Laboratorio Biología Molecular - Práctica Proteínas

Introducción
La proteómica comprende el estudio del proteoma (totalidad de las proteínas codificadas
por un genoma) de un organismo. Requiere de técnicas para la extracción y separación de
todas o determinadas proteínas producidas por un organismo durante su ciclo de vida.
La extracción y purificación de las proteínas producidas por una célula o un tejido, es un
proceso de gran importancia ya que sirve como punto de partida para continuar con otros
procesos, como la caracterización estructural y funcional de las mismas.
Se han descrito diferentes métodos para la extracción y purificación de proteínas:
 Métodos cromatográficos
 Diferenciación por solubilidad
 Precipitación proteica con sales
 Electroforesis bajo condiciones desnaturalizantes y no desnaturalizantes

Objetivos
- Comprender los principios involucrados en el proceso de extracción de proteínas.
- Inducción de la expresión de la proteína BST-LF en un organismo modelo.
- Realizar la extracción y separación de proteínas totales de una cepa transformada de
Escherichia coli.
- Identificar el efecto de la inducción de expresión proteica en la acumulación de una
proteína de interés.
- Comprender el principio de separación de proteínas bajo el método de electroforesis
vertical.
- Visualizar exitosamente las proteínas extraídas en gel de poliacrilamida.

Para lograr los objetivos necesitamos realizar 3 procedimientos en el laboratorio:

Extracción de proteínas, electroforesis en gel de poliacrilamida y visualización mediante
tinción de azul de Coomasie. La práctica se llevará a cabo en tres sesiones de laboratorio.
El cultivo bacteriano e inducción de la proteína de interés la llevará a cabo su profesor. En
la primera semana de este módulo se hará la extracción de proteínas. En la siguiente
semana se realizará la electroforesis en geles de poliacrilamida. Finalmente, la tinción de
los geles e interpretación de resultados. Recuerden que esta información es importante para
la escritura de su informe.
Semana 3. Parte 1 - Extracción de Proteínas
En esta práctica realizaremos extracción de proteínas totales a partir de Escherichia coli;
teniendo como proteína de interés a la BST polimerasa.
En un ensayo experimental que involucre el estudio de algún componente celular o
molécula como ácidos nucleicos, polisacáridos o proteínas, es necesario conocer las
características del organismos u organismos de los cuales provienen. Posteriormente, el
primer paso metodológico corresponderá a la ruptura y fragmentación de las paredes y
membranas celulares, de tal forma que las moléculas contenidas puedan ser fácilmente
separadas y analizadas de manera sistemática y organizada.
E. coli es un bacilo Gram negativo (posee membrana celular, una delgada pared de
peptidoglicano y una membrana externa) que pertenece a la familia de las Enterobacterias.
Esta comúnmente asociada al tracto intestinal de mamíferos y se usa como microorganismo
modelo para diferentes experimentos, debido a que se puede mantener en el laboratorio con
mayor facilidad, y se conoce muy a fondo su genoma. Este tiene aproximadamente 4.6
millones de pares de bases, lo cual es un tamaño reducido si se compara con los 3 billones
de pares de bases que aproximadamente tenemos los humanos (Cooper, G.M., 2000).
Teniendo en cuenta que el interés experimental está centrado en las proteínas, dependiendo
del tipo de células, se pueden aplicar diferentes protocolos de ruptura o lisis celular bien sea
basados en procesos de disrupción física o mecánica, o en métodos de disrupción
enzimática. Para rupturas de membranas celulares simples, así como organelos
compartimentalizados como el retículo endoplasmático, se suelen usar métodos de ruptura
físicos como la sonicación (ultrasonido), la trituración y el choque térmico. Cuando las
células presentan algún tipo de pared celular gruesa rica en polisacáridos (células vegetales,
fúngicas y bacterias Gram positivas) se pueden utilizar métodos de ruptura enzimática que
hidrolizan los enlaces entre los monómeros constitutivos de la pared celular
comprometiendo su integridad y permitiendo que la membrana celular quede expuesta a
cambios de osmolaridad que la puedan romper con mayor facilidad.
Adicionalmente, para realizar una correcta extracción, es importante la elección del tipo de
buffer de extracción; esto va a depender del estudio posterior que se desea realizar. Si se
requiere la proteína en su forma nativa (funcional), utilizada para estudios de interacción y
funcionalidad, o denaturada, para estudios de determinación de tamaño. Este último es el
que realizaremos en esta práctica.
Al extraer proteínas de las células es importante un buffer de extracción que permita la lisis
celular, por lo tanto, debe contener detergentes como el SDS que ayuda a romper la
membrana lipídica y a romper enlaces no covalentes. Asimismo, aditivos como el glicerol,
que ayuda a proteger las proteínas y ayuda a la lisis celular; β-mercaptoetanol, que rompe
los puentes disulfuro y mejora la separación de las proteínas; y el azul de bromofenol como
indicador de pH. (Martínez, L., 2018) (MCE, s.f)

Procedimiento
Esta parte la realiza el profesor antes de la práctica
a) La bacteria se crece Over Night (ON) en agar LB suplementado con kanamicina (50
ug/ml) a 37°C.
b) La bacteria se crece en caldo LB (50ug/ml kanamicina) a 37°C y una agitación de
∼200 rpm hasta alcanzar absorbancia OD600: 0.6- 0.8.
c) Adición de IPTG 0.5mM al medio (18°C) para inducción de la expresión de BST-
LF. Colocar a 18°C y una agitación de ∼200 rpm / 18 horas.
Aquí empieza su práctica
1. Marcar un tubo de 1.5 ml con las condiciones indicadas por su profesor.
2. Transferir 1 ml de medio de cultivo y añadirlo al tubo (de 1.5 ml) correspondiente.
3. Centrifugar por 5 min a 13000rpm.
4. Descartar todo el sobrenadante en hipoclorito diluido.
5. Agregar 50 ul de Buffer de Muestra (debe estar en baño de maría o termo bloque).
6. Llevar las muestras a la plancha térmica a 100ºC por 5 minutos.
7. Transfiera sus muestras a hielo 2 minutos (choque térmico).
8. Centrifugar a 13000 rpm por 15 minutos.
9. Recuperar el sobrenadante (10 ul - 50 ul) en un tubo nuevo de 1.5 ml. En el
sobrenadante están las proteínas. Evite agitar el tubo.
10. Quitar la fase densa (mucosa) o utilizarla según indique su profesor.
11. Guardar las muestras a -20°C hasta la siguiente práctica.

Referencias
Cooper, G. M. (2000). The Cell: A Molecular Approach. 2nd edition. Sinauer Associates.
Recuperado de : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9917/

Martínez, L. (2018). Protein Extraction Buffer. Sepmag. Recuperado de:

https://www.sepmag.eu/blog/protein-extraction-buffer#:~:text=Protein%20extraction%20buffers
%20that%20cause,proteins%20in%20their%20native%20conformations.

MCE. (s.f). Bromophenol blue. Fluorescent Dye MedChemExpress. Recuperado de:

https://www.medchemexpress.com/bromophenol-blue.html?
utm_source=google&utm_medium=CPC&utm_campaign=Spain&utm_term=HY-
B1571&utm_content=Bromophenol%20blue&gclid=Cj0KCQjwoeemBhCfARIsADR2QCtA30ja-
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