de los microorganismos
permitindonos diferenciar sus caractersticas morfolgicas; tales como: su forma, disposicin o agrupacin,
presencia o ausencia de estructuras (cpsulas, esporas, flagelos), movilidad, entre otras. La observacin de
estos microorganismos la podemos hacer de dos formas: observando microorganismos vivos sin colorear (en
fresco) u observando clulas muertas teidas con colorantes. El examen en fresco de los microorganismos
permite conocer algunas de sus caractersticas (morfologa, tamao, movimiento, etc.). Sin embargo, las
microorganismos vivos son casi incoloros y no se pueden visualizar fcilmente al microscopio ptico normal
cuando se encuentran suspendidos en agua, por lo que es ms factible que se utilicen colorantes para as
incrementar su contraste con el entorno que los rodea y de esta forma hacerlos visibles. En el presente
laboratorio se realizaron dos tcnicas de tinciones, como lo fue la tincin simple y diferencial o de Gram, que
se llevaron a cabo con unas cepas problema en donde se identificaron los tipos de microorganismos
pertenecientes a dichas cepas. Con el objetivo de adquirir destreza en la elaboracin de extendidos e
identificar diferentes tipos de tincin y de microorganismos realizando montajes al microscopio.
Palabras Claves: Microscopio, Tincin, Identificacin, extendido, frotis, Bacterias Gram positivas y Gram
negativas.
ABSTRACT
El microscope is an essential tool because it facilitates the study of the microorganisms allowing us to
differentiate its morphological characteristics; such as: shape, arrangement or grouping, presence or absence
of structures (spores, capsules, flagella), mobility, among others. The observation of these microorganisms
can do it in two ways: watching live microorganisms without coloring (in fresh) or watching dead cells
stained with dyes. Examination in fresco of microorganisms allows to know certain characteristics
(morphology, size, movement, etc.). However, the live microorganisms are nearly colorless not can easily
visualize normal optical microscope when they are suspended in water, so it is more feasible to use dyes to
increase their contrast with the surrounding environment and thus make them visible. In the present laboratory
two techniques were stains, as it was simple and differential staining or Gram, that were carried out with a
few strains problem where the types of microorganisms belonging to these strains were identified. In order to
acquire skills in the development of extended and identify different types of staining and microorganisms
performing mounts under a microscope.
Key words: Microscope, staining, ID, extended, smear, Gram positive bacteria and Gram negative.
1.

INTRODUCCIN.

El microscopio es una herramienta de gran


importancia para la observacin e identificacin
de los microorganismos, concretamente las
bacterias, las cuales pueden observarse
directamente al microscopio de campo claro.
Para observar bacterias al microscopio se utiliza
el objetivo de inmersin (mximo aumento). Para
ello se coloca sobre la preparacin una gota de
aceite de inmersin. Para enfocar con este
objetivo, colocar la preparacin con el aceite en la
platina del microscopio, aproximarla con el
tornillo macromtrico mirando desde fuera, hasta
que el objetivo toque el aceite.

Sin embargo, debido al bajo contraste entre las


clulas y su entorno, estos procedimientos se
utilizan en ocasiones muy limitadas, como por
ejemplo para la observacin de la movilidad
bacteriana.
Las tcnicas de tincin con diversos colorantes
facilitan la observacin al aumentar notablemente
el contraste, las tinciones ofrecen una
informacin adicional a la simple observacin de
la morfologa, ya que ponen de manifiesto
caractersticas de la pared celular o la existencia
de estructuras especiales, como las esporas
bacterianas.
En Microbiologa todas las tinciones se realizan a
partir de suspensiones de microorganismos

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extendidas en un portaobjetos (frotis), secadas y
fijadas.
La fijacin por calor es la ms utilizada para la
observacin de bacterias. Este procedimiento
consiste en pasar el portaobjetos, con la
suspensin bacteriana extendida y seca, a travs
de una llama de un mechero. La fijacin por calor
preserva la morfologa externa de los
microorganismos pero no las estructuras internas.
Todos los colorantes utilizados en microbiologa
tienen en comn la presencia de grupos
cromforos, grupos con dobles enlaces
conjugados que son los responsables del color
mediante la unin a estructuras celulares por
enlaces inicos, covalentes o hidrfobos, los que
establecen enlaces inicos son los ms frecuentes.

Diferenciar las bacterias Gram-negativas de


las Gram-positivas, utilizando la tcnica de
tincin de Gram.
Capacitar al estudiante en la elaboracin de
extendidos o frotis a partir de un cultivo de
microorganismos.
3.

MATERIALES Y EQUIPOS.

Cajas de Petri con cultivo de bacterias.


Reactivos de Gram.
Reactivos de tincin simple
Asa de siembra.
Microscpio.

Coloraciones microbiolgicas

Mechero.

Coloracin simple

Portaobjetos.

La coloracin de las bacterias por la aplicacin de


una solucin colorante simple en preparaciones
fijas o teidas se conoce como coloracin simple.
El frote fijo se inunda con la solucin colorante
durante un perodo establecido, despus de lo
cual el colorante se arrastra con agua y la lmina
se seca con papel secante.

Cubreobjetos.
Aceite de inmersin.
Suero fisiolgico.
Cubeta para recoger colorantes.
Frasco para desechar colorantes.
Papel Absorbente.

Coloracin diferencial
Los procedimientos de coloracin que ponen de
manifiesto diferencias entre las clulas
bacterianas se conocen como tcnica de
coloracin diferencial.

4.

Para la elaboracin del frotis y la posterior tincin


de Gram se procedi de la siguiente manera:
1.

Coloracin de Gram
Esta tcnica diferencial es una de las de uso ms
comn en microbiologa. En este procedimiento,
el frote bacteriano teido se somete a las
soluciones siguientes:
a

Cristal violeta

Solucin de yodo, alcohol.

Safranina.

2.

3.
4.

2.

OBJETIVOS.

Adquirir destreza en la elaboracin de


extendidos e identificar diferentes tipos de
tincin y de microorganismos realizando
montajes al microscopio.

PROCEDIMIENTO.

Se coloc una gota de solucin salina


sobre el portaobjetos limpio y libre de
grasas, y sobre sta la muestra de las
bacterias tomada de los dientes.
La muestra se coloc realizando
movimientos en forma de espiral con el
fin de crear un pelcula delgada de
muestra.
Se dej secar el frotis a temperatura
ambiente.
Luego se fij la muestra pasndola tres
veces a travs de la llama.

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5.

Se verti el cristal violeta sobre la


muestra y se dej actuar por 1 minuto.
6. Se enjuag con agua y se escurri
7. Se agreg la solucin de Lugol y se dej
actuar por un minuto.
8. Se escurri la solucin y se enjuag el
portaobjetos con agua corriente.
9. Se decolor con el alcohol-acetona por 5
segundos y se enjuag con agua
corriente.
10. Se agreg la solucin de Safranina y se
dej actuar por 30 segundos, se enjuag,
se escurri y por ltimo se dej secar al
aire.

Finalmente se llev la muestra al


microscopio
para realizar la observacin de las bacterias Gram
positivas y Gram negativas, con el objetivo de
100X.

5.

RESULTADOS.

Tincion simple:

Figura 1. Tincion simple del cultivo de bacterias


problema al objetivo 10X se observa la dispersion
de las celulas por el frotis realizado en la placa.
Se observa la clula bacteriana teida, denotando
su forma de bacilo y su disposicion a lo largo y
ancho del campo del microscopio, presentandose
de forma individual o en agrupaciones.

Tincin de Gram:

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Figura 2. Tincin de Gram a las bacterias


problema en objetivo 100X (con aceite de
inmersin). Se observa la coloracin violeta o
morada caracterstica de las bacterias Gram
positivas por la composicin qumica de su pared,
siendo as bacilos Gram positivos.

Figura 4: Zoom o acercamiento de la figura 3. Se


observa la forma cilndrica de los bacilos Gram
positivos (flecha roja) de la muestra de bacterias
utilizadas en el laboratorio.
6.

ANALISIS DE RESULTADOS.

Muchos de nosotros conocemos las bacterias slo


como "grmenes", criaturas invisibles que pueden
invadir el cuerpo y hacer que nos enfermemos.
Pocos saben que muchas bacterias no slo
coexisten con nosotros todo el tiempo, pero nos
ayudan a hacer una increble variedad de cosas
tiles, como hacer que las vitaminas, rompen un
poco de basura, e incluso mantener nuestra
atmsfera.

Figura 3. Tincin de Gram para otra colonia de


bacterias del laboratorio observada a un objetivo
de 100X. Ntese la presencia de bacilos Gram
positivos, esto es evidente por su coloracin
violeta.

