FACULTAD DE CIENCIAS AMBIENTALES

CARRERA DE INGENIERÍA AMBIENTAL

CURSO:
Microbiología Ambiental

PROFESORA:
Liz Mayra Isabel Rodriguez Portilla

TEMA:
“Tinciones básicas”

INTEGRANTES:
Acuña Hurtado, Keysi Almendra.
Garcia Ramirez, Fernanda Rossy Matilde.
Moriano Osorio, Antuanet Gabriela.
Sanchez Olivares, Dayana Anthoanee.
Soto Crisostomo, Jossy Nicole.
Velásquez Sedano, Romina Angiulieth.

LIMA - PERÚ
2023
I. RESUMEN:

Las tinciones son de gran herramienta en microbiología debido a que sirve para el estudio e
identificación de los microorganismos; con ellas, facilita la observación de diversos
microorganismos vistos en el microscopio ya que, la mayoría de ellos, son incoloros. Uno de
los pasos más importantes para realizar tinciones es sembrar cultivos puros; para ello,
también se toma en cuenta la esterilización de los materiales, evitar que el inóculo se
contamine durante la siembra y dándole las condiciones ambientales de esterilidad para los
microorganismos. El objetivo del experimento fue identificar la morfología, agrupación o
estructura particular de cada una de las colonias; también conocer y aplicar las tinciones
para el tipo de microorganismos. Ya que en la práctica de laboratorio, se realizó las
diferentes tinciones, como: la tinción simple, la tinción Gram, tinción negativa de cápsula y
tinción diferencial (endospora). En los resultados del experimento, se logró encontrar
Bacillus 24h, E. Coli, Staphylococcus, Salmonella, Bacillus 96h y Klebsiella sp. Finalmente
se concluye que, gracias a estos tipos de tinciones, con sus respectivos procedimientos, se
logra identificar aquellos microorganismos que podemos encontrar en nuestro alrededor.

Palabras claves: tinciones, microorganismos, colonias, esterilización.

II. INTRODUCCIÓN:

La tinción, en el área microbiológica, consiste en teñir células o microorganismos, por lo que

es necesario aplicar un colorante al material de estudio; de esta manera, se simplifica la
determinación de microorganismos. Al determinar los microorganismos, se identifican sus
características como: la morfología (cocos, bacilos, etc.), su agrupación (tétradas, cadenas,
etc.) y la clasificación (Gram positivos, Gram negativos). Asimismo, los colorantes se
pueden clasificar en naturales, aquellos que son extraídos de plantas o animales, y
artificiales, los que se extraen de minerales y son procesados por un grupo funcional
cromóforo y un auxócromo (González et al., 2015).

En la técnica de tinción simple, se utiliza solo un colorante, es así como todas las
estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad, pero tienen diferentes
comportamientos frente al entorno; en esta técnica se pueden usar los siguientes
colorantes: Tinta china, Azul metileno de Loeffler y Azul de lacrofenol (Corrales & Caycedo,
2020).

La técnica de la tinción de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología

que permite diferenciar rápida y fácilmente las bacterias según sus características
morfológicas. Esta técnica de tinción es casi exclusiva de las bacterias y los hongos, siendo
estos irregulares en la tinción, mientras que en vegetales y animales no permanece la
tinción (Mora, 2012).

Por otro lado, la técnica de tinción negativa de cápsula rodea y delinea las bacterias no
teñidas u otros componentes biológicos; se utiliza principalmente para evaluar estructuras
individuales, estructuras de gran tamaño como los organismos unicelulares y estructuras
pequeñas como las vesículas sinápticas. Sin embargo, con este método no se permite
identificar de forma nítida y detallada los componentes de dichas estructuras debido a que
tiene un fondo oscuro (López et al., 2013).

En el caso de la tinción diferencial, las endosporas bacterianas no se tiñen fácilmente por

sus características en sus envolturas; para ello, el método más empleado es el de
Schaeffer-Fulton, en esta técnica se hace uso del colorante Verde de Malaquita, en caliente,
y como contraste el uso de la Safranina (Reynoso et al., 2022).

