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14. DUPLICACIN DEL ADN


S. Signorelli y J. Monza
Revisado por la Dra. Ana Ramn,
Seccin Biologa Molecular, Instituto de Biologa,
Facultad de Ciencias, UdelaR.
1. La duplicacin del ADN es semiconservativa
La duplicacin del ADN, que ocurre de manera similar en procariotas y eucariotas, consiste en la sntesis de una molcula igual a la que le dio origen.
Debido a esto, como las clulas duplican su ADN
antes de cada divisin, las hijas tienen el mismo
contenido de ADN y la misma informacin. Una
excepcin a esto son los gametos que contienen la
mitad de ADN respecto a la clula madre.
En la duplicacin del ADN cada hebra acta
como molde para la sntesis de una hebra nueva. Como se muestra en la figura 1, cada hebra
madre (molde) queda junto a una hebra hija
(nueva): la duplicacin es semiconservativa.
Meselson y Stahl, usando bases marcadas con
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N, demostraron cmo se asocian las hebras
despus de la duplicacin (Fig. 1).
2. Secuencia de eventos durante la duplicacin
La descripcin de la duplicacin del ADN se centrar en el modelo bacteriano, que como proceso
general es el mismo al que ocurre en eucariotas.
La secuencia de eventos que terminan con la duplicacin del ADN se describe en los cuatro puntos que siguen.
2.1 Reconocimiento del o los orgenes de
replicacin
La duplicacin comienza en muchos sitios del
cromosoma eucariota, o en un nico sitio en el
cromosoma bacteriano. Estos sitios, que se denominan orgenes de duplicacin (oriC) estn
pautados por secuencias especficas de bases.
En Escherichia coli el origen de duplicacin
tiene unas 245 pb cuya secuencia es reconocida por una protena (DNAa). Otra protena con
actividad Helicasa (DNAb) separa las hebras y
se forma una burbuja de duplicacin (Fig. 2).

Figura 1. Duplicacin semiconservativa del ADN: experimento de Meselson y Stahl. A. El ADN pesado tiene las bases
de ambas hebras con 15N (istopo pesado) y el ADN liviano
con 14N (istopo liviano). El ADN con 15N se puede separar
del ADN con 14N por ultracentrifugacin, porque el ADN pesado ocupa una posicin inferior respecto al liviano. B. Si se
parte de bacterias con ADN pesado, y se las crece en un medio con 14N las hebras hijas sern livianas. Cada hebra hija se
asocia con la hebra madre y el ADN es semipesado: la duplicacin es semiconservativa. La otra posibilidad, que se asocien las dos hebras hijas y las dos hebras madres, no ocurre.

En cada burbuja hay dos horquillas de duplicacin: la sntesis de ADN se da en dos direcciones. En la figura 2 se representa la formacin
de la burbuja de duplicacin en un cromosoma
procariota y se indican las horquillas de duplicacin.
A partir de un oriC se replica una unidad funcional que se denomina replicn. En bacterias,
que tienen un solo oriC, todo el genoma es un
replicn. En el genoma humano se estiman entre 10.000 y 100.000 oriC, por lo que habra
hasta 100.000 replicones.

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actan las Topoisomerasas, enzimas que hidrolizan una o ambas hebras de ADN permitiendo el giro de la molcula y la eliminacin
del superenrrollamiento (Fig. 2).

Figura 2. Origen de duplicacin en un cromosoma procariota. En el origen de duplicacin se forma la burbuja de duplicacin y se generan dos horquillas, una para cada lado: la
sntesis de ADN avanza en sentidos opuestos.

2.2 Separacin de las hebras de ADN


La separacin de las hebras ocurre por accin
de la enzima Helicasa, que rompe los puentes
de hidrgeno entre las bases complementarias.
Como consecuencia se forman dos horquillas
de replicacin, una en cada lado del bucle (Fig.
2), pero para facilitar la descripcin se analizar lo que ocurre en una de ellas.
Para separar a las hebras, la Helicasa se desplaza a lo largo del ADN, para lo que utiliza
energa de la hidrlisis del ATP.
Al separar a las dos hebras se genera un superenrollamiento en el ADN por adelante de la
Helicasa. Para disminuir la tensin generada

Las hebras se mantienen momentneamente


separadas, como monohebra, por la participacin de protenas SSB (single stranded DNA
binding proteins), tambin llamadas estabilizadoras de monohebra. Estas protenas interaccionan con el ADN y mantienen separadas a las
hebras para que puedan actuar como molde.
+ Observe que las hebras de ADN no se separan
ni se mantienen como monohebra espontneamente, para ello participa una enzima y protenas especficas.
2.3 Sntesis del ARN cebador
La ADN pol requiere de un fragmento de
polinucletido con un -OH 3 libre para comenzar a polimerizar los dNTP (Fig. 3). Este
fragmento es el cebador, y tiene entre 10 y 60
nucletidos.
El cebador es ARN, que se sintetiza por una
ARN pol, la Primasa, que condensa a los ribonucletidos trifosfato ATP, CTP, GTP y UTP,
colectivamente denominados NTP (Fig. 3 y 4).

Figura 3. Duplicacin del ADN. A. Cebador. El ARN cebador se sintetiza por adicin de NTP por accin de la Primasa. Al extremo OH 3 libre del cebador se unen los dNTP por accin de la ADN pol. B. Sntesis del ADN. La Helicasa
rompe los puentes de hidrgeno entre las bases, las SSB estabilizan las hebras simples y la Topoisomerasa hidroliza el
ADN y permite eliminar el superenrollamiento. El crecimiento de la hebra continua (superior) acompaa el sentido
de apertura de las hebras. La hebra discontinua (inferior), crece en sentido opuesto y en fragmentos (fragmentos de
Okasaki). La Primasa sintetiza al cebador, al que se adicionan dNTPs por accin de la ADN pol III. El cebador es remplazado por ADN por accin de la ADN pol I. La Ligasa une los fragmentos de ADN de la hebra discontinua.

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Al extremo -OH 3 libre del cebador la ADN


pol adiciona el primer dNTP y continua adicionndolos al extremo -OH 3 del ADN creciente: el ADN crece en sentido 5a 3 (Fig. 2 y 3).

+ Observe que la Primasa polimeriza NTP a partir de un ADN molde, sin necesidad de cebador.

2.4 Sntesis de ADN


La polimerizacin de dNTP catalizada por la
ADN pol est dirigida por una hebra molde de
ADN, segn los apareamientos de Watson y
Crick: A-T y C-G. En la figura 4 se muestra la
adicin de un dNTP a una hebra creciente de
ADN, frente a la hebra molde.

Okasaki (Fig. 3 y 5), que en procariotas tienen


entre 100 y 400 pb y en eucariotas entre 1000
y 2000 pb.
Los cebadores son eliminados y sustituidos
por ADN por la ADN pol I, que hidroliza
al ARN: cada ribonucletido es removido
es sustituido por un desoxi ribonucletido
(Fig. 4).
Cuando se sustituye el ARN por ADN quedan
uno tras otro dos fragmentos nuevos de ADN,
que la enzima Ligasa une a travs de un enlace
5- 3 (Fig. 3 y 5).

En eucariotas hay varias ADN pol. Los tipos I y


III estn relacionadas a la duplicacin del ADN
cromosmico. La ADN pol II participa en la reparacin del ADN y la ADN pol IV en la sntesis
de ADN mitocondrial.
La velocidad de duplicacin del ADN es del orden 50 nucletidos por segundo en eucariotas
y hasta 1000 nucletidos por segundo en procariotas.
La ADN pol I tiene una velocidad baja, de unos
10 - 20 nucletidos por segundo y se suelta despus de polimerizar menos de 30 nucletidos,
lo que enlentece el proceso. En esta enzima la
procesividad, que hace referencia a la cantidad
de nucletidos que polimeriza sin desprenderse del molde, es baja.
El ADN molde se lee desde el extremo 3al
5en cada hebra. Como estas son antiparalelas, una crece en el mismo sentido en el que se
abre la doble hebra y la otra lo hace en sentido
opuesto (Fig. 3). Esto lleva a que la hebra que
se sintetiza en el mismo sentido en que se abre
el ADN se haga de manera continua. La hebra
que va en sentido opuesto debe sintetizarse en
fragmentos, a medida que la doble hebra se
abre y se genera una regin de hebra simple
para ser leda.
Los fragmentos compuestos por ARN cebador
seguido de ADN se denominan fragmentos de

Figura 4. Incorporacin de un dNTP al extremo 3 -OH de


una cadena en crecimiento. La ADN pol tiene como sustrato
a los dNTP y la direccin en que se lee la hebra molde es de
3a 5.

+ Observe que:
El ADN se sintetiza por accin de las ADN pol,
que catalizan la condensacin de dNTP (dATP,
dCTP, dGTP y dTTP) y la ARN pol que cataliza la condensacin de NTP (ATP, CTP, GTP y
UTP) para formar el cebador.
Debido a la complementariedad de bases,
las molculas de ADN hijas son iguales a la
madre, de manera que la informacin gentica es la misma: esto constituye la base de
la herencia.

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3. Las ADN pol I y III tienen capacidad de


corregir errores
Las distintas macromolculas que forman parte de las clulas sufren cambios en su estructura qumica por accin de diferentes agentes
que las modifican, o como consecuencia de
su propia inestabilidad. Las molculas daadas son reemplazadas por nuevas, lo que evita
los problemas funcionales que pueden derivar
del dao. En el caso del ADN esto es diferente, porque este debe conservar la informacin
de manera estable para transmitirla de clula
a clula. Esto se logra a travs de un mecanismo de sntesis preciso en s mismo y que cuenta con enzimas ADN pol capaces de corregir
errores de copia.
La incorporacin de un nucletido incorrecto
en la nueva hebra de ADN ocurre a razn de
uno cada 104-105 nucletidos incorporados.
Sin embargo como las ADN pol I y III corrigen
errores, al finalizar la duplicacin slo queda
un nucletido incorrecto cada 109-1010 incorporados.
Las ADN pol I y III tienen actividad exonucleasa 3a 5, que consiste en hidrolizar varios nucletidos hacia el extremo 5 de la hebra nueva.
Esto es equivalente a ir hacia atrs respecto a
la sntesis.
En la figura 5 se representa el mecanismo de
correccin de un error durante la duplicacin. Como las bases no se aparean correctamente el nucletido queda separado de la
base de la otra hebra, que no es la complementaria. La subunidad de la ADN pol III
hidroliza en sentido 3a 5 y vuelve a polimerizar dNTP sobre el ADN molde, corrigiendo as el error.

Figura 5. Actividad correctora de la ADN pol. A. La flecha indica el sentido de avance de la polimerasa. B. Cuando ocurre
un error, la subunidad de la ADN pol con actividad exonucleasa 3 a 5 hidroliza varios nuclotidos hacia atrs (5).

+ Observe que la capacidad de las ADN pol de corregir errores durante la duplicacin asegura que las
hebras de ADN duplicado sean iguales a las madres.

Al finalizar la preparacin del tema ser


capaz de:
1. Explicar el concepto de duplicacin semiconservativa.
2. Relacionar la duplicacin del ADN con la multiplicacin celular.
3. Describir la sntesis de ADN a partir de la hebra continua y discontinua.
4. Reconocer la importancia de la capacidad de
corregir errores de las ADN pol.