Las bacterias se componen de una sola clula,


pero no dejes que su pequeo tamao y aparente
simplicidad le engaen. Son un grupo
increblemente complejo y fascinante de las
criaturas. Las bacterias se han encontrado que
puede vivir en temperaturas por encima del punto
de ebullicin y en fro que congela la sangre.
Ellos se "comen" todo de azcar y el almidn a la
luz solar, el azufre y el hierro. Incluso hay una
especie de Deinococcus radiodurans a bacterias
-que pueden soportar explosiones de radiacin
1.000 veces mayor que el que matar a un Lo ms
distintivo para las bacterias es el tamao, las
mayora de las bacterias tienen un tamao tal que
resultan difciles de ver con el microscopio
ptico. La principal dificultad es la falta de
contraste entre la clula y el medio que la rodea, y
el medio ms simple de aumentar el contraste es
la utilizacin de colorantes. Estos pueden
emplearse para distinguir entre tipos diferentes de
clulas o para revelar la presencia de
determinados constituyentes celulares, tales como
flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares,
centros de actividad respiratoria, etc. Las clulas
generalmente son tratadas para coagular el

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protoplasma antes de teirlas, proceso llamado
fijacin. Para bacterias, la fijacin por el calor es
lo ms corriente, aunque tambin puede fijarse
con sustancias qumicas como formaldehido,
cidos y alcoholes. Despus de la fijacin, si se
aade el colorante, no se producen ulteriores
cambios estructurales en el protoplasma. La
fijacin se realiza habitualmente en clulas que
han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando
despus ste con el agente fijador, y siguiendo
inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin
produce habitualmente el encogimiento de las
clulas; la tincin, por el contrario, hace que las
clulas aparezcan mayores que lo que es
realmente, de manera que las medidas de las
clulas que han sido fijadas o teidas no pueden
realizarse con mucha precisin. La mayora de los
colorantes son compuestos orgnicos que tienen
alguna afinidad especfica por los materiales
celulares. Muchos colorantes utilizados con
frecuencia son molculas cargadas positivamente
(cationes) y se combinan con intensidad con los
constituyentes celulares cargados negativamente,
tales como los cidos nucleicos y los
polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes
catinicos son el azul de metileno, el cristal
violeta y la safranina. Otros colorantes son
molculas cargadas negativamente (aniones) y se
combinan con los constituyentes celulares
cargados positivamente, tales como muchas
protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la
fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de
colorantes son sustancias liposolubles; los
colorantes de este grupo se combinan con los
materiales lipdicos de la clula, usndose a
menudo para revelar la localizacin de las
cotcelas o depsitos de grasa. Un ejemplo de
colorante liposoluble es el negro Sudn. Algunos
colorantes teirn mejor slo despus de que la
clula haya sido tratada con otra sustancia
qumica, que no es un colorante por s mismo.
Esta sustancia se denomina mordiente; un
mordiente habitual es el cido tnico. El
mordiente se combina con un constituyente
celular y lo altera de tal modo que ahora s podr
atacar el colorante. Si se desea simplemente
incrementar el contraste de las clulas para la
microscopa, son suficientes los procedimientos
simples de tincin. El azul de metileno es un buen
colorante simple que acta sobre todas las clulas
bacterianas rpidamente y que no produce un
color tan intenso que oscurezca los detalles
celulares. Es especialmente til para detectar la
presencia de bacterias en muestras naturales,
puesto que la mayor parte del material no celular
no se tie. La tincin negativa es el reverso del

procedimiento de tincin usual: las clulas se


dejan sin teir, pero se colorea en cambio el
medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el
perfil de las clulas. La sustancia utilizada para la
tincin negativa es un material opaco que no tiene
afinidad por los constituyentes celulares y que
simplemente rodea las clulas, tal como la tinta
china (que es una suspensin de partculas de
carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante
negro insoluble en agua). La tincin negativa es
un modo satisfactorio de aumentar el contraste de
las clulas en la microscopia ptica, pero su
mxima utilidad est en revelar la presencia de
cpsulas alrededor de las clulas bacterianas. Los
mtodos de tincin son de gran utilidad, pero
deben usarse siempre con precaucin, ya que
pueden conducir a errores. Las molculas de
colorante forman en ocasiones precipitados o
agregados que parecen estructuras celulares
autnticas,
pero
que
son
formaciones
completamente artificiales inducidas por el
mismo colorante. Tales estructuras se denominan
artefactos, y deben tomarse muchas precauciones
para tener la seguridad de que no nos estamos
equivocando al creer que un artefacto es una
estructura realmente existente.
Como ya es sabido la tincin de Gram permite
clasificar a las bacterias en dos grande grupos:
bacterias Gram positivas y bacterias Gram
negativas, todo ello enmarcado a la constitucin
de la pared que estas poseen. Como ya es sabido
la tincin de Gram permite clasificar a las
bacterias en dos grande grupos: bacterias Gram
positivas y bacterias Gram negativas, todo ello
enmarcado a la constitucin de la pared que estas
poseen. Mediante la prctica de laboratorio
pudimos aprender a realizar la tincin de Gram
empleando para ello muestras de bacterias
obtenidas del sarro de los dientes, dicha muestra
como lo pudimos expresar en los resultados
arrojo la presencia de bacterias en forma de cocos
y bacilos, las cuales en su mayor parte
presentaron una coloracin rosada, lo que permite
inferir que corresponden a bacterias Gram
negativas; tambin se observaron bacterias Gram
positivas pero en un numero significativamente
menor que las ya mencionadas. Cabe decir que
observar estas bacterias inicialmente fue algo
complicado pues hubo problemas al momento de
realizar la tincin, ms sin embargo alguno de
nuestros compaeros muy generosamente nos
prestaron un campo de su muestra para poder
observar las bacterias.
La tincin de Gram es uno de los mtodos de
tincin ms importantes en el laboratorio

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bacteriolgico y con el que el estudiante debe
estar perfectamente familiarizado. Su utilidad
prctica es indiscutible y en el trabajo
microscpico de rutina del Laboratorio de
Microbiologa las referencias a la morfologa
celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos,
negativos, etc.) se basan justamente en la tincin
de GRAM, esta tincin se denominada as por el
bacterilogo dans Christian Gram, quien la
desarroll en 1844. Sobre la base de su reaccin a
la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse
en dos grupos, Gram positivas y Gram negativas
(en este caso, los trminos positivo y negativo no
tiene nada que ver con carga elctrico, sino
simplemente designan dos grupos morfolgicos
distintos de bacterias). Las bacterias Gram
positivas y Gram negativas tien de forma
distinta debido a las diferencias constitutivas en la
estructura de sus paredes celulares. La pared de la
clula bacteriana sirve para dar su tamao y
forma al organismo as como para prevenir la lisis
osmtica. El material de la pared celular
bacteriana que confiere rigidez es el
peptidoglicano. La pared de la clula Grampositiva es gruesa y consiste en varias capas
interconectadas de peptidoglicano as como algo
de cido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la
pared de la clula Gram positiva es
peptidoglicano. La pared de la clula Gramnegativa, por otro lado, contiene una capa mucho
ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est
rodeada por una membrana exterior compuesta de
fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas.
Slo 10% - 20% de la pared de la clula Gramnegativa es peptidoglicano. Debido a su
importancia en taxonoma bacteriana y a que
indica diferencias fundamentales de la pared
celular de las distintas bacterias, describiremos
aqu con algn detalle la tincin de Gram y las
interpretaciones que actualmente se hacen sobre
el porqu de su funcionamiento. Las clulas
fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien,
primero con una solucin de cristal violeta (otros
colorantes bsicos no son tan efectivos) y son
lavadas despus para quitar el exceso de
colorante. En este estado, todas las clulas, tanto
las Gram positivas como las Gram negativas,
estn teidas de azul. El portaobjetos se cubre
entonces con una solucin de yodo-yoduro
potsico. El ingrediente activo es aqu el I2; el KI
simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2
entra en las clulas y forma un complejo
insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo
tanto las clulas Gram positivas como las gram
negativas se encuentran en la misma situacin. Se
lleva a cabo despus la decoloracin, usando una

mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que


es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos
organismos (Gram positivos) no se decoloran,
mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La
diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas
est por tanto en su resistencia a la decoloracin;
esta resistencia se debe probablemente al hecho
de que en el caso de bacterias Gram-negativas, la
mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico
y disuelve la membrana exterior de la pared de la
clula (y tambin puede daar la membrana
citoplsmica a la que se une peptidoglicano). La
delgada capa de peptidoglicano es incapaz de
retener el de complejo cristal violeta-yodo y la
clula se decolora. Las clulas Gram positivas, a
causa de sus paredes celulares ms espesas
(tienen ms peptidoglicano y menos lpido), no
son permeables al disolvente ya que ste
deshidrata la pared celular y cierra los poros,
disminuyendo as el espacio entre las molculas y
provocando que el de complejo cristal violetayodo quede atrapado dentro de la pared celular.
Despus de la decoloracin las clulas Gram
positivas son todava azules, pero las Gram
negativas son incoloras. Para poner de manifiesto
las clulas Gram negativas se utiliza una
coloracin de contraste. Habitualmente es un
colorante de color rojo, como la safranina o la
fucsina bsica. Despus de la coloracin de
contraste las clulas Gram negativas son rojas,
mientras que las Gram positivas permanecen
azules. Deben destacarse algunos aspectos
cruciales de la tincin de Gram:
1) El tratamiento con cristal violeta debe
preceder al tratamiento con yodo. El
yodo por s solo tiene poca afinidad con
las clulas.
2) La decoloracin debe realizarse con poca
agua para evitar que pierdan la tincin las
clulas Gram positivas. EI proceso de
decoloracin debe ser corto y es esencial
un clculo preciso del tiempo para
obtener resultados satisfactorios.
3) Cultivos ms viejo de 24 horas pueden
perder su habilidad de retener el
complejo cristal violeta - yodo.
El carcter de Gram positivo no es siempre un
fenmeno del todo o nada. Algunos organismos
son ms Gram positivos que otros y algunos son
Gram-variables, es decir, unas veces Gram
positivos y otras Gram negativos.

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7.

CONCLUSIONES.

Las bacterias se encuentran cargadas


negativamente por lo que al agregar el azul
de metileno en el frotis, ste penetra en el
interior de la clula y la tie, permitiendo as
observar las forma y la disposicin de las
bacterias.
Al parecer las bacterias Gram positivas
durante la etapa de decoloracin, el alcohol
contrae los poros de la gruesa capa de
peptidoglicano; y en consecuencia el
complejo cristal Violeta-Lugol queda
retenido dentro de la clula y las bacterias
adquieren un color azul-violeta.
En la tincin diferencial o de Gram se
observa que dependiendo de la naturaleza de
la pared celular de la bacteria se tie de
rosado o fucsia.

8.

CUESTIONARIO.

1.

Qu es un frotis y para que se utiliza?

Se denomina frotis a la extensin que se realiza


sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo
con objeto de separar lo ms posible los
microorganismos, ya que si aparecen agrupados
en la preparacin es muy difcil obtener una
imagen clara y ntida.
2.

Qu es una tincin y cuantos tipos


existen? Escribe la tcnica de
preparacin de cada uno de ellos.

Tincin: Es el proceso por el cual las molculas


de un colorante se adsorben a una superficie. El
uso de colorantes permite cambiar el color de las
clulas de los microorganismos y poder realizar la
observacin en microscopio ptico.
Dado que las bacterias son casi incoloras, no
presentan contraste con el medio en el cual se
encuentran suspendidas y no pueden observarse
claramente sin algn tratamiento previo. De
acuerdo a la reaccin que ocurre, existen
diferentes tipos de tincin: Tincin simple y
tincin diferencial (Ortega et al. 2009).
a.

Tincin simple:

La tincin simple se basa en la afinidad del


colorante por los componentes celulares. La

tincin puede ser uniforme o presentar algunos


grnulos en su interior. Utiliza un solo colorante
(violeta de genciana, azul de metileno, fucsina
diluida).La tincin simple se utiliza para destacar
el microorganismo completo para que se vean las
formas y las estructuras celulares bsicas. En las
tinciones simples se usa un nico reactivo, que
preferentemente es de tipo bsico y contiene un
cromgeno (compuesto que da color al tinte) con
carga positiva, ya que la pared celular de las
bacterias posee componentes con carga negativa
que atraen y enlazan el cromgeno. Se utilizan
solamente para incrementar el contraste; todas las
clulas absorbern el colorante y quedarn teidas
del mismo color. Por tanto, la tincin simple
mejora la observacin de la clula completa. Se
fija el espcimen, se aade el colorante y se deja
el tiempo adecuado para que se absorba, se retira
el exceso de colorante y la preparacin ya est
lista para ser observada. Si se utiliza un mordiente
(sustancia qumica utilizada para intensificar la
coloracin), hay que aadirlo justo antes del
colorante.
b.

Tcnica:

Las tinciones simples se realizan sobre


preparaciones previamente secadas. Sobre un
portaobjetos
con
una
suspensin
de
microorganismos previamente secada y fijada a la
llama, se vierte una solucin diluida de un
colorante y se mantiene durante uno o dos
minutos; a continuacin se lava varias veces con
agua y se seca. Debido a que las clulas son muy
pequeas, este tipo de preparacin suele
observarse con aceite de inmersin en la lente
objetivo. En la tincin simple se utilizan tintes
como safranina, azul de metileno, cristal violeta y
carbolfuesina.
c.

Tincin diferencial

Las tinciones diferenciales son aquellas tinciones


que se usan para diferenciar de manera ms
explcita los microorganismos. Estas tinciones
utilizan los colores antes diferenciales, que se
componen de ms de una sustancia tintrea. En
algunas tcnicas de coloracin, las tinciones
diferenciales ms importantes que se emplean en

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bacteriologa son las de Gram y la tincin cidoresistente. Ambas tinciones se utilizan para
obtener informacin acerca de la composicin de
las capas de la pared celular de las clulas
bacterianas.
La tincin diferencial requiere el uso de al menos
3 reactivos qumicos que se aplican en secuencia a
un frotis fijado por calor. El primer reactivo es
llamado tincin primaria o colorante primario.
Su funcin es impartir color a todas las clulas.
Con el objetivo de establecer un contraste de
color, el segundo reactivo usado es un agente
decolorante, el cual puede decolorar la clula
completa o solo parte de ella. El reactivo final, el
colorante de contraste, le da a las clulas
decoloradas un color que contrasta con el del
colorante primario. El colorante de contraste no
puede ser absorbido por clulas que no han
perdido el colorante primario. De esta manera,
tipos de clulas o sus estructuras se pueden
distinguir unas de otras en funcin del colorante
que es absorbido. El mtodo de tincin diferencial
ms importante usado en bacteriologa es la
tincin de Gram, llamada as en honor al Dr. Hans
Christian Gram. Este mtodo divide las bacterias
en dos grandes grupos, las Gram-negativas y las
Gram-positivas. Esto es esencial para la
clasificacin
y
diferenciacin
de
microorganismos. La reaccin a la tincin de
Gram est basada en la diferencia en la
composicin qumica de la pared celular
bacteriana. Las bacterias Gram positivas tienen
una gruesa capa de peptidoglicano o murena,
mientras que esta capa es ms fina en las Gramnegativas y est rodeada por una bicapa lipdica
externa. El Peptidoglicano es un polisacrido
formado por dos subunidades qumicas, N-acetil
glucosamina y cido Nacetilmurmico.
d.

Tincin Primaria: Se utiliza Cristal Violeta,


que tie todas las clulas moradas.
Mordiente: Yodo o lugol. El yodo, aparte de
matar bacterias, incrementa la afinidad del
colorante primario con la clula, formando
complejos insolubles con este. El complejo
cristal violeta-yodo sirve para intensificar el
color del tenido.

e.

f.

Agente decolorante: Se utiliza alcohol


etlico al 95%. El etanol tiene doble funcin:
deshidratante de protenas y solvente de
lpidos. El alcohol disuelve los lpidos de la
parte externa de la pared celular Gramnegativa, haciendo la pared ms porosa. De
esta manera, el complejo Cristal violeta-yodo
es removido de la capa de mureina ms fina
de las bacterias Gramnegativas, mientras que
la pared ms gruesa de las Gram-positivas
retiene el tinte en su interior.
Tincin de Contraste: Safranina. Este tinte
se utiliza para teir de rojo las clulas
previamente decoloradas, o sea, las Gramnegativas.
3.

Qu es un colorante y como se
combinan
con
los
diferentes
componentes celulares?

Un colorante se define como una sustancia capaz


de dar color a clulas, tejidos, fibras, etctera. De
acuerdo con su origen, se pueden dividir en:
colorantes naturales, los cuales son extrados de
plantas o animales, y colorantes artificiales, que
son aquellos de minerales procesados y
manipulados en el laboratorio. Qumicamente, el
colorante est constituido de un componente
cromforo y un auxcromo. El cromforo es todo
grupo aislado, covalente e insaturado, que tiene
una absorcin caracterstica en la regin
ultravioleta o visible; dicho de otra forma, es la
capacidad que tiene la molcula para que sus
electrones absorban energa o luz visible, se
exciten y emitan diversos colores de acuerdo con
la longitud de emitida como resultado del cambio
en el nivel energtico. Cabe mencionar que esta
longitud de onda corresponde al rango de espectro
visible. Los cromforos se pueden presentar en
dos formas fundamentales: en sistemas
conjugados pi o complejos metlicos. Los
cromforos
son
principalmente
grupos
funcionales con dobles y triples enlaces carbonocarbono, anillos aromticos, grupos carbonilos,
imino, diazo, nitro y enlaces entre carbono-y (y es
un tomo con pares libres).Los aux- cromos son
grupos funcionales o radicales que constituyen
una molcula y poseen carga parcial positiva;
tienen la funcin de intensificar la formacin de

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color mediante la accin de grupos de tomos no
saturados; su funcin es desplazar a los
cromforos hacia longitudes de ondas largas para
aumentar la intensidad. Los siguientes grupos
funcionales son considerados auxcromos: grupo
metilo, halgenos, hidroxi, alcoxi y amino. Los
colorantes
son catinicos y se combinan
fuertemente con componentes celulares cargados
negativamente, como los cidos nucleicos y los
polisacridos cidos (las envueltas externas de los
microorganismos estn por lo general cargadas
negativamente).
4.

Qu es
ejemplos.

un

mordiente?

Mencione

Los mordientes, aunque no son colorantes, tienen


gran importancia en algunas tcnicas de tincin.
Los mordientes intensifican la tincin porque
aumentan la afinidad de la clula por el colorante.
Tambin se pueden utilizar para producir un
engrosamiento de ciertas estructuras celulares
externas, como los flagelos, que debido a su
delgadez no podran ser visualizados de otra
forma. Los mordientes empleados suelen ser sales
metlicas, cidos o bases, como, por ejemplo, una
solucin diluida de yodo. El Lugol acta como
mordiente aumentando la afinidad del colorante
por la bacteria.
5.

una mezcla de antibiticos, como el medio de


Thayer-Martin (con vancomicina, nistatina,
colimicina
y
trimetoprim-sulfametoxazol).
Requiere una atmsfera con 5-10% de CO2
( Ryan & Ray. 2004 ).

Mencione ejemplos de tres bacterias


Gram positivas y tres Gram negativas.
Seale su importancia.

GRAM NEGATIVAS:
Neisseria gonorrhoeae (gonococo) es un
diplococo Gram negativo, oxidasa positivo, que
causa la gonococia, una enfermedad de
transmisin sexual que se presenta en los
humanos. Se diferencia de otros tipos de Neisseria
por la prueba de la fermentacin de carbohidratos,
fermentando solamente a la glucosa. Se
caracteriza por ser de difcil cultivo, siendo muy
exigente a nivel nutricional y a la vez muy
sensible a sustancias que se encuentran en los
medios de cultivo corrientes. Suele utilizarse para
este fin medios no selectivos enriquecidos con
factores de crecimiento o selectivos, logrado con

Neisseria gonorrhoeae
Haemophilus influenzae, anteriormente llamado
bacilo de Pfeiffer o Bacillus influenzae, son
cocobacilos Gram-negativo no mviles descritos
en 1892 por Richard Pfeiffer durante una
pandemia de gripe. Es generalmente aerobio pero
puede crecer como anaerobio facultativo. H.
influenzae fue considerado errneamente como la
causa de la gripe comn hasta 1933, cuando la
etiologa viral de la gripe lleg a ser aparente. Sin
embargo, H. influenzae es responsable de un
amplio rango de enfermedades como meningitis,
epiglotitis, neumona, sepsis y otras de menor
gravedad.
Debido a su pequeo genoma, H. influenzae fue el
primer organismo de vida libre cuyo genoma
completo fue secuenciado, por Craig Venter. Su
genoma consiste de 1.830.140 pares de bases y
contiene 1.740 genes (Fleischmann et al. 1995).

Haemophilus influenzae

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Escherichia coli (pronunciado /eske'rikia 'koli/),
tambin conocida por la abreviacin de su
nombre, E. coli, es quizs el organismo procariota
ms estudiado por el ser humano. Se trata de una
enterobacteria que se encuentra generalmente en
los intestinos animales, y por ende en las aguas
negras, pero se lo puede encontrar en todos lados,
dado que es un organismo ubicuo. Fue descrita
por primera vez en 1885 por Theodore von
Escherich, bacterilogo alemn, quien la
denomin Bacterium coli. Posteriormente la
taxonoma le adjudic el nombre de Escherichia
coli, en honor a su descubridor. Esta y otras
bacterias son necesarias para el funcionamiento
correcto del proceso digestivo, adems de
producir las vitaminas B y K. Es un bacilo que
reacciona negativamente a la tincin de Gram
(gramnegativo), es anaerobio facultativo, mvil
por flagelos pertricos (que rodean su cuerpo), no
forma esporas, es capaz de fermentar la glucosa y
la lactosa y su prueba de IMVIC es ++--. Es una
bacteria utilizada frecuentemente en experimentos
de gentica y biologa molecular (Fleischmann et
al. 1995).
Escherichia coli
GRAM POSITIVAS:
Clostridium botulinum es el nombre de una
especie de bacilo (Gram positiva anaerobia) que
se encuentra por lo general en la tierra y es
productora de la toxina botulnica, el agente
causal del botulismo. Estos microorganismos
tienen forma de varilla y se desarrollan mejor en
condiciones de poco oxgeno. Las bacterias
forman esporas que les permiten sobrevivir en un
estado latente hasta ser expuestas a condiciones
que puedan sostener su crecimiento. La espora es
ovalada subterminal y deformante. Es mvil por
flagelos peritricos, no produce cpsula y es
proteoltico y lipoltico. Son miembros del gnero
Clostridium. Uno de los grupos ms numerosos
entre las formas Gram positivas (C. botulinum)
fue descubierta y aislada en 1896 por Emile van
Ermengem.3
Hay ocho tipos de toxinas botulnicas designadas
por las letras A hasta la H; slo los Clostridium
botulinum es un organismo de agua de un grado

de salinizacion alto, sus esporas pueden sobrevivir


en la mayora de los ambientes y son difciles de
destruir incluso a la temperatura de ebullicin del
agua a nivel del mar, de modo que muchos
enlatados son hervidos a altas presiones para
destruir las esporas (Madigan & martinko. 2005).

Clos
tridium botulinum
Lactobacillus plantarum es una bacteria de la
familia Lactobacillaceae, capaz de realizar la
fermentacin lctica, siendo una de los principales
responsables por el proceso productivo del
chucrut as como de otros alimentos. Comnmente
es encontrado tanto en diversos productos
fermentados y tambin se presenta en la saliva (de
la cual es aislada). Tiene la habilidad de licuar la
gelatina. El genoma de L. plantarum es una de los
ms conocidos entre las bacterias cido lcticas.
La variedad Lactobacillus plantarum 3547
(Lp3547) tiene aplicaciones en el campo de los
alimentos probiticos, pudiendo ser publicitado
como tal en la Unin Europea (Niedzielin et al.
2001).

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Streptococcus pneumoniae
9.
L
actobacillus plantarum
Streptococcus
pneumoniae,
es
un
microorganismo patgeno capaz de causar en
humanos diversas infecciones y procesos
invasivos severos. Se trata de una bacteria Gram
positiva de 1,2-1,8 m de longitud, que presenta
una forma oval y el extremo distal lanceolado. Es
inmvil, no forma endosporas, y es un miembro
alfa-hemoltico del gnero Streptococcus. General
mente, se presenta en forma de diplococo, por lo
que inicialmente fue denominado Diplococcus
pneumoniae, aunque existen algunos factores que
pueden inducir la formacin de cadenas.
Neumococo es un patgeno casi exclusivamente
humano causante de un gran nmero de
infecciones (neumona, sinusitis, peritonitis, etc) y
de procesos invasivos severos (meningitis, sepsis,
etc), particularmente en ancianos, nios y
personas inmunodeprimidas. Es el principal
microorganismo causante de Neumonia adquirida
en la comunidad (NAC).El hbitat natural de
neumococo es la nasofaringe humana y la
colonizacin puede tener lugar durante los
primeros das de vida.Metablicamente hablando,
neumococo es un microorganismo microaerfilo,
catalasa negativo, que se encuentra dentro del
grupo de las bacterias cido lcticas, ya que este
compuesto es el principal producto resultante de la
fermentacin de carbohidratos (Ryan & Ray.
2004).

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http://es.scribd.com/doc/809985
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