Tomando en cuenta lo anterior, el presente informe tiene como objetivo principal identificar
la morfología, agrupación o estructura particular de cada una de las colonias; también
conocer y aplicar las tinciones para el tipo de microorganismos.
III. MATERIALES:

● Agua destilada (100 mL)

● Asa de siembra
● Alcohol Acetona
● Verde Malaquita
● Alcohol Isopropílico
● Cristal Violeta
● Safranina 0.5%
● Lugol
● Azul de Metileno
● Tinta China
● Portaobjetos
● Aceite de Inmersión
● Pinzas
● Mechero Bunsen
● Puente
● Papel lente
● Microscopio
● Tubos con microorganismos (Bacillus 24h, E. coli, Staphylococcus, Salmonella, Klebsiella
sp, Bacillus 96h)
IV. METODOLOGÍA:

1. Tinción simple
2. Tinción de Gram
● Tinción para E. Coli
● Tinción para Staphylococcus
● Tinción para Salmonella
3. Tinción negativa de cápsula
4. Tinción endospora
V. RESULTADOS:

Imagen 1. Bacillus 24h Imagen 2. E. coli

Gram negativa

Imagen 3. Staphylococcus Imagen 4. Salmonella

Gram positiva Gram negativa

 Imagen 5. Bacillus 96h Imagen 6. Klebsiella sp.

Endospora Cápsula

VI. DISCUSIONES:

De acuerdo con lo trabajado en clase, se utilizó la tinción simple para poder observar la
presencia de Bacillus 24h, en este caso se aplicó Azul de metileno; sin embargo, se puede
usar otros colorantes. Dependiendo del colorante utilizado, las bacterias adquirirán un color
específico. Por ejemplo, si se utiliza Safranina, las bacterias se tiñen de color rojo; si se
utiliza Azul de metileno, adquirirán un color azul; y si se tiñen con Cristal violeta, se verán de
color violeta. Asimismo, esta técnica permite distinguir la morfología y algunas estructuras
de las bacterias, como la presencia de endosporas; sin embargo, no revela más información
en cuanto a su estructura interna (Vizcarrondo y Gutiérrez, 2008). Tal como se observa en
la Imagen 1, al colocar la muestra al microscopio, fue posible identificar la forma que posee
esta bacteria. Adicionalmente, el Azul de metileno no solo brinda coloración, en algunos
casos se utiliza como contratinción; es decir, colorea todas las células excepto aquellas que
ya han sido teñidas con otro tinte. La tinción simple es una herramienta importante en
microbiología y suele ser el primer paso para identificar bacterias desconocidas (Biositio,
s.f.).
En cuanto a la tinción Gram, se aplicó esta técnica para E. coli, Staphylococcus y
Salmonella, para lo cual se utilizó tres colorantes: Cristal violeta, Lugol y Safranina. Tal
como mencionan Vizcarrondo y Gutierrez (2008), la tinción de Gram es una técnica utilizada
para distinguir entre bacterias Gram positivas y Gram negativas. Las bacterias Gram
positivas retienen el color violeta, mientras que las Gram negativas se tiñen de rojo o fucsia
con el colorante secundario. Existen diversas teorías que explican este fenómeno,
incluyendo la naturaleza química de la pared celular de las bacterias Gram positivas y el
efecto de contracción de la pared celular por el alcohol, ya que las bacterias Gram positivas
tienen una pared celular más gruesa, compuesta principalmente de peptidoglucano, que
evita la eliminación del complejo cristal violeta-yodo durante el proceso de decoloración con
alcohol. Por otro lado, las bacterias Gram negativas tienen una pared celular más delgada y
una membrana externa que permite que el colorante se elimine y sean teñidas con el
colorante secundario. Por lo que se dice que, la retención del colorante está determinada
por la estructura de la pared celular, y si se altera esta estructura, las bacterias Gram
positivas pueden transformarse en Gram negativas. De modo que, este tipo de tinción
proporciona información importante sobre la morfología y la identificación de las bacterias.

