Inmunohistoquímica | localización histologica

Cuando datos del tumor son necesarios para el cálculo, pronóstico y planificación del
tratamiento. Puede decirse que da información global del corte a observar.

INMUNOHISTOQUIMICA: Donde un anticuerpo específico obtenido en el laboratori o

es capaz de reconocer un antígeno específico que está en células. Puede observar s e
en un microscopio óptico la reacción enzimática que genera color.

Permite identificar si la célula expresa la molécula o proteína que se busca, etc.

 ANTIGENO: Cualquier molécula capaz de desencadenar una reacción inmunológica.

(Sistema inmunitario).
 ANTICUERPO: Proteínas solubles utilizadas por el sistema inmune para
identificar y neutralizar antígenos. (Inmunoglobulinas).
 ENZIMA: Proteina capaz de acelerar reacción bioquímica. Catalizador biologico.

Un ANTIGENO puede ubicarse en cualquier lugar de la célula, y poseen áreas

específicas llamadas epítopes, estas son reconocidas por anticuerpos específicos.

Un anticuerpo es una glicoproteína en forma de "Y" que pertenece a la familia de las

inmunoglobulinas
• Inmunoglobulina:
Proteínas fabricadas por el sistema inmunitario para combatir virus y bacterias.
• Glicoproteína:
Moléculas compuestas por un proteína unida a uno/+ glúcidos, simples o
compuestos.
• Glúcido:
Biomoléculas con C+H+O.

Reconocen de manera específica a un antígeno siendo que cada uno posee paratope s,
zonas de reconocimiento antigénico (específicamente a los epítopos).

PARATOPE ❤ EPITOPE = unión reversible conocida como reacción antígeno-ANTICUERPO

¿Como contribuye esto en el campo Oncológico?

Un tumor proviene de un tejido fundamental. Cada anomalía tiene un antígeno especifico

(que las diferencia entre si) y en el laboratorio pueden crearse anticuerpos específicos para
cada reconocerlos. Por ende saber de dónde poronga viene el tumor.

¿Que hace la inmunohistoquímica?

Me da el origen de una célula tumoral y ayuda a determinar el origen de una lesión
metastásica que llego a determinado lugar cuando no se conoce el tumor primario.

Logra identificar:

• Proteínas que son productos de genes alterados

• Proteínas que funcionan como receptores de membrana

Objetivo de la práctica:
Demostrar la presencia de actina de musculo liso en un corte de colon con
inmunohistoquímica indirecