REPLICACIÓN Y MECANISMOS DE

REPARACIÓN DEL ADN

Dr. Humberto Díaz

- 05, 12 y 19 de Abril de 2021 -

 ¿QUÉ ES LA REPLICACIÓN DEL ADN?

El proceso de replicación de
ADN es el mecanismo que
permite al ADN duplicarse, es
decir, sintetizar una copia
idéntica.

1. Semiconservador.
2. Complementariedad entre las bases del ADN
3. Reproducción idéntica  la información genética se
transmite de una célula madre a las células hijas y
es la base de la herencia del material genético.

Velocidad???  1.000 nucleótidos/s en E. coli

4.639.221 pb (4.403 genes)  4.639 s  ~1,29 h
 LA REPLICACIÓN DEL ADN ES SEMICONSERVATIVA¡¡¡¡¡

En cada una de las moléculas hijas se conserva una de

las cadenas originales, y por eso se dice que la
replicación del ADN es semiconservadora.

a) Replicación b) Replicación c) Replicación

Conservativa Dispersiva Semiconservativa
LA REPLICACIÓN DEL ADN ES SEMICONSERVATIVA¡¡¡¡¡

ADN extraído y centrifugado El experimento de

hasta equilibrio en gradiente
de densidad de CsCl Meselson & Stahl (1958)
permitió demostrar que el
mecanismo real se ajusta
a la hipótesis de
Molécula replicación
parental original
semiconservadora.

Moléculas hijas de la
primera generación

Moléculas hijas de la
segunda generación
DETALLES DEL EXPERIMENTO DE Meselson & Stahl
DETALLES DEL EXPERIMENTO DE Meselson & Stahl
 ORÍGENES DE REPLICACIÓN

Los orígenes de replicación son los puntos fijos a partir de

los cuales se lleva cabo la replicación, que avanza de forma
secuencial formando estructuras con forma de horquilla.

La cantidad de ADN que se puede sintetizar a partir de un

único origen de replicación se denomina replicón o unidad
funcional de replicación.
El genoma bacteriano es un replicón único circular.
En organismos eucarióticos, la replicación del ADN se inicia
en múltiples orígenes a la vez (hay uno cada 20 kb
aproximadamente), es decir, hay varios replicones.

Los orígenes de replicación reciben diversos nombres: OriC

en E. coli,  en otras bacterias, secuencia de replicación
autónoma (ARS) en Saccharomyces cereviceae.
ORÍGENES DE REPLICACIÓN
ORÍGENES DE REPLICACIÓN
 LA REPLICACIÓN DEL ADN AVANZA EN FORMA DE
HORQUILLA

Debido a que en la célula ambas cadenas de la doble

hélice de ADN se duplican al mismo tiempo, éstas
deben separarse para que cada una de ellas sirva de
molde para la síntesis de una nueva cadena.

Por eso, la replicación avanza con una estructura en

forma de horquilla formándose una burbuja u ojo de
replicación, que avanza en dirección a la región de
ADN no duplicado dejando atrás los dos moldes de
ADN de cadena simple donde se está produciendo la
replicación.
LA REPLICACIÓN DEL ADN AVANZA EN FORMA DE
HORQUILLA
LA REPLICACIÓN DEL ADN AVANZA EN FORMA DE HORQUILLA
 LA REPLICACIÓN DEL ADN ES BIDIRECCIONAL

El movimiento de la horquilla es bidireccional en la

mayoría de los casos, es decir, a partir de un punto
se sintetizan las dos cadenas en ambos sentidos.

Esto ocurre en la mayoría de los organismos, pero se

dan excepciones en algunos procariontes debido a que
los mecanismos de replicación que tienen lugar
dependen de la propia estructura de su material
hereditario (si el ADN es circular, lineal, bicatenario o
monocatenario).
En casos particulares como el ADN mitocondrial,
algunos plásmidos y algunos genomas monocatenarios de
fagos pequeños, la replicación se da
unidireccionalmente pudiendo haber uno o dos orígenes
de replicación.
LA REPLICACIÓN DEL ADN ES BIDIRECCIONAL
 Bidireccional

Replicación de un Horquilla de
Cromosoma Circular Replicación

de E. coli
Origen

Unidireccional

Origen
LA REPLICACIÓN DEL ADN ES BIDIRECCIONAL
LA SÍNTESIS DEL ADN TRANSCURRE EN DIRECCIÓN
5’  3´ Y ES SEMIDISCONTINUA¡¡¡¡¡

La replicación siempre se produce en sentido 5' → 3',

siendo el extremo 3'-OH libre el punto a partir del
cual se produce la elongación del ADN.

PROBLEMA
Las cadenas tienen que crecer simultáneamente a
pesar de que son antiparalelas, es decir, que cada
cadena tiene el extremo 5' enfrentado con el extremo
3' de la otra cadena. Por ello, una de las cadenas
debería ser sintetizada en dirección 3' → 5'.
LA SÍNTESIS DEL ADN TRANSCURRE EN DIRECCIÓN
5’  3´ Y ES SEMIDISCONTINUA¡¡¡¡¡

Reiji Okazaki y Tsuneko Okazaki (1960): descubren

que una de las nuevas cadenas de ADN se sintetiza en
forma de trozos cortos: fragmentos de Okazaki. Su
longitud suele variar entre 1.000 y 2.000 nucleótidos
en las bacterias y entre 100 y 400 nucleótidos en
eucariontes.
• Hebra adelantada, líder o conductora (leading strand): La
cadena que se sintetiza en el mismo sentido que avanza la
horquilla de replicación y se sintetiza de forma continua
por la ADN polimerasa.
• Hebra rezagada o retrasada (lagging strand): se sintetiza
en sentido contrario al avance, de forma discontinua,
teniendo que esperar a que la horquilla de replicación
avance para disponer de una cierta longitud de ADN
molde.
 LA SÍNTESIS DEL ADN TRANSCURRE EN
DIRECCIÓN 5’  3´ Y ES
SEMIDISCONTINUA¡¡¡¡¡

Hebra
Conductora

Dirección de movimiento de la
horquilla de replicación

Fragmentos de
Okasaki

Hebra
Rezagada
 ELONGACIÓN DE UNA CADENA DE ADN

Desoxiribonucleósido
5’-trifosfato
entrante

Cadena de ADN
en crecimiento
(cebador)

Cadena de ADN
molde

Desoxirribosa

SE REQUIERE:
• Una hebra desapareada que actúe como molde
• Cadena cebadora que aporte un extremo 3’ libre (añaden nuevos nucleótidos)
ELONGACIÓN DE UNA CADENA DE ADN
ELONGACIÓN DE UNA CADENA DE ADN
EN LA SÍNTESIS, RESPECTO DE LA REPLICACIÓN
DEL ADN, PODEMOS DECIR:

1. La síntesis del ADN necesita de un

(unos) origen de replicación.
2. La síntesis del ADN transcurre en
dirección 5’  3´.
3. La síntesis del ADN es bidireccional.
4. La replicación del ADN es
semiconservativa.
5. La replicación del ADN es
semidiscontinua.
6. La síntesis del ADN avanza en forma
de horquilla.
LA REPLICACIÓN REQUIERE DE ADN POLIMERASA

Arthur Kornberg, Premio Nobel

de Medicina 1959, descubre la
ADN Polimerasa de E. coli

La ADN polimerasa es la enzima

que cataliza la síntesis de la
nueva cadena de ADN a partir
de desoxirribonucleótidos y de
la molécula de ADN molde que
es la que será replicada.
REPLICACIÓN EN PROCARIOTAS
 REPLICACIÓN EN PROCARIOTAS
El ADN dúplex se replica por una progresiva separación de
las dos hebras paternas, acompañado de una síntesis de sus
hebras complementarias, dando lugar, de forma
semiconservadora, a dos hebras hijas de doble hélice .
El punto de separación de las dos hebras donde la síntesis
tiene lugar ha recibido el nombre de ojo de replicación, y
termina en dos puntos extremos que se denominan horquillas
de replicación.
Los estudios mediante autorradiografías han demostrado
que la replicación es siempre bidireccional.
Además, dichos experimentos, junto con algunas evidencias
genéticas, han establecido que el ADN procariótico y el de
los bacteriófagos sólo poseen un único origen de replicación
(punto donde se inicia la síntesis del ADN).
 REQUERIMIENTOS PARA LA REPLICACIÓN DEL ADN EN
PROCARIOTAS
• Molde de ADN preexistente
• Cebador (“primer”): Pequeño fragmento de ARN (>5 nucleótidos) con el grupo
3’-OH libre, unido al ADN molde (sintetizado por la primasa del primosoma).
• Precursores activados: Los cuatro Desoxiribonucleótidos 5’-trifosfato (ATP,
GTP, CTP, TTP).
• ADN Polimerasas
₋ Catalizan la formación de enlaces fosfodiéster dirigida por un molde de ADN
(actividad polimerasa 5’ → 3’) y la corrección de errores (exonucleasa 3 →
5’).
₋ Requieren Mg2+ y un cebador con su extremo 3’-OH libre.
₋ Tres tipos en E. coli:
 ADN polimerasa III (Pol III): Síntesis de la nueva cadena de ADN partir
del cebador.
 ADN polimerasa I (Pol I): Elimina el cebador mediante una actividad
exonucleasa 5’ - 3’ y sintetiza ADN en su lugar.
 ADN polimerasa II (Pol II): Función no completamente conocida (quizá
similar a la Pol I)???
• PRIMOSOMA: Primasa (ARN Polimerasa que dirige la síntesis de cebador),
helicasa y otros polipéptidos que sintetizan primer.
• Otras Proteínas.
¿CUÁLES SON LAS OTRAS PROTEÍNAS?
 ¿CUÁLES SON LAS OTRAS PROTEÍNAS?

