PRÁCTICA Nº2.

COLORACIÓN DE MICROORGANISMOS

RESUMEN
La práctica se realizó con el objetivo de identificar las técnicas de coloración más comunes utilizadas
como la Tinción de Gram para observar la morfología y estructura de las bacterias. Inicialmente, se
tomaron muestras de cuatro bacterias: ​Escherichia Coli​, ​Staphylococcus aureus​, ​Bacillus cereus y
Pseudomona aeruginosa​, con las cuales se realizó un extendido por cada una de ellas y se aplicó la
tinción de Gram. Finalmente, se observó como resultado de las tinciones, bacterias Gram positivas (+)
y Gram negativas (-). De lo anterior se puede concluir que las bacterias difieren química y
estructuralmente, por medio de la tinción de Gram de las mismas se puede distinguir las células
bacterianas entre organismos Gram positivos y Gram negativos debido a que este método permite el
estudio de la célula bacteriana y sus estructuras internas tales como la pared celular y así mismo,
proporciona contraste entre el microorganismo y el medio que lo rodea.
Palabras clave:​ Tinción de Gram, estructura, Coloración, peptidoglicano, pared celular.

INTRODUCCIÓN

Una de las formas de observar los microorganismos es mediante la observación directa de los
extendidos de cultivos bacterianos en el microscopio, pero si se desea observar de una mejor manera
la morfología de las bacterias, resulta mejor observar un extendido coloreado por algún método de
tinción diferencial. Es importante conocer la forma de las bacterias porque permite clasificarlas y
reconocerlas. Y poder actuar de la manera correcta dependiendo del objetivo que se plantee. Las
tinciones diferenciales son usadas con el propósito de diferenciar y poder observar de una mejor
manera la morfología de los microorganismos, en estas coloraciones se utilizan colorantes
diferenciales que se componen de sustancias tintóreas que tiñen partes de los microorganismos
haciéndolas más visibles y permitiendo identificar el tipo de microorganismo. Mediante la
observación microscópica de estos extendidos coloreados es posible (segun la tecnica utilizada),
diferenciar microorganismos, observar su morfología, tamaño y agrupación o la observación de
ciertos elementos no habituales, como flagelos, cápsula o endosporas (Tortora, 2007).

Entre las técnica más utilizadas para la tinción se puede encontrar:coloración de Gram, coloración de
cápsula y coloración de esporas. Dependiendo de lo que se quiera observar en un microorganismo se
utiliza cada técnica, por ejemplo la tinción de Gram permite hallar la organización de la pared celular
de las bacterias. Por lo tanto algunas bacterias producen en su interior formas de resistencia
denominadas endosporas las cuales pueden ser observadas mediante la coloración de esporas. La
coloración de cápsula permite ver la cápsula bacteriana, la cual es una capa de material viscoso y su
tamaño depende del ambiente en que se encuentre (Negroni, 2009).

OBJETIVO
Identificar las técnicas de coloración más comunes para identificar morfología y estructura de
bacterias.
 MATERIALES Y MÉTODOS

Al realizar la coloración de las cuatro bacterias: ​Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus
cereus y Staphylococcus aureus​, se empleó una tinción de Gram, que consiste inicialmente en
extender y fijar las bacterias en una placa usando el asa esterilizada en un medio estéril, seguidamente,
se procedió a cubrir la placa con cristal violeta por un minuto, una vez transcurrido el tiempo se lava
con agua destilada y se deja escurrir, para continuar con la coloración se cubrió la lámina con solución
de lugol por un minuto. Continuando con la práctica, se lavó la lámina con agua destilada, en una
posición inclinada y se decolora la lámina con alcohol-acetona por 20 segundos. Así mismo, se cubrió
la lámina con safranina por 30 segundos y nuevamente se lavó con agua destilada, posteriormente se
dejó escurrir y secar con ayuda del mechero a una distancia prudente para permitir observar los
microorganismos bajo el microscopio.

RESULTADOS

En la ​Figura 1​. a continuación, se observaron bacterias en forma de bacilos teñidas de color rosado.

Figura 1. ​Tinción de Bacterias ​E.Coli a​ 100x.

En la ​Figura 2.​, se observa la tinción de Gram para la ​Pseudomonas aeruginosas​, que muestra una
coloración rosa, de la misma forma, se puede observar que alguna de las ​Pseudomonas a. se
encuentran en proceso de necrosis que se puede apreciar por m edio de bacterias con una coloración
rosa menos intensa. Además, presenta contaminación por otro tipos de bacterias que toman una
coloración violeta.
 Figura 2​.Tinción de​ ​Bacterias ​Pseudomonas A. 1​ 00x.

En la Figura 3. se observa la tinción de Gram para las Bacterias ​B. Cereus las cuales presentan
coloración violeta, poseen forma de bacilos de tipo estreptobacilos debido a que se encuentra un
bacilo detrás del otro en especie de cadena, adicionalmente se pueden observar algunas bacterias en
proceso de muerte debido a una coloración más claras.

Figura 3. ​Tinción de Bacterias ​B. Cereus a 100x.

En la ​Figura 4. correspondiente a la tinción de ​Staphylococcus aureus, se observó un patrón en forma

de racimos y de una coloración violeta.

Figura 4​. Tinción de bacterias de ​S. Aureus a 100x.

DISCUSIÓN
Las bacterias presentan una membrana interna que rodea el citoplasma bacteriano y presenta ciertas
características propias en ellas. En el exterior de la membrana interna las bacterias presentan una
pared celular formada por un polímero complejo denominado peptidoglucano. Algunos tipos de
bacterias tienen una segunda membrana (membrana externa) que recubre la capa de peptidoglucano
por su parte exterior. En las bacterias que tienen esta membrana externa (bacterias Gram-negativas), el
espesor de la capa de peptidoglucano es más reducido que en las que carecen de ella (Bacterias
Gram-positivas) (Tortora, 2010).

Como se ha indicado anteriormente, la mayoría de las bacterias pueden clasificarse en uno de dos
grupos diferenciables por medio de la tinción de Gram. Las bacterias Gram-positivas y las
Gram-negativas. Dentro del grupo de las bacterias Gram-negativas se encuentran: la ​Escherichia coli
(​Figura 1.​) y la Pseudomona A​. (​Figura 2.​), Tú aire y por consiguiente hubo contaminación cruzada,
esto se puede evidenciar porque además de la ​Escherichia Coli y la Pseudomona A.​ se observan
bacterias Gram-positivas ​http://45.238.216.28/bitstream/123456789/4577/1/TUAMSS001-2013.pdf​.
Por otro lado, en la ​Figura 2. correspondiente a Pseudomonas A​. se puede evidenciar la misma por lo
que se pueden apreciar bacterias con una coloración rosa un poco más clara.
El otro tipo de bacterias que se diferencia por medio de la tinción de Gram, son las Gram-positivas, se
encuentra la ​Staphylococcus aureus ​(F ​ igura 3​.) y Bacillus cereus ​(​Figura 4​.)​, esto se pudo verificar
en la práctica ya que se observó el color púrpura en las células de estas bacterias, se tiñeron de este
color ya que al entrar en contacto con el alcohol se contraen los poros de la gruesa capa de
peptidoglicano y se retiene el colorante yoduro, además la pared celular de las bacterias Gram +, al
tener una capa gruesa de peptidoglucano estas también contienen ácido teicoicos, que es un
compuesto principalmente por un alcohol (Ej: glicerol o ribitol) y fosfato. Este ácido contribuye al
desarrollo celular al prevenir la ruptura de la pared celular y reducir el riesgo por lisis.
https://s3.amazonaws.com/academia.edu.documents/43169930/MorfologiayEstructuraBacteriana.pdf?
response-content-disposition=inline%3B%20filename%3DTEMAS_DE_BACTERIOLOGIA_Y_VIR
OLOGIA_MEDIC.pdf&X-Amz-Algorithm=AWS4-HMAC-SHA256&X-Amz-Credential=AKIAIW
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f70088c3ebd0a2f6cba07bc1951a535d24a1e3335ce326bd7b37
Ve este link no se deja ver

La pared celular de las Gram - está compuesta por una capa o muy pocas capas de peptidoglucano y
una membrana externa. El peptidoglucano está unido a lipoproteínas de la membrana externa y esta se
encuentra en el periplasma (espacio que rodea al citoplasma de algunas células procariotas), a
diferencia de las Gram +, estas no cuentan con acido teicoicos y el hecho de que contenga una escasa
capa de peptidoglucanos las hace susceptible a la rotura mecánica. Esto se ve muy influenciado a la
hora de la tinción de Gram, al momento de agregar el alcohol, ya previamente con la solución de
cristal violeta más el mordiente (lugol), la aplicación del alcohol deshidrata el peptidoglucano de las
células Gram + y las torna aún más impermeables al cristal violeta más el mordiente. En el caso de las
células Gram -, dado que el alcohol disuelve la membrana externa de las células, esta crea una delgada
capa de peptidoglicano con orificios por el cual se difunde el cristal violeta, en este momento las
bacterias Gram - son incoloras por consiguiente se agrega la safranina el cual es una tinción simple y
esta cumple la función de contrastar [8].

CONCLUSIONES
Para una buena observación de las células se deben realizar el método cuidadosamente, un buen
extendido y seguir los pasos cronometrando los tiempos.

Las bacterias difieren química y estructuralmente, por medio de la tinción de Gram de las mismas se
puede distinguir las células bacterianas entre organismos Gram positivos y Gram negativos debido a
que este método permite el estudio de la célula bacteriana y sus estructuras internas tales como la
pared celular y así mismo, proporciona contraste entre el microorganismo y el medio que lo rodea.

ANEXOS

1. ¿Cuál es la diferencia entre la tinción simple y la tinción diferencial? De al menos 3 ejemplos

de ellas y para qué se utilizan.

Una tinción simples es una solución acuosa o alcohólica de un colorante básico. Aunque los diferentes
colorantes se unen de forma específica a las distintas partes de la célula, el propósito final de la tinción
simple es destacar el microorganismo completo para que se vean las formas y estructuras básicas de
las células. Algunas de las tinciones simples más usadas en el laboratorio son: azul de metileno,
fucsina, verde de malaquita [4].

A diferencia de tinción simple, las tinciones diferenciales reaccionan de manera diferente con las
distintas clases de bacterias y por lo tanto pueden ser empleadas para establecer una distinción entre
ellas, las tinciones diferenciales más utilizadas en el laboratorio son : tinción de Gram, tinción de
ácido-alcohol resistente y coloración de esporas [4]

2. ¿Cuál es la importancia de usar coloraciones o tinciones diferenciales en el análisis

microbiológico en la industria de alimentos?

Una de las aplicaciones de las coloraciones en las industrias, es para la detección de biopeliculas ya
que por sí solas la detección de estas es impredecible, y la aparición de estas pueden ocasionar
grandes pérdidas e intoxicaciones, debido al medio que estas se encuentran son favorables para su
crecimiento, de tal que se usan tinciones para así lograr con su ubicación y posteriormente su
eliminación, una de las técnicas más utilizadas es el TBF 300 su forma de aplicación es sobre la
superficie y su principio se basa en la tinción de Gram, ya que esta pinta las colonias [5].

3. Identifique cuáles podrían ser los riesgos o errores que se pueden cometer durante una
tinción. Tome como ejemplo la tinción de Gram.

Los principales errores que se pueden presentar en la tinción pueden ser:

Errores sobre el extendido, es colocar un exceso de muestra sobre el extendido, ya que si se coloca
demasiada muestra y posteriormente se procede a realizar la tinción se obtendrá una gran mancha
oscura y a la hora de observar bajo el microscopio una gran mancha oscura.

Si el proceso de fijación no se hace de la manera adecuada, posteriormente a la hora de hacer la

tinción con su respectivo lavado estas bacterias se pueden desprender, y por consecuencia se obtendrá
ausencia de células a la hora de observar bajo el microscopio, y en el caso de un sobrecalentamieyuc
JBnto se observa la deformación de la morfología de las células bacterianas.

4. Busque en internet y mencione 3 ejemplos de bacterias Gram + y 3 ejemplos de bacterias

Gram – diferentes a los mencionados en la guía.

Bacterias Gram +
Penicillium Chrysogenum
Bacillus Subtilis
Bacillus Polymyxa ​[6]

Bacterias Gram -
E.Coli
S. Enteritidis
Photobacterium [7]
REFERENCIAS
Tortora, G. J., Funke, B. R., & Case, C. L. (2007). ​Introduccion a la Microbiologia​ (9a
ed.). Argentina: Medica Panamericana.

Tortora, G. J., Funke, B. R., & Case, C. L. (2010). ​Microbiology. An introduction​ (10th
ed.). San Francisco: Pearson.

[3]​https://www.webconsultas.com/pruebas-medicas/tincion-de-gram-13399
[4]​https://books.google.com.co/books?id=Nxb3iETuwpIC&pg=PA69&dq=Tincion+sim
ple&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwjM7bz4saPjAhXRs1kKHdd2DeIQ6AEIKTAA#v=onepag
e&q=Tincion%20simple&f=false
[5]​http://www.jornadasavesa.com/tenerife14/mesa_autocontrol/Formacion_deteccion_
eliminacion_de_Biofilms_Adeje070514.pdf
[6]​https://books.google.com.co/books?id=-dUEZSXaz2UC&printsec=frontcover&dq=b
acterias+gram+%2B&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwiPnKTtwKPjAhUDqlkKHRK3CbAQ6A
EIKTAA#v=onepage&q=bacterias%20gram%20%2B&f=false
[7]​http://www.revistasbolivianas.org.bo/scielo.php?pid=S2304-37682014001000005&s
cript=sci_arttext
[8]​https://books.google.com.co/books?id=Nxb3iETuwpIC&pg=PA86&dq=gram+negati
vas+pared+celular&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwj8jLutn6njAhUDw1kKHcaFAC4Q6AEI
KTAA#v=onepage&q=gram%20negativas%20pared%20celular&f=false