Con respecto a la Tinción de Cápsula, se sabe que es una técnica de coloración diferencial
que permite dar a conocer la estructura polisacárida, llamada cápsula, la cual rodea a
ciertas bacterias y levaduras (Gil, 2019). La cápsula es una estructura que protege a los
microorganismos de la fagocitosis; así mismo, dicha estructura está formada por una serie
de polímeros orgánicos que se depositan en el exterior de la pared celular. Las cápsulas
mayormente contienen glicoproteínas, polialcoholes y aminoazúcares; llega a medir varias
veces el diámetro del microorganismo; y en medios líquidos, produce viscosidad (Álvarez et
al., 2021). Cabe decir que, debido a su composición principalmente no iónica y su tendencia
a repeler las manchas, se debe utilizar una técnica que manche las células y el fondo,
dejando la cápsula como un halo claro alrededor (LeVeque et al., s.f.). Dentro de las
técnicas para demostrar la presencia de la cápsula, están: la tinción negativa, la tinción de
Anthony y una variante que combina ambas técnicas ya mencionadas. Para la tinción
negativa, técnica que se trabajó en el laboratorio de Microbiología, se requiere utilizar
Nigrosina o Tinta China; para así crear un contraste entre el fondo del preparado y la
cápsula impenetrable del microorganismo presente. Esta técnica es sencilla de realizar y a
la vez económica; sin embargo, se debe observar al microscopio antes de que la
preparación se seque, y eso se debe a que los microorganismos se contraen dificultando la
visualización. Asimismo, se pueden presentar falsos positivos para los analistas inexpertos,
debido a que muchos confunden los leucocitos con las levaduras (Gil, 2019). Por otro lado,
la tinción de Anthony usa como colorante al Cristal violeta. En esta técnica se utiliza Sulfato
de Cobre al 20%; el cual sirve de solución de lavado, quitando el exceso de Cristal violeta.
Gracias a ello, las cápsulas se aclaran, pero los cuerpos de los microorganismos y el fondo,
no pierden el color. Para la tinción de Anthony, se requiere cultivar los microorganismos en
leche tornasolada por 36 horas, para que estos puedan desarrollar una cápsula prominente
(Álvarez et al., 2021). Cabe destacar que es una técnica más laboriosa, y para su
visualización, se requiere que la preparación se seque completamente.

La tinción de endosporas, también llamada tinción Schaeffer-Fulton, es un método de

laboratorio utilizado para identificar y caracterizar las bacterias que forman endosporas, las
cuales debido a las características de sus envolturas no se tiñen con procedimientos
habituales, estas son estructuras de resistencia producidas por ciertas bacterias en
condiciones adversas durante largos períodos de tiempo, incluyendo altas temperaturas,
sequedad, radiación y agentes químicos. Por lo que la tinción endosporas es el más
empleado, en el que la suspensión de microorganismos se tiñe en caliente con el colorante
verde de malaquita, ya que es un colorante soluble en agua y el calor en la técnica, modifica
la permeabilidad de las endosporas y permite la infiltración del colorante a través de las
capas externas; en la última fase, se le añade la safranina, un colorante que da contraste en
los extremos de las bacterias esporuladas (Reynoso et al, 2022). La capacidad de
resistencia de las endosporas se debe a una combinación de factores, que incluyen una
capa externa compuesta de proteína queratina, su estado de deshidratación, proteínas
protectoras de ADN y otras adaptaciones. Cuando las condiciones vuelven a ser favorables,
las endosporas germinan y se convierten en células metabólicamente activas. (González et
al., 2020).

La importancia de la tinción de endosporas radica en su capacidad para diferenciar

bacterias esporuladas, generalmente pertenecientes a los géneros Bacillus y Clostridium,
algunas de las cuales son patógenas por naturaleza y pueden causar enfermedades graves
en humanos, como el Bacillus anthracis (causante del ántrax), el Clostridium tetani
(causante del tétanos) y el Clostridium botulinum (causante del botulismo). Sin embargo,
debido a su resistencia característica, en muchos casos las endosporas bacterianas
resisten la coloración, dificultando la percepción de estas (Domínguez et al., 2012).

En el ámbito de la microbiología, la técnica de tinción de endosporas es valiosa para la

identificación y clasificación de bacterias. Esta técnica permite determinar si una bacteria
tiene la capacidad de producir endosporas y proporciona información acerca de su forma,
ubicación y características. Esta información es fundamental para la taxonomía bacteriana y
para comprender la biología de las bacterias que forman endosporas. Por ejemplo, el
 tamaño, la forma y la ubicación de las endosporas son elementos importantes para
caracterizar e identificar ciertas especies. Las endosporas pueden tener forma esférica,
subesférica u ovalada. La posición dentro de la célula que ocupa la endospora es
característica y puede variar, pudiendo estar en un extremo (terminal), cerca de un extremo
(subterminal) o en el centro de la célula vegetativa (central). Además, las endosporas
pueden hacer que la célula se hinche o no, y su diámetro puede ser igual, menor o mayor
que el de la célula vegetativa (González et al., 2020).

VII. CONCLUSIONES:

En conclusión, la tinción simple es el tipo más básico de tinción microscópica y se usa para
colorear células y estructuras para una fácil visualización. Tiene la ventaja de ser realizada
rápidamente. La tinción Gram se utiliza para ayudar a distinguir entre diferentes tipos de
células o microorganismos como las bacterias, sobre todo para distinguir entre gram
positivos y gram negativos, siendo diferenciado por sus colores, azul o morado y rojo o
fucsia respectivamente. Por otro lado, la tinción de cápsula se encarga de contrastar el
fondo del preparado y el microorganismo con cápsula; al presentar dicha estructura, los
microorganismos se vuelven impenetrables y los colorantes no pueden teñirlos a diferencia
de otras técnicas. Asimismo, la cápsula es fácil de distinguir ya que se presenta como un
halo claro que rodea al microorganismo. Finalmente, la importancia de la tinción de
endosporas radica en su capacidad para identificar bacterias formadoras de endosporas,
algunas de las cuales son patógenas para los seres humanos. Además, esta técnica
proporciona información valiosa para la clasificación y estudio de las bacterias desde el
punto de vista microbiológico.

VIII. REFERENCIAS:

Álvarez J., Brú M. y González S. (2021). Tinción de cápsulas. SCRIBD.

https://es.scribd.com/document/557692143/articulo-tincion-de-capsulas#
Biositio (s.f.). Tinciones Simples: Que es, Características, Tipos, Usos y Más.
https://biositio.com/tinciones-simples/
Corrales, L., & Caycedo, L. (2020). Principios físicoquímicos de los colorantes
utilizados en microbiología Principios físicoquímicos de los colorantes | Nova.
Hemeroteca UNAD.
https://hemeroteca.unad.edu.co/index.php/nova/article/view/3701
Domínguez K., Soria R., Sistos A., Molano D. Hernández J. (2012). Técnica para
teñir bacilos esporulados de interés médico.
https://www.imbiomed.com.mx/articulo.php?id=92263
Gil M. (2019). Tinción de cápsula: fundamento y técnicas. Lifeder
https://www.lifeder.com/tincion-de-capsula/

González M., Cuevas B., Cortés M, Sánchez M. (2020). Las tinciones básicas en el
laboratorio de Microbiología: Un enfoque gráfico.
https://www.zaragoza.unam.mx/wp-content/Portal2015/publicaciones/libros/
cbiologicas/libros/Tinciones.pdf

González, R., Elizalde, B., Cortés, M., & Orduña, M. (2015). Las tinciones básicas en
el Laboratorio de Microbiología: Un enfoque gráfico. FES Zaragoza.
https://www.zaragoza.unam.mx/wp-content/Portal2015/publicaciones/libros/
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LeVeque R., Martin N., Van Alst A., y DiRita V. (s.f.) Microscopía y tinción: Tinción
de Gram, cápsula y endosporas. Jove. https://www.jove.com/es/v/10513/microscopy-
and-staining-gram-capsule-and-endospore-staining?
language=Spanish#:~:text=Debido%20a%20su%20composici%C3%B3n
%20principalmente,claro%20alrededor%20de%20las%20c%C3%A9lulas

López, L., Hernández, M., Colín, C., Ortega, S., Cerón, G., & Franco, R. (2013). Las
tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Medigraphic.
https://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf
Mora, X. (2012). Diferenciando bacterias gram + y gram -.
https://seleccionesavicolas.com/pdf-files/2012/2/6536-diferenciando-bacterias-gran-
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Reynoso, M., Magnoli, C., Barros, G., & Demo, M. (2022). Coloración de endosporas
(tinción diferencial). LibreTexts. https://espanol.libretexts.org/Biologia/Microbiolog
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2.05%3A_Tinciones_comunmente_usadas_en_microbiologia/
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IX. ANEXOS:

1. Colorantes que se requirió 2. Tubos de ensayo con microorganismos

3. Tinciones de las muestras 4. Tinción de endosporas

5. Observación con el microscopio