A parte de:

• Proteína ADNB: Helicasa 5' → 3' (fusión del ADN)

• Proteína ADNG: Primasa, Síntesis del cebador de ARN
• SSB: Proteínas de unión al ADN de hebra simple
• ADN girasa (Topoisomerasa II): Desenrollamiento del ADN
• ADN ligasa: Une covalentemente los fragmentos de Okazaki

Tenemos:
• Proteína ADNA: Factor de iniciación
• Proteína ADNC: Chaperona de la ADNB
• HU: Proteína tipo histona (de unión al ADN)
• PriA: Ensamble del Primosoma, Helicasa 3' → 5'
• PriB: Ensamble del Primosoma
• PriC: Ensamble del Primosoma
• ADNT: Asiste durante la liberación de la ADNC
• Tus: Terminación
 LA REPLICACIÓN DEL ADN REQUIERE DE MUCHAS
ENZIMAS Y FACTORES PROTEICOS ¡¡¡¡¡¡¡¡

Proteínas requeridas para iniciar la Replicación en el Origen de Replicación de E. coli

EN PROCARIOTAS SE DISTINGUEN AL MENOS 3 TIPOS
DE POLIMERASAS: I, II Y III ¡¡¡¡¡

PROCESIVIDAD: el número de nucleótidos adicionados, en promedio, antes que

se disocie una polimerasa  Limita la velocidad global de reacción.
EN PROCARIOTAS SE DISTINGUEN AL MENOS 3 TIPOS
DE POLIMERASAS: I, II Y III ¡¡¡¡¡
 CORRECIÓN DE PRUEBAS
3’  5’ DE LA ADN POLIMERASA I

• Actividad exonucleasa 3’  5’
(eliminación de nucleótido recién
apareado: altamente específica para
pares de bases incorrectos).
• No es el inverso de la polimerización,
pues no interviene el pirofosfato.
• Mejora la precisión de la reacción de
polimerización en un factor de 102 –
103.

Las exonucleasas son enzimas que

funcionan escindiendo nucleótidos uno a
uno a partir del extremo terminal
(exo) de una cadena polinucleotídica.

Tautómero: isómeros que se

diferencian sólo en la posición de un
grupo funcional.
ACTIVIDAD EXONUCLEASA
5´ 3´ DE LA ADN
POLIMERASA I

La actividad exonucleasa 5’  3’
de la ADN polimerasa I puede
eliminar o degradar una hebra de
ARN o de ADN apareada al
molde al tiempo que la actividad
polimerasa reemplaza la hebra
degradada.
ESTRUCTURA DE CINTA DE LAS DOS SUBUNIDADES  DE
LA ADN POLIMERASA III DE E. coli
ESTRUCTURA ESPACIAL DE LAS DOS SUBUNIDADES  DE
LA ADN POLIMERASA III DE E. coli
SUBUNIDADES DE LA POLIMERASA III DE E.coli
 FRAGMENTO DE KLENOW DE LA ADN POLIMERASA I

ADN Polimerasa I
E. coli
Actividad Polimerasa
Exonucleasa 3’ 5’
Exonucleasa 5’→ 3’
Fragmento de Klenow
Actividad Polimerasa
Exonucleasa 3’ 5’

Fragmento de Klenow: es aquel fragmento restante (Mr 68.000) que

retiene las actividades de polimerización y de corrección de pruebas
3’ 5’, una vez que se elimina el dominio exonucleasa 5’→ 3’ (uso de la
enzima proteasa subtilisina).
 FRAGMENTO EXO-KLENOW DE LA ADN POLIMERASA I

Al igual que la actividad

exonucleasa 5' → 3' de la
ADN polimerasa I de E. coli
puede no ser deseable, la
actividad exonucleasa 3' →
5' del fragmento Klenow
tampoco puede ser deseable
para algunas aplicaciones.

Este problema puede ser salvado induciendo mutaciones en el gen

que codifica para el fragmento. Esto resulta en formas de la
enzima que mantienen la actividad polimerasa 5' → 3', pero
carecen de cualquier actividad exonucleasa (5' → 3' ó 3' → 5').
Esta forma de la enzima es llamada Fragmento exo- Klenow.

Fragmento Exo-Klenow
Sólo Actividad Polimerasa
 COMPLEJO DE REPLICACIÓN O REPLISOMA

Un gran número de enzimas y proteínas intervienen en el

mecanismo molecular de la replicación, formando el
llamado complejo de replicación o replisoma durante la
fase de iniciación de la replicación del ADN. Estas
proteínas y enzimas son homólogas en eucariotas y
arqueas, pero difieren en bacterias.
 COMPLEJO DE REPLICACIÓN O REPLISOMA
• El Complejo de Replicación (CR) o REPLISOMA en procariotas es
un complejo proteico que se estructura en el punto de origen de la
replicación (Ori) durante la fase de iniciación de la replicación del
ADN.
• Las proteínas involucradas en la formación del CR son
indispensables para que el proceso de replicación se realice
adecuadamente.
• En los procariotas, el CR está compuesto de los siguientes
factores:
 Un factor de iniciación de la replicación, tal como la proteína
llamada ADNA .
 Una Helicasa y sus cofactores, tales como la ADNB (Helicasa
5' → 3') y la ADNC (Chaperona de ADNB).
 Una Primasa (ADNG), la cual genera el cebador de ARN que
requiere la Polimerasa para funcionar en la replicación del ADN.
 Una holoenzima de la ARN Polimerasa, la cual es en realidad un
complejo enzimático que realiza efectivamente la replicación.
 CEBADOR DE ARN EN E. coli
• Uno de los requerimientos casi universales para todas las ADN
polimerasas es el extender la hebra de ADN a partir de un extremo
3'-OH libre.

• Como consecuencia de este hecho, se ha observado que los

fragmentos de Okazaki poseen en sus extremos 5' segmentos de
ARN de 1 a 60 nucleótidos (esta longitud varía según la especie), que
son complementarios a la hebra de ADN molde y que han funcionado
como cebadores para el inicio de la actividad de la ADN polimerasa.

• E. coli posee dos enzimas que catalizan la formación de estos

cebadores de ARN: la primasa (60 kD), de menor tamaño, que es el
producto monomérico del gen denominado ADNG; y la ARN
polimerasa, la enzima que media la transcripción.

• El ADN ya replicado, maduro, no contiene ningún fragmento de

ARN. Los cebadores de ARN se eliminan durante el proceso de la
replicación y los huecos monohebra que dejan son llenados con ADN.
Ambas funciones las lleva a cabo la ADN Polimerasa I.
 METILACIÓN DEL ADN EN E. coli
• El inicio de la replicación está afectado por la metilación del ADN y
por interacciones con la membrana plasmática bacteriana. El ADN de
oriC es metilado por la metilasa Dam, que metila la adenina en el N6
dentro del palíndrome 5’-GATC.

• La región oriC de E. coli está enriquecida en este tipo de secuencias

GATC: tiene 11 en sus 245 pares de bases.

• Inmediatamente después de la replicación el ADN es semimetilado: las

hebras parentales (moldes) tienen las secuencias oriC metiladas,
mientras que las hebras de nueva síntesis no las tienen.

• Las secuencias oriC semimetiladas son secuestradas a través de una

interacción con la membrana plasmática, que se produce a través de un
mecanismo todavía desconocido.

• Al cabo de un tiempo, oriC es liberado de la membrana plasmática y

debe ser metilado nuevamente de manera completa antes de que
pueda unirse otra vez a la proteína ADNA (FACTOR DE
INICIACIÓN).
CONCEPTO IMPORTANTE: BURBUJA DE REPLICACIÓN
MODELO PROCARIOTA DE REPLICACIÓN DEL “CROMOSOMA”
DE E. coli

CONSTA DE TRES FASES:

• INICIO: secuencias claves en el inicio en el OriC

• ELONGACIÓN: síntesis de la cadena conductora y síntesis de
la cadena rezagada
• TERMINACIÓN: se sabe muy poco de esta etapa, pero al
parecer actuaría una Topoisomerasa IV y una región llamada
ter (t) de terminación.
 FASE DE INICIO O INICIACIÓN DE LA REPLICACIÓN

Ordenamiento en tándem de tres Sitios de fijación de la proteína ADNA (Factor de Iniciación),

secuencias de 13 pb cuatro secuencias de 9 pares de base

Secuencia Consenso Secuencia Consenso

GATCTNTTNTTTT TTATCCACA

OriC

Secuencia Consenso: “Secuencia repetida que varía en alguna medida de una

copia a otra”.
 Molde

FASE DE INICIO Superenrollado

a) Alrededor de 20 moléculas de la proteína

ADNA (Factor de Iniciación), cada una de
ellas con un ATP ligado, se unen
secuencialmente a las cuatro repeticiones
de 9 pares de bases. El ADN se enrolla
alrededor de este complejo.
b) Las tres repeticiones de 13 pares de
bases ricas en A-T se desnaturalizan poco
a poco de forma secuencial e inician la
fusión del ADN. En ello participa la
proteína, tipo histona, HU.
c) Hexámeros de proteína ADNB (Helicasa)
se unen a cada hebra con ayuda de la
proteína ADNC (Chaperona de ADNB) y
de la hidrólisis de ATP. La actividad de
Helicasa de la ADNB desenrolla aún más
el ADN y forma las horquillas de
replicación como preparación para el Cebado y

cebado y la síntesis de ADN. replicación

FASE DE INICIO O INICIACIÓN DE LA REPLICACIÓN
FASE DE INICIO O INICIACIÓN DE LA REPLICACIÓN
IMPORTANCIA DE LA POL III EN LA REPLICACIÓN DEL
ADN EN E. coli

• A diferencia de lo que ocurre con la ADN Pol I, que sólo

debe añadir unos 5-10 nucleótidos de los lugares en que se
ha eliminado el cebador, es importante que la ADN Pol III
sí sea muy procesiva, y por esa razón suele formar parte
de un complejo denominado holoenzima ADN Pol III que
le da una mayor procesividad.

• Este complejo consta de diversas subunidades

polipeptídicas encargadas cada una de una función, y que
constituyen en su conjunto un dímero asimétrico: una
mitad se encarga de la síntesis de la hebra adelantada
y la otra mitad de la hebra rezagada.
 HOLOENZIMA ADN POL III

El centro catalítico lo componen las

subunidades α (alfa) que
corresponden a dos copias de la
ADN Pol III, la subunidad ε (épsilon)
con actividad correctora
exonucleasa 3' → 5' y la subunidad
θ (theta) cuya función podría ser la
de ensamblar las otras dos.
Las subunidades τ (tau) mantienen la
estructura dimérica; el complejo  lo
conforman las subunidades 
(gamma) y δ (delta) cuya función es
la de aumentar la procesividad de la
ADN Pol III; la subunidad β
(abrazadera o “Clamp”) sujeta la
ADN Pol III al ADN y aumenta
notablemente su procesividad.
FASE DE INICIO O INICIACIÓN DE LA REPLICACIÓN
 FASE DE ELONGACIÓN

• El ADN de doble cadena en la horquilla de replicación es desenrollado

por la actividad de la Helicasa (generalmente la proteína ADNB)
• La Topoisomerasa II (ADN girasa), utiliza la hidrólisis del ATP para
producir un desenrollamiento negativo del ADN justamente adelante de
la horquilla, lo cual alivia el torque creado por la replicación.
• Puesto que la cadena retrasada forma un asa antes de entrar al sitio
activo de la Polimerasa III, tanto la cadena retrasada, como la
conductora se mueven en la misma dirección. Según la Helicasa progresa,
se debe sintetizar un nuevo cebador en la cadena retrasada.
• Cuando se termina la síntesis de un fragmento de Okazaki, la
Polimerasa libera la cadena. En ese momento el Primosoma sintetiza otro
cebador y se inicia la síntesis de un nuevo fragmento de Okazaki.
• La Pol III se asocia nuevamente a la cadena retrasada justamente
después del nuevo cebador e inicia la síntesis de un nuevo fragmento de
Okazaki.
• La Pol I y la ADN Ligasa, suprimen el cebador y cierran los huecos entre
los segmentos de Okazaki.
FASE DE ELONGACIÓN
FASE DE ELONGACIÓN
FASE DE ELONGACIÓN
FASE DE ELONGACIÓN: SÍNTESIS COORDINADA DE
AMBAS HEBRAS
 FASE DE TERMINACIÓN

• La replicación termina cuando la horquilla de replicación encuentra

el extremo de la otra horquilla de replicación que ha progresado en
el cromosoma circular. Esto sucede en una región llamada ter (t) de
terminación.
• La Región ter está compuesta de dos secuencias de 20 pares de
bases, invertida una con respecto a la otra y separadas entre sí
por un segmento de unas 20 pares de bases.
• Cada una de las secuencias ter impide la progresión de la horquilla
de replicación que progresa en sentido contrario cuando una
proteína de 36 kD, llamada de unión a ter (Tus), está ya fijada en
esta región del cromosoma. Este mecanismo asegura que el
cromosoma sea replicado en su totalidad sin sobrereplicación.
• La manera como se separan las dos hélices de ADN hijas no ha
podido ser determinada, aunque se supone que está involucrada en el
proceso la actividad de una Topoisomerasa IV.
FASE DE TERMINACIÓN
LA MAQUINARIA
DE LA
REPLICACIÓN
REPLICACIÓN EN EUCARIOTAS
 REPLICACIÓN EN EUCARIOTAS
• Es similar a la de los procariontes, es decir, semi-conservadora,
semi-discotinua y bidireccional.
• Existe una hebra conductora y una hebra retrasada con
fragmentos de Okazaki.
• Se inicia en ORI (puede haber unos 100 o más orígenes a la vez).
• El proceso es mucho mejor regulado y más complejo por estar
estrictamente adecuado al ciclo celular.
• Entre las diferencias, se comienza con las polimerasas, son más
complejas, y además, la polimerasa de la hebra continua es
diferente a la de la hebra discontinua.
• Las helicasas difieren en estructura, las primasas se encuentran
adosadas a la ADN-pol α.
• El resto del proceso es muy parecido.
• El ARN cebador es retirado por el complejo de reparación de la
célula.
 COMPLEJIDAD DE LA CROMATINA
En los eucariotas, el ADN se encuentra bloqueado por Histonas y otras
proteínas nucleares (formando cromatina) y es, por lo tanto, imposible que
pueda ser replicado sin mecanismos especiales de regulación. En los
eucariotas, por lo tanto, para que la replicación pueda siquiera iniciar, la
cromatina debe ser primero re-estructurada.
 ASPECTOS RELEVANTES DE LA REPLICACIÓN DEL ADN
EN EUCARIOTAS

• En los eucariotas la replicación del ADN se realiza

exclusivamente durante la fase S del ciclo celular
• La cromatina menos condensada (eucromatina), se replica
temprano, mientras que los genes en la cromatina condensada
(heterocromatina) se replican tarde.
• Secuencias bien definidas en el ADN de un eucariota sencillo,
como la levadura, funcionan como Orígenes de Replicación.
• En los mamíferos las secuencias de ADN que especifican el
Origen de Replicación han sido hasta ahora difíciles de
identificar.
• Una vez que la nueva cadena abandona la horquilla de
replicación, el ADN se reestructura formando nuevamente
nucleosomas.
• Se requiere un complejo especial, la Telomerasa, para replicar
los extremos finales de los cromosomas.
• La longitud del telómero, es regulada por la célula y por el
organismo.
 ASPECTOS RELEVANTES DE LA REPLICACIÓN DEL ADN
EN EUCARIOTAS

• Más compleja y más lenta que en procariotas por el mayor

tamaño y complejidad del genoma.
• Múltiples orígenes de replicación. Cada uno representa una
unidad de replicación (replicón) bidireccional.
• La replicación se encuentra regulada de acuerdo con el ciclo
celular. La Síntesis de ADN está limitada a la fase S, y
coordinada con la división celular (mitosis).
• Los eucariotas poseen cinco ADN polimerasas de función más
bien conocida:
₋ Α (alfa): inicia la síntesis
₋ Β (beta): función de reparación
₋ Γ (gamma): replicación del genoma mitocondrial
₋ δ (delta): elongación (hebra retrasada)
₋ Ε (épsilon): elongación (hebra conductora) y otros papeles
desconocidos.
 ADN POLIMERASAS EN EUCARIOTAS
Existen por lo menos 15 ADN polimerasas, pero como se ha
indicado, las más importantes son cinco:
1. Pol α (también llamada Primasa): una subunidad pequeña (Pri S)
funciona como Primasa (sintetiza el ARN cebador), la subunidad
mayor, con la actividad de polimerasa de la Pol α, alarga el cebador
utilizando desoxinucleótidos trifosfatos. Después de agregar unos
20 nucleótidos se separa y el resto del alargamiento es realizado
por la Pol ε (en la hebra conductora) y por la Pol δ (en la hebra
retrasada).
2. Pol β: Esta implicada en la reparación del ADN, en la eliminación de
bases y en el rellenado de espacios dejados en la hebra retrasada.
3. Pol γ: Replica y repara el ADN mitocondrial.
4. Pol δ: Altamente procesiva y con actividad exonucleasa 3'→5’ para
corregir errores. Es la polimerasa que se encarga de la replicación
de la hebra retrasada.
5. Pol ε: Altamente procesiva y con actividad exonucleasa 3'→5’ para
corregir errores. Es la polimerasa que se encarga de la replicación
de la hebra conductora.
ADN POLIMERASAS EN EUCARIOTAS
ADN POLIMERASAS EN EUCARIOTAS
¿QUÉ OCURRE CON LAS HISTONAS DURANTE LA
REPLICACIÓN?
¿QUÉ OCURRE CON LAS HISTONAS DURANTE LA
REPLICACIÓN?
¿QUÉ OCURRE CON LAS HISTONAS DURANTE LA
REPLICACIÓN?
 ORÍGENES DE REPLICACIÓN EN EUCARIOTAS

• Los orígenes de replicación

son los puntos fijos, situados
en la doble hélice de ADN, a
partir de los cuales se lleva
cabo la replicación, que avanza
de forma secuencial formando
estructuras con forma de
horquilla.

• La cantidad de ADN que se

puede sintetizar a partir de
un único origen de replicación
se denomina replicón o unidad
funcional de replicación.

• En organismos eucarióticos, la replicación del ADN se inicia en múltiples

orígenes a la vez (hay uno cada 20 kb aproximadamente), es decir, hay
multitud de replicones.
 ORÍGENES DE REPLICACIÓN EN EUCARIOTAS
• Todos los sitios que marcan en el ADN el Origen de Replicación Eucariota,
requieren dos componentes centrales:
1. Uno o más sitios de fijación específicos para el Complejo Proteico de
Reconocimiento del Origen (ORC), que se fija a una secuencia del ADN.
En levaduras a estos sitios se le ha llamado Secuencia de Replicación
Autónoma (ARS). Por tanto, OriC ~ ARS.
2. Una secuencia más o menos larga de ADN que pueda desenrollarse con
facilidad, llamada Elemento para Desenrollar el ADN (DNA-unwinding
element, DUE). Esta secuencia DUE no es una secuencia específica,
pero debe tener una composición de nucleótidos que le dé una baja
temperatura de fusión.
• El desenrollamiento del ADN se inicia en el DUE, y una vez producido, la
síntesis de ADN puede iniciarse en cada una de las hebras de ADN
resultantes.
• Componentes adicionales auxiliares para este proceso son indispensables, e
incluyen uno o más sitios para factores de replicación que faciliten la
fijación de otras proteínas complementarias así como la aceleración del
desenrollamiento del ADN, pero que no son indispensables para el
reconocimiento del origen.
 RESUMEN REPLICACIÓN EN EUCARIOTAS

Complejo de Pre-Replicación

Complejo de Pre-Iniciación

Elongación del ADN

 RESUMEN REPLICACIÓN EN EUCARIOTAS

Complejo de Pre-
Replicación

• Origen de Replicación:
formado por la
Secuencia de
Replicación Autónoma
(ARS) + el Elemento
para Desenrollar el
ADN (DUE).
• Complejo de
Reconocimiento del
Origen (ORC): se fija a
la Secuencia de
Replicación Autónoma
(ARS) .
• Cdc6 (Cdc18) y Cdt1.
• Proteínas
Minicromosomales de
Mantenimiento (MCMs):
actividades de fijación
al ADN de hebra
sencilla, de ATPasa
dependiente del ADN y
ADN Helicasa.
COMPLEJO DE PRE-REPLICACIÓN (pre-RC) EN EUCARIOTAS

• Un Complejo de Pre-replicación (pre-RC) es un complejo proteico que

se estructura en el punto de origen de la replicación (Ori) durante la
fase de iniciación de la replicación del ADN.
• En los eucariontes, el pre-RC está compuesto de los siguientes factores:
1. Un complejo de seis subunidades llamado Complejo de
Reconocimiento del Origen (ORC) que se fija a las secuencias de la
doble hebra de ADN que señalan el origen (ARS).
2. Dos proteínas reguladoras llamadas Cdc6 (Cdc18) y Cdt1 que son
reclutadas por el ORC.
3. Las MCMs o Proteínas Minicromosomales de Mantenimiento
(Minichromosome Maintenance proteins), un complejo proteico que
tal vez corresponde a la helicasa en eucariotes y que desplaza al
Cdt1.
• Todos estos factores se ensamblan en los orígenes de replicación
durante la fase G1 del ciclo celular.
• Una vez que estas proteínas estén ensambladas y la célula pasa de la
fase G1 a la fase S, las MCMs son fosforiladas y se inicia realmente la
replicación.
DETALLEMOS UN POCO MÁS….

COMPLEJO DE RECONOCIMIENTO DEL ORIGEN (ORC) EN

EUCARIOTAS
• En la levadura, se demostró inicialmente que un complejo proteico,
formado por 6 subunidades diferentes, conocido como ORC (Complejo
de Reconocimiento del Origen) se fija selectivamente a la Secuencia
de Replicación Autónoma (ARS) en un mecanismo dependiente de ATP.

• Este complejo, ORC, permanece unido al sitio de origen, ARS, durante

todo el ciclo celular, incluyendo la mitosis, y durante la replicación se
asocia con otras proteínas, un evento que dispara la iniciación de la
replicación del ADN.

• Células de levadura con mutaciones en cualquiera de las seis proteínas

que forman el ORC son incapaces de dividirse.

• Todas las células eucariotas expresan homólogos de estas proteínas,

atestiguando su importancia esencial en la iniciación de la replicación
del ADN en estos organismos.
DETALLEMOS UN POCO MÁS….
FOSFORILACIÓN DE MCMs (PROTEÍNAS
MINICROMOSOMALES DE MANTENIMIENTO) EN
EUCARIOTAS
• La fosforilación del complejo MCM ocurre al iniciarse la fase S del
ciclo celular y se produce por el reclutamiento de la Cdc7-Dfb4
quinasa al complejo de origen.
• La fosforilación del complejo MCM provoca un cambio de
conformación del complejo que resulta en la separación del ADN en el
sitio de origen. Se postula que este cambio conformacional convierte el
complejo MCM inactivo en una Helicasa activa, cuya estructura
anular se une topológicamente al ADN.
• La activación y disociación del complejo MCM-Helicasa y del Mcm10,
debido a la fosforilación inducida por Cdc45, inicia la separación del
ADN y permite el reclutamiento de la Primasa, la Proteína de
Replicación A (RPA) y la ADN Polimerasa para iniciar realmente la
replicación del ADN.

CONCLUSIÓN: La fosforilación del complejo MCM es necesaria para

iniciar realmente la replicación del ADN.
• Durante la transición Mitosis-Fase G1, el ORC fijo al ADN recluta a Cdc6 (Cdc18) y Cdt1,
lo cual propicia la fijación del complejo de la Helicasa que consiste del complejo MCM 2-
7. Esto resulta en la formación del complejo llamado de pre-replicación (Pre-RC).
• El Pre-RC recluta nuevos factores, incluyendo Cdc45, Sld2-3, Dpb11, el complejo GINS
(Sls1 y Psr1-3) y el Mcm10 para formar el complejo de pre-Iniciación (Pre-IC).
• La iniciación misma requiere ahora la fosforilación de algunas de estas proteínas.
 RESUMEN REPLICACIÓN EN EUCARIOTAS

Complejo de Pre- Complejo de Pre-

Replicación Iniciación

• Origen de Replicación: • Factores de Iniciación:

formado por la Cdc45, Sld2-3, Dpb11,
Secuencia de el complejo GINS (Sls1
Replicación Autónoma y Psr1-3) y el Mcm10.
(ARS) + el Elemento • La iniciación misma
para Desenrollar el requiere ahora la
ADN (DUE). fosforilación de
• Complejo de algunas de estas
Reconocimiento del proteínas.
Origen (ORC): se fija a
la Secuencia de
Replicación Autónoma
(ARS) .
• Cdc6 (Cdc18) y Cdt1.
• Proteínas
Minicromosomales de
Mantenimiento (MCMs):
actividades de fijación
al ADN de hebra
sencilla, de ATPasa
dependiente del ADN y
ADN Helicasa.
PRE-INICIO DE LA REPLICACIÓN EN EUCARIOTAS
 RESUMEN REPLICACIÓN EN EUCARIOTAS

Complejo de Pre- Complejo de Pre- Elongación del ADN

Replicación Iniciación • Primasa: síntesis del ARN cebador (8-12
nt).
• Origen de Replicación: • Factores de Iniciación: • ADN Pol α: sintetiza un segmento corto
formado por la Cdc45, Sld2-3, Dpb11, de ADN, llamado ADN iniciador (iADN,
Secuencia de el complejo GINS (Sls1 30 nt).
Replicación Autónoma y Psr1-3) y el Mcm10. • Factor de Replicación C o Complejo
(ARS) + el Elemento • La iniciación misma Accesorio de la Polimerasa (RFC): se
para Desenrollar el requiere ahora la asocia al ADN y ayuda a la ADN
ADN (DUE). fosforilación de Polimerasa, δ o ε, a fijarse
• Complejo de algunas de estas adecuadamente al ADN, y estructura la
Reconocimiento del proteínas. abrazadera (PCNA).
Origen (ORC): se fija a • Abrazadera Deslizante o Antígeno
la Secuencia de Nuclear de Proliferación Celular
Replicación Autónoma (PCNA): asegura procesividad.
(ARS) . • Factor de Replicación A (RFA o RPA):
• Cdc6 y Cdt1. proteínas de unión (estabilizadoras) del
• Proteínas ADN de hebra sencilla (SSB).
Minicromosomales de • ADN Pol δ: síntesis de la hebra
Mantenimiento (MCMs): retrasada
actividades de fijación • ADN Pol ε: síntesis de la hebra
al ADN de hebra conductora
sencilla, de ATPasa • RNasaH1/FEN: Eliminación de
dependiente del ADN y Cebadores.
ADN Helicasa. • ADN girasa o Topoisomerasa 2: alivia el
superenrollamiento.
PROTEÍNAS DE REPLICACIÓN A (RPA) EN EUCARIOTAS:
ETAPA DE ELONGACIÓN

• RPA (también llamada Factor de Replicación A, RFA)

corresponde, en los eucariotas, a las proteínas de unión
(estabilizadoras) del ADN de hebra sencilla, SSB.
• Es un hétero trímero proteico, cuyos componentes son todos ellos
esenciales para los eucariotas.
• Este complejo proteico, RPA o SSB, es un componente esencial en
todos los sistemas de replicación, procariotas y eucariotas.
• Estas proteínas recubren el ADN de hebra sencilla por detrás de la
Helicasa, protegiéndolo del ataque por exonucleasas e impidiendo
que vuelva a formar hebras dobles entre las bases componentes.
• La RPA estimula la actividad de la ADN Polimerasa creando un
sustrato uniforme para su actividad y parece desempeñar un papel
importante en la coordinación de la síntesis de ADN en la hebra
retardada.
ADN PRIMASA EN EUCARIOTAS: ETAPA DE ELONGACIÓN

• Las ADN polimerasas en eucariotas también requieren de cortos

segmentos de ARN que actúen como cebadores.
• En eucariotas, la ADN Primasa es parte de un complejo tetraunitario
(pesos moleculares 180, 68, 58 y 48 kDa), el complejo Pol α/Primasa.
Dos de estas subunidades, p48 y p58, son requeridas para la actividad
de Primasa, siendo P48 la subunidad catalítica.
• La Primasa sintetiza segmentos cortos de ARN (8–12 nucleótido)
que son alargados por la Pol α hasta unos 30 nucleótidos, formando
fragmentos pre-Okazaki.
• Estos híbridos de ARN-ADN son reconocidos por el Complejo
Accesorio de la Polimerasa o Factor de Replicación C (RFC) para
iniciar la síntesis procesiva de ADN por la polimerasa replicativa (Pol δ
o Pol ε).
• En la hebra retrasada, la actividad de la Pol α/Primasa es requerida
para la iniciación de la síntesis de cada uno de los fragmentos de
Okazaki.
 ETAPA DE ELONGACIÓN
Unión de la Primasa y síntesis del ARN
cebador. Después se une la ADN Pol α
y sintetiza un corto segmento de ADN,
llamado ADN iniciador (iADN).

El Factor de Replicación C o
Complejo Accesorio de la Polimerasa
(RFC) se asocia al ADN y ayuda a la
ADN Polimerasa, δ o ε, a fijarse
adecuadamente a la hebra molde de
ADN.

Se posiciona la ADN polimerasa

adecuada (Pol δ para la síntesis de la
hebra retrasada, y posiblemente Pol ε
para la síntesis de la hebra
conductora) y después se carga la
Abrazadera Deslizante o Antígeno
Nuclear de Proliferación Celular
(PCNA) que asegura su procesividad.

Se inicia el alargamiento de la nueva

cadena de ADN, catalizada por la
Polimerasa δ (en el caso de la hebra
retrasada).
ANTÍGENO NUCLEAR DE CÉLULAS EN PROLIFERACIÓN
(PCNA)
DETALLEMOS UN POCO MÁS….

“FACTOR DE REPLICACIÓN C” O COMPLEJO ACCESORIO

DE LA POLIMERASA (RPC) EN EUCARIOTAS

• El RFC representa en los eucariotas, el complejo proteico encargado de

estructurar la abrazadera (PCNA) alrededor del ADN. Es un hétero
pentámero, cuyas cinco subunidades son indispensables para realizar su
actividad.

• El RFC reconoce el extremo 3’ del pre-fragmento de Okazaki y, mediante

la hidrólisis del ATP, ensambla el PCNA alrededor de la doble cadena de
ADN.

• Se ha demostrado que el RFC, junto con el RPA (símil de las SSB), ejerce
un papel como disparador en el proceso que elimina del ADN el complejo
Pol α/Primasa, permitiendo así el ensamblaje del PCNA.

• Además de su papel como ensamblador de la abrazadera, se ha demostrado

que el RFC también debe actuar como su desensamblador, es decir, en la
descarga del PCNA de su posición alrededor del ADN.
 MECANISMO DE ELIMINACIÓN DE CEBADORES:
RNasaH1/FEN

• Las Ribonucleasas, abreviadas

comúnmente como RNasa, son
enzimas (nucleasas) que
catalizan la hidrólisis de ARN en
componentes más pequeños.
Pueden dividirse en
endonucleasas y exonucleasas.
• Las Ribonucleasas H son
enzimas que degradan ARN del
híbrido ARN/ADN que se forma
durante la replicación y
reparación.
• Existen dos tipos de
ribonucleasa tipo H en
eucariotas: La RNasa H1 y la
RNasa H2.
 MECANISMO DE ELIMINACIÓN DE CEBADORES:
RNasaH1/FEN

• La eliminación del cebador se

realiza en dos etapas a cargo de
2 enzimas: Rnasa H1 y FEN1.
• Rnasa H1 degrada el cebador
de ARN hasta dejar un solo
ribonucleótido en el extremo del
fragmento de Okazaki.
• FEN1 (endonucleasa fap1),
elimina el último ribonucleótido.
MECANISMO DE ELIMINACIÓN DE CEBADORES:
RNasaH1/FEN
 TOPOISOMERASAS DE ADN EN EUCARIOTAS

• Todas nuestras células poseen dos tipos de topoisomerasas capaces

de relajar la tensión helicoidal del ADN.

• Curiosamente, sus mecanismos de acción son muy distintos:

 La Topoisomerasa 1, corta sólo una de las dos hebras del ADN. La hebra
intacta actúa entonces como pivote y el ADN rota axialmente. Su
actividad no depende de ATP.
 La Topoisomerasa 2 (ADN Girasa), corta simultáneamente las dos
hebras del ADN y permite cruzar – a través de dicho corte – a otra doble
hélice de ADN. Este efecto de la Topoisomerasa 2 requiere la inversión
de energía producida por la hidrólisis del ATP. Con este mecanismo, las
hebras de ADN se comportan como "cadenas fantasma", ya que un
segmento de ADN puede "atravesar" a otro como si no estuviera gracias a
una "puerta" temporal abierta por la topoisomerasa 2. La topoisomerasa 2
hace desaparecer de este modo – uno a uno – todos los nudos y
entrecruzamientos del ADN generados por la tensión helicoidal.
 ADN GIRASA EN EUCARIOTAS

• La ADN girasa (o Topoisomerasa 2),

es una de las topoisomerasas de ADN
que actúa durante la replicación del
ADN para reducir la tensión molecular
causada por el superenrollamiento. La
ADN girasa produce cortes de doble
cadena y después los une.

• La ADN girasa, como topoisomerasa, tiene una función muy

importante en la modulación del estado topológico del ADN, pues
regula su estructura superhelicoidal.

• RECORDAR: La Topoisomerasa 1 corta solo una de las dos cadenas

de la doble hélice del ADN y actúa en la transcripción del ADN.
Mientras la ADN girasa o Topoisomerasa 2 corta ambas cadenas
del ADN para aliviar el superenrollamiento, y actúa durante la
replicación del ADN.
 RESUMEN REPLICACIÓN EN EUCARIOTAS

Complejo de Pre- Complejo de Pre- Elongación del ADN

Replicación Iniciación
• Primasa: síntesis del ARN cebador (8-
• Origen de Replicación: • Factores de Iniciación: 12 nt).
formado por la Cdc45, Sld2-3, Dpb11, • ADN Pol α: sintetiza un segmento
Secuencia de el complejo GINS (Sls1 corto de ADN, llamado ADN iniciador
Replicación Autónoma y Psr1-3) y el Mcm10. (iADN, 30 nt).
(ARS) + el Elemento • La iniciación misma • Factor de Replicación C o Complejo
para Desenrollar el requiere ahora la Accesorio de la Polimerasa (RFC): se
ADN (DUE). fosforilación de asocia al ADN y ayuda a la ADN
• Complejo de algunas de estas Polimerasa, δ o ε, a fijarse
Reconocimiento del proteínas. adecuadamente al ADN, y estructura
Origen (ORC): se fija a la abrazadera (PCNA).
la Secuencia de • Abrazadera Deslizante o Antígeno
Replicación Autónoma Nuclear de Proliferación Celular
(ARS) . (PCNA): asegura procesividad.
• Cdc6 y Cdt1. • Factor de Replicación A (RFA o
• Proteínas RPA): proteínas de unión
Minicromosomales de (estabilizadoras) del ADN de hebra
Mantenimiento (MCMs): sencilla (SSB).
actividades de fijación • Pol δ: síntesis de la hebra retrasada
al ADN de hebra • Pol ε: síntesis de la hebra conductora
sencilla, de ATPasa • RNasaH1/FEN: Eliminación de
dependiente del ADN y Cebadores.
ADN Helicasa. • ADN girasa o Topoisomerasa 2:
alivia el superenrollamiento.
SÍNTESIS DE LA HEBRA CONDUCTORA EN EUCARIOTAS

• La hebra conductora es sintetizada continuamente.

• Se inicia con un solo cebador de ARN (primer) que es sintetizado,

según la especie, por una ARN polimerasa o por la Primasa.

• Una vez que la Helicasa y la Polimerasa son cargadas sobre el molde

de ADN, teóricamente, pueden permanecer unidas a éste hasta
terminar la síntesis completa del cromosoma.

• La subunidad τ del cargador de la Abrazadera conecta la

holoenzima de la Polimerasa con la Helicasa.

• La velocidad de síntesis de la Polimerasa, cuando se encuentra fija

en la horquilla de replicación junto con la Helicasa, es mucho mayor
que cuando ambas enzimas trabajan de manera aislada.
 SÍNTESIS DE LA HEBRA RETRASADA EN EUCARIOTAS

• Puesto que la hebra retrasada es construida por la unión de varios

segmentos cortos, existe un ciclo de reacciones necesarias para
iniciar, alargar y reunir cada uno de los fragmentos recién
sintetizados con el resto de la cadena.

• Puesto que la hebra retrasada y la hebra conductora son

sintetizadas por la misma estructura retenida sobre el ADN molde
por las abrazaderas, este ciclo de reacciones debe estar muy bien
coordinada, no solamente entre ellas mismas, sino con las
reacciones de síntesis de la hebra conductora.

• El ciclo de reacciones que son necesarias para la síntesis de la

hebra retrasada se completan en tiempos muy breves, pocos
segundos, a causa de que cada fragmento está formado por
1.000–3.000 bases, y la replicación se realiza a 400–1.000
bases/segundo.
PROBLEMAS EN LA REPLICACIÓN DE LOS EXTREMOS DE
LOS CROMOSOMAS EN EUCARIOTAS: LOS TELÓMEROS

• Las moléculas ADN doble hélice lineal tienen problemas para

replicar sus extremos, ya que las ADN polimerasas necesitan un
extremo 3' OH al que ir añadiendo nucleótidos.

• Uno de los extremos de cada hélice (el extremo 5') se puede copiar
sin problemas debido a que viene cebado desde atrás, sin embargo,
el extremo contrario (extremo 3') no podría replicarse ya que no
puede ser cebado desde atrás.

• Como consecuencia quedaría un corto segmento al final sin copiarse

y se iría acortando el ADN por ese extremo en cada ronda de
replicación.
PROBLEMAS EN LA REPLICACIÓN DE LOS EXTREMOS DE
LOS CROMOSOMAS EN EUCARIOTAS: LOS TELÓMEROS
 ¿QUE SON LOS TELÓMEROS?

Los telómeros (del griego telos, "final" y meros, "parte")

son los extremos de los cromosomas.

Son regiones de ADN no codificante, altamente

repetitivas, cuya función principal es la estabilidad
estructural de los cromosomas en las células eucariotas,
la división celular y el tiempo de vida de las estirpes
celulares. Además están involucradas en enfermedades
tan importantes como el cáncer.

En los organismos procariotas, los cromosomas son

circulares y no poseen telómeros.
ALGUNAS CARACTERÍSTICAS DE LOS TELÓMEROS

• Ricos en G que se encuentran

localizadas en los extremos de
los cromosomas eucariontes.

• Tanto el ADN como las

proteínas que los constituyen
presentan características
singulares que los diferencian
del resto del cromosoma.
ALGUNAS CARACTERÍSTICAS DE LOS TELÓMEROS

Los telómeros humanos contienen hasta 2.000

veces repetida la secuencia 5' TTAGGG 3':

5'...TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG..3'

3'...AATCCC AATCCC AATCCC AATCCC AATCCC AATCCC..5'
ALGUNAS SECUENCIAS TELOMÉRICAS
ALGUNAS SECUENCIAS TELOMÉRICAS
 ¿QUIÉNES LO DESCRIBIERON?

 Los científicos Elizabeth H. Blackburn,

Carol W. Greider y Jack W. Szostak son
reconocidos con el Premio Nobel de
medicina en 2009 por:

1. La descripción molecular de los

telómeros.
2. La demostración de su conservación
evolutiva.
3. El descubrimiento de la telomerasa,
enzima central de la maquinaria celular
para la síntesis del telómero.
 TERMINACIÓN DE LA REPLICACIÓN

 Blackburn, Greider y Szostak lograron un modelo

muy consistente que explica el «problema de la
terminación de la replicación» (end-replication
problem) y el mecanismo molecular de protección de
los extremos cromosomales.

 La enzima ADN Polimerasa no puede copiar todos los

genes contenidos en los cromosomas, finalizando la
replicación al llegar al telómero que se va haciendo
cada vez más y más corto en cada replicación.
DUPLICACIÓN A NIVEL DE TELÓMEROS
 CARACTERÍSTICAS DE LOS TELÓMEROS

1. El extremo del ADNt “no se

replica”, entonces se va acortando
en sucesivas divisiones celulares.
2. Evitan la fusión de los cromosomas
al ponerse en contacto con sus
extremos (profase de la meiosis).
3. Impiden la degradación de los
cromosomas.
4. Los telómeros forman estructuras
mas complejas llamadas “t-loops”
en el extremos 3´ libre del ADNt
que ocultan el extremo del
cromosoma.

Así protegen a la célula contra ensamblajes no

homólogos.
 TELOSOMA
El telosoma también llamado “complejo protector o shelterina”, es un complejo
proteico, perteneciente al grupo de proteínas de unión a telómeros (TBPs), que se
une al extremo final del ADN telomérico, que a su vez está situado en los
extremos de los cromosomas de eucariotas. Su núcleo está formado por seis
subunidades, POT1, TRF1 y TRF2, que se unen directamente al ADN, y TIN2, TPP1
y RAP1, que cumplen otras funciones. A su vez, este núcleo se une o interactúa más
o menos temporalmente con un gran número de otras proteínas no específicas de
telómeros, llamadas en ocasiones proteínas asociadas o accesorias al telosoma,
como PINX1 o Apollo.
 CONSECUENCIAS DEL ACORTAMIENTO

 La pérdida de la estructura telomérica

conduce a la inestabilidad genómica.

 El mantenimiento de telómeros es un
determinante importante en el potencial
replicativo de la célula.

 Telómeros disfuncionales o cortos producen

una vida útil corta en células que los posean.
 TELÓMEROS Y
ESTABILIDAD GENÓMICA
 ANTECEDENTES

 Antes de que los telómeros fueran descritos

molecularmente, ya se reconocía una diferenciación en
los extremos de los cromosomas.
 Las abundantes evidencias apoyan la idea de que el
ADNt y las proteínas asociadas contribuyen a
mantener la fidelidad cariotípica.

¿Como se logra mantener la estructura

telomérica?

Por acción de la enzima “telomerasa”

Pero, ¿Sólo ella es responsable de esta acción?
 ACORTAMIENTO TELÓMEROS

ADNt
5´ 3´
3´ 5´

replicación
5´ 3´

Acortamiento del ADNt

3´ 5´ “Problema a resolver”
Acción de la
Telomerasa
5’ 3’
3’ 5’
ACORTAMIENTO TELÓMEROS
 CARACTERÍSTICAS DE LA TELOMERASA

• La telomerasa es una
transcriptasa reversa, que actúa
como una polimerasa específica
de ADNt (sintetiza ADN)
dependiente de ARN (a partir de
un molde de ARN).
• Sintetiza repeticiones
teloméricas que se pierden en la
replicación (TTAGGG) a partir de
un molde de ARN.
• Se reconoce que su expresión es
solo transitoria en células
normales.
 CARACTERÍSTICAS DE LA TELOMERASA

La telomerasa está formada

por un complejo proteína-ácido
ribonucleico con actividad
polimerasa, que es producida
en células germinales
embrionarias que permite el
alargamiento de los telómeros.

La telomerasa es reprimida en las células somáticas maduras

después del nacimiento, lo que producen un acortamiento del
telómero después de cada división celular. En adultos su
producción se restringe a determinados tipos celulares tales
como las células madre adultas, los órganos
hematopoyéticos y las células reproductoras.
 CARACTERÍSTICAS DE LA TELOMERASA

Residuo de la
“Dedos” Proteicos
ARN Polimerasa
de la Telomerasa

Región de la ARN
Telomerasa usado
como Templado

“Palma” – Sitio
Activo de la Proteína
Telomerasa
Telómero
Resto del del ADN “Pulgar”
recién
Cromosoma
sintetizado
 OTRAS ENZIMAS

• Otra enzima implicada en la replicación del telómero es

la RecQ helicasa de Werner.
• La RecQ se encuentra defectuosa en el síndrome de
progeria (envejecimiento temprano) de Werner.
• Las células de estos pacientes muestran inestabilidad
genómica y pobre potencial proliferativo.
• Esto sugiere que:

“La RecQ esta implicada en el mantenimiento

telomérico”
PROGERIA O SÍNDROME DE HUTCHINSON-GILFORD
 EFECTOS DEL CAMBIO EN TELÓMEROS Y
TELOMERASAS EN CÉLULAS NORMALES Y MALIGNAS

TELÓMEROS Células NORMALES Células MALIGNA

Elongación Posiblemente tóxico? Inmortalidad
Regeneración
Acortamiento disminuida suprime la Muerte celular
formación de tumor

TELOMERASAS Células NORMAL Células MALIGNA

Facilita la Promueve la
Sobreexpresión inmortalidad y Inmortalidad del
regeneración tisular tumor
Limita otras Limita la vida útil
Supresión funciones de la vida celular
celular?
EFECTOS DEL CAMBIO EN TELÓMEROS Y
TELOMERASAS
 CONCLUSIONES TELÓMEROS Y TELOMERASA

• Queda claro que la biología alterada de los

telómeros tiene efectos en la estabilidad
genómica y la esperanza de vida celular,
desempeñando un papel importante en el
desarrollo del cáncer.

• Además, los telómeros y la telomerasa

desempeñan un rol importante en la fisiología
normal de la célula.
 CONCLUSIONES TELÓMEROS Y TELOMERASA

“Tener una comprensión más profunda de

estas funciones adicionales para los
telómeros y la telomerasas promete
proporcionar ideas importantes en la
biología del cáncer, del envejecimiento y
la medicina regeneradora”
Alguna Aplicación….
Alguna Aplicación….
TeloYears®
Diferencias en la Replicación entre Procariotas y
Eucariotas
 REPLICACIÓN DE ADN MITOCONDRIAL

OL
OL
OL

• Dos hebras: hebra ligera (L) y otra OH

pesada (H).
• Se inicia la replicación de la nueva
hebra L, sin que se comience la
replicación de la nueva hebra H.
• El origen de replicación de la hebra OL

L es diferente al de la hebra H, de
forma que existen dos orígenes de
replicación diferentes, uno para
cada una. OH

• La síntesis es unidireccional y
avanza desplazando a la otra
hebra. OH
 REPLICACIÓN DE ADN MITOCONDRIAL

OL
OL
OL

OH
• Cuando se han sintetizado
aproximadamente dos tercios de
la nueva hebra L, comienza la
síntesis de la nueva hebra H, en
una sola dirección, opuesta a la
de síntesis de la hebra ligera L.
OL

• Por consiguiente, la síntesis de la

nueva hebra L termina antes que
la de la nueva hebra H.
OH

OH
REPARACIÓN DEL ADN
 REPARACIÓN Tolerancia

DAÑO AL
ADN

Activación del Apoptosis

Control

Detención del
Ciclo Celular

• Daño: Se refiere a cambios químicos en el ADN.

• Mutación: Se refiere a cambios en la secuencia de bases del ADN.
Existen múltiples maneras para dañar el ADN…

Agentes Físicos:

• Radiación UV solar  Dimerización de pirimidinas (T·T, C·T y

C·C).
• Rayos X y gama  Ionizan a las moléculas que rodean el ADN
(como el agua), generando especies altamente reactivas que
rompen una o ambas cadenas.
Un alto en el camino…

La Luz como Fuente de Energía

Según la “teoría cuántica”, todo fotón posee energía, la que depende de la
longitud o frecuencia de la onda asociada, la que está dada por la relación de
Max Planck:

E = h x f , como la relación entre h y f está dada por f = h / 

Entonces se tiene que: E = h x c



E = energía del fotón emitido o absorbido (en Joule)

f = frecuencia de la onda asociada al fotón (Hz)
 = longitud de onda (m)
c = velocidad de la luz en el vacío (3*108 m/s)
h = constante de Planck, 6,6*10-34 (Js)
Agentes Químicos:

• Naturales → Por ejemplo: Toxinas que forman aductos

covalentes con el ADN.

• Sintéticos → Etilmetanosulfonato EMS (acetilación),

Nitrosaminas (metilación).

Metilación (CH3) o acetilación

(CH3CO) de las bases en los
átomos (O/N) que participan en
la formación de puentes de H,
desestabiliza la doble hélice de
ADN y hace esa zona
susceptible a mutación.

…. Y estos daños solamente conducen a una mutación cuando no son

reparados.
 Los tipos de daño que desencadenan los sistemas de
reparación se pueden dividir en dos clases generales:

1. Cambios de una base: afectan la secuencia, pero no la

estructura total del ADN. Ellos no afectan la transcripción o
replicación, cuando las cadenas del ADN dúplex se separan. Así
estos cambios ejercen su daño sobre futuras generaciones a
través de las consecuencias del cambio en la secuencia del ADN.

Errores en la
replicación
Desaminación
100 al día
 2. Distorsiones estructurales: ellas causan un impedimento físico
a la replicación y transcripción. Un ejemplo muy estudiado es la
formación de dímeros de pirimidinas (timina, citosina, uracilo).
Otros ejemplos son la introducción de enlaces covalentes entre
bases de cadenas opuestas y la adición de aductos.

Entrecruzamiento
covalente de pirimidinas
adyacentes en la misma
cadena de ADN.
Generalmente son timinas
 Alquilación
(-CH3, -CH2-CH3)

Sitio
apúrico
Depurinación (AP)
(Adenina, Guanina)

5.000 al día

La característica común de todos estos cambios es que

el segmento de la agregación dañado se mantiene en el
ADN y continua causando problemas estructurales,
induce mutaciones o ambas, hasta que se retira.
 TIPOS DE SISTEMAS DE REPARACIÓN DEL
ADN EN E. coli

Reparación de
apareamiento
incorrecto

Reparación por
corte de base

Reparación por
corte de
nucleótido

Reparación directa
 MECANISMOS DE REPARACIÓN

1.- Sistemas de Reparación Directos

• Enzimas que revierten directamente el daño.
• Por estos mecanismos se reparan: metilación de
guanina, y en algunos vertebrados dímeros de
pirimidina. No intervienen nucleasas ni ADN-
polimerasas.
• Fotoreactivación: ruptura de los dímeros de
pirimidinas por acción de una fotoliasa (phr) activada
mediante luz visible.
 MECANISMOS DE REPARACION

2- Sistemas de Reparación Indirecta

Hay intervención de nucleasas y ADN-polimerasas. Se necesita hebra
“molde” perteneciente al mismo cromosoma o al homólogo.

Reparación por Escisión (NER, BER)

• Reparación de nucleótidos (NER) aislados por lesión UV: necesita la
otra hebra como templado (hasta 30 bp). Intervienen las
endonucleasas uvrA,B,C y la helicasa uvrD.
Además de foto productos, repara lesiones voluminosas (bulky) que
distorsionan la conformación del dúplex y que obstaculizarían la
transcripción y replicación.

• Reparación de bases modificadas (BER): Repara casos de

alteraciones puntuales en bases nitrogenadas (lesiones NO
voluminosas) producidas por alquilación, oxidación o desaminación. Se
origina un “sitio AP” y luego se retira el nucleótido “AP” y se re
sintetiza la hebra.
 MECANISMOS DE REPARACIÓN

2- Sistemas de Reparación Indirecta

 Reparación Post- Replicativa
• Reparación del Apareamiento Incorrecto (MMR) (“mismatch
repair”):
Su principal tarea es remover bases mal apareadas y pequeños “loops”
introducidos por inserciones / deleciones durante la replicación.
Una metilasa reconoce ADN recientemente replicado (dam) e
intervienen las proteínas “mut” (helicasas, etc.). En otros organismos
pueden ser otras señales.
Reduce los errores de replicación de 10-7 a 10-10 pb / replicación.
• Recombinación Homóloga (HR)
Reparación de ambas cadenas.
Usa ADN homólogo como templado y es altamente exacto.
Más activo durante la Fase S y G2.
• Unión de extremos no homólogos (NHEJ)
Reparación de ambas cadenas.
No usa ADN templado y generalmente se pierden algunos nucleótidos.
Más activo en la Fase G1.
 1) Reparación Directa de Daño al ADN
FOTOREACTIVACIÓN

• Sistema de reparación activado por presencia de luz.

• ADN Fotoliasa. Detecta al ADN dañado y se une a éste. La enzima
absorbe luz azul y se activa. Rompe los enlaces covalentes entre los
dímeros de timina.
• La enzima se disocia y se separa del ADN.
• También actúa una metil-transferasa.
1) Reparación Directa de Daño al ADN
FOTOREACTIVACIÓN
1) Reparación Directa
de Daño al ADN
(Dímeros de pirimidina
por fotoliasa)
Siempre hay un negocio esperando…
 2) Reparación Indirecta de Daño al ADN
2.1 Reparación por Corte o Escisión de Bases
(BER).

1) Iniciado por ADN glicosilasa específica

reconoce el daño, corta la unión glicosílica
entre base y azúcar y se forma el sitio AP
(apurínico ó apirimidínico). Remueve la base.
2) Sitio AP reconocido por AP endonucleasa
(corte 5’ de AP). La AP endonucleasa
reconoce los nucleótidos apurínicos o
apirimidínicos y los corta.
3) Enzimas Fosfodiesterasa corta en extremo
3’ del sitio AP. Se remueve el azúcar-fosfato.
4) ADN polimerasa rellena el gap o espacio.
ADNpol I (E. coli), ADN pol β (mamíferos).
5) ADN ligasa.
De acuerdo al tipo de glicosilasa que inicie el
mecanismo puede seguir distintas vías de
reparación.
2) Reparación Indirecta del Daño al
ADN
2.2 Reparación por Corte o Escisión de
Nucleótidos (NER).
Escinucleasa uvrABC realiza este tipo de
reparación en dímeros de timina, otros
fotoproductos y bases dañadas.
Escinucleasa (246 kDa) está compuesta por
tres subunidades (A, B y C).
UvrA se une al ADN en la región dañada.
UvrB/UvrC tienen actividad de endonucleasa y
corta en los lados adyacentes de la cadena
liberando un oligonucleótido.
Una ADN Helicasa (uvrD) abre la doble
hebra.
La región “vacía” es rellenada por una ADN
polimerasa I (bacterias) o polimerasa 
(mamíferos), y sellada por una ADN ligasa.

E. Coli  Sistema Uvr ABC: Remoción

de 12-13 nt.
Eucariota Remoción de 24-29 nt.
 2) Reparación Indirecta del Daño al ADN
2.2 Reparación por Corte o Escisión de Nucleótidos (NER).
 2) Reparación Indirecta del Daño al ADN
2.2 Reparación por Corte o Escisión de Nucleótidos (NER) en Eucariotas
 2) Reparación Indirecta del Daño al ADN
2.3. Reparación del Apareamiento Incorrecto (MMR)

E. coli genes mut S, L, H

Reemplaza hasta 1kb

Metilación diferencial (dam, dcm)

MutH  distingue ambas cadenas.

Corte en GATC en la cadena no metilada.

MutS  reconoce el “mismatch” o error

de apareamiento.

Mut L  La proteína MutL une las

proteínas MutH y MutS en un mismo
complejo, coordinándolas.

En eucariotas homólogos de proteínas

Mut.
2) Reparación Indirecta del
Daño al ADN
2.3 Reparación del Apareamiento
Incorrecto (MMR)

a) El reconocimiento de la secuencia
GATC son funciones especializadas
de las proteínas MutH y MutS,
respectivamente.
b) La proteína MutL une las proteínas
MutH y MutS en un mismo
complejo.
c) La proteína MutH corta la hebra
sin metilar en el lado 5´ de la G de
la secuencia GATC.
d) Participación de ADN Helicasa II,
Exonucleasa I, SSB, ADN
Polimerasa III y ADN Ligasa.
 2) Reparación Indirecta del Daño al ADN
Mecanismos de reparación cuando las dos cadenas se dañan

Unión de extremos no Recombinación

homólogos (NHEJ) Homóloga
Destrucción accidental de la doble hebra de ADN

Cromátidas
Pérdida de
hermanas
nucleótidos debido Pérdida de nucleótidos
a la degradación debido a la degradación
desde los extremos desde los extremos

Unión de extremos Procesamiento de los

extremos y
recombinación homóloga

Corte de la secuencia de
ADN Reparación exacta del daño utilizando
información de la cromátida hermana
2) Reparación Indirecta del Daño al ADN
2.4 Reparación por Recombinación Homóloga
 3) Reparación Inducida
• Ante una cantidad masiva de daños en el ADN, se disparan, como
respuesta, mecanismos de emergencia que se caracterizan por
tener niveles superiores de proteínas implicadas en reparación y
recombinación. Ejemplo: si la cantidad de lesiones que hay en E. coli
es muy superior a lo normal, se induce la respuesta SOS.

• En los casos de reparación vistos hasta ahora, los daños estaban en

una sola de las dos hebras, con lo que bastaba replicar la
complementaria, pero si tenemos mutaciones masivas, se puede
replicar la zona antes de que dé tiempo a reparar la lesión.

• Por ejemplo, ¿Cómo se reparan los dímeros de timina una vez que la
horquilla ha pasado? Ahora la zona dañada está en la banda molde.
Hay dos maneras de hacerlo:
3) Reparación Inducida

3.1. Por recombinación, suministrando el

molde correcto de un ADN homólogo.

Actividad de RuvA
3) Reparación Inducida

3.2. Respuesta SOS: consiste en la inducción de la expresión de una

serie de genes. La señal efectora de este regulón es el DNA
monocatenario (ssDNA).

Una vez reparados los daños, Rec A se inactiva y lex

A reprime los genes del operón. Es un sistema
reversible.

El represor transcripcional lex A se proteoliza

debido a la presencia de Rec A activado (se activa
uniéndose a banda simple), por lo tanto, con muchos
daños en el ADN tenemos varias zonas de banda
simple a las que se une Rec A. El represor lex A se
proteoliza por lo que se induce la expresión de todos
esos genes incluido el propio lex A.
Todos estos genes (la mayor parte de
ellos implicados en reparación), se
encuentran reprimidos por la proteína
lex A. Forman lo que se llama
un operón.
3) Reparación Inducida

3.2. Respuesta SOS: consiste en la inducción de la expresión de una

serie de genes.
3) Reparación Inducida

3.2. Respuesta SOS: consiste en la inducción de la expresión de una

serie de genes.

Los de productos de
umuC y umuD
forman las
subunidades de la
ADN polimerasa V
RESPUESTA SOS
LESIÓN DEL ADN DA LUGAR A MUTACIONES ¡¡¡¡¡

Guanina Citosina

Metilación y Replicación

O6-Metilguanina Timina
LESIÓN DEL ADN DA LUGAR
A MUTACIONES ¡¡¡¡¡