El antígeno Nuclear 1 del virus de Epstein-Barr modula la replicación de los

plásmidos oriP, impidiendo la migración de la horquilla de replicación y

transcripción a través de una familia de repeticiones

Ashok Aiyar1,2, Siddhesh Aras2, Amber Washington2, Gyanendra Singh1 y Ronald B Luftig2
1
Stanley S. Centro de Cáncer Scott, Centro de Ciencias de la Salud LSU, Calle Bolivar # 533,
Nueva Orleans, LA 70112, EE.UU.
2
Departamento de Microbiología, Centro de Ciencias de la Salud LSU, Calle Perdido # 1901,
Nueva Orleans, LA 70112, EE.UU.

RESUMEN

Trasfondo. El virus de Epstein-Barr se replica una vez por cada ciclo celular, y se
divide de la misma manera en las células infectadas de manera latente. Estos
procesos requieren un solo elemento viral cis, denominado oriP, y una sola
proteína viral, la EBNA1. La EBNA1 se une a dos racimos de sitios de unión en el
oriP, uno denominado como elemento de simetría dyad (DS) y el otro, como la
familia de repeticiones (FR), los cuales funcionan como un elemento de replicación
y un elemento de partición, respectivamente. El FR del tipo salvaje contiene 20
sitios de unión para la EBNA1.
Resultados. Nosotros, y otros investigadores, hemos determinado previamente
que al disminuir el número de sitios de unión a la EBNA1 en la FR, aumenta la
eficacia con la que se reproducen los plásmidos oriP. Aquí nosotros demostramos
que el número de sitios de unión del tipo salvaje en la FR, impide la migración de
la horquilla de replicación y transcripción. Además, al separar a la FR en dos
juegos ampliamente separados de diez sitios de unión, ocasiona un aumento de
diez veces el valor de la eficacia con la que se establecen los plásmidos oriP en
las células que expresan a la EBNA1. También hemos determinado que la unión
de la EBNA1 a la FR daña la migración de las horquillas de transcripción de una
manera dependiente del número de sitios de unión a la EBNA1 en la FR.
Conclusión. Concluimos que la unión de la EBNA1 a la FR regula la replicación de
plásmidos oriP, impidiendo la migración de las horquillas de replicación. Después
de unirse a la FR, la EBNA1 también bloquea la migración de las horquillas de
transcripción. Así, además de regular la replicación oriP, la EBNA1 unida a la FR
también disminuye la probabilidad de colisiones perjudiciales entre dos horquillas
de repetición contrarias, o entre una horquilla de transcripción y una horquilla de
repetición.

TRASFONDO

El virus de Epstein-Barr (EBV) se replica una vez por cada ciclo celular como un
episoma en las células proliferantes que están infectadas de manera latente [1,2].
La replicación episomal requiere una secuencia viral en cis, denominada oriP, y
una sola proteína viral, la EBNA1 [3,4]. El oriP contiene dos juegos de sitios de
unión para la EBNA1, la región de simetría dyad (DS), que contiene cuatro sitios
de baja afinidad por la EBNA1, y la familia de repeticiones (FR) que contiene a
veinte sitios de alta afinidad por la EBNA1 [5,6]. La síntesis del ADN comienza en
la DS, dependiendo de la asociación a las proteínas del complejo celular de
reconocimiento del origen (ORC) y las proteínas de mantenimiento del
minicromosoma (MCM) con la DS [7-9]. Evidencia reciente indica que la EBNA1
recluta a las proteínas ORC para la DS a través de una interacción con el ORC1
mediada por el ARN [10].

La FR funciona como un elemento de mantenimiento y división del plásmido

[11,12]. La FR de la cepa prototípica B95-8 del EBV contiene 20 sitios de alta
afinidad para la EBNA1 que se une como un dímero a cada uno de estos sitios
[13,14]. La EBNA1 unida a FR retiene a los episomas virales o a los plásmidos
oriP en los cromosomas celulares [15-19]; una asociación que facilita que los
plásmidos puedan ingresar a las células hijas en cada metafase [20,21]. Además
de su papel en la división del genoma, el análisis bidimensional en gel realizado
por Schildkraut y colaboradores, ha indicado que la migración de las horquillas de
replicación a través de la FR es atenuada, de tal manera que para el genoma
circular del EBV o de un plásmido oriP, la horquilla de replicación bidireccional que
comienza en la DS, termina en la FR [22]. Esta capacidad de la EBNA1 unida a la
FR para atenuar las horquillas de replicación se ha recapitulado en ensayos
bioquímicos realizados in vitro; tales ensayos revelan que el dominio de unión al
ADN de la EBNA1 unida a la FR impide la migración de las horquillas de
replicación desde un origen SV40 en la misma plantilla [23].

Usando ensayos para la activación de la transcripción y para el mantenimiento del

plásmido, hemos examinado en detalle los requerimientos del sitio de unión para
la EBNA1 en la FR del EBV [24]. Nuestros análisis indicaron que aunque la FR del
tipo salvaje contiene 20 sitios de unión, los plásmidos con 10 sitios de unión se
mantienen de forma mucho más eficaz en los ensayos de formación de colonias
que los plásmidos con 20 sitios (misma referencia). Se ha reportado Un hallazgo
similar para mutantes con deleción construidos dentro de una FR natural, en la
cual un plásmido con 9 sitios de unión se replican de manera más eficaz que un
plásmido con 20 sitios de unión [25]. Así, estos resultados concurren en que el
número del tipo salvaje de sitios de unión a la EBNA1 en la FR limita la replicación
de los plásmidos oriP, actuando en cis.

En este estudio, hemos examinado el mecanismo por el cual el número de los

sitios de unión del tipo salvaje limitan la replicación de los plásmidos oriP.
Nuestros resultados indican que la EBNA1 unida a la FR, limita la replicación,
impidiendo la migración de las horquillas de replicación desde la DS. Además,
hemos determinado que la EBNA1 unida a la FR daña severamente la migración
de las horquillas de transcripción a través de la FR. Discutimos ambos resultados
en el contexto de la replicación estable de los episomas del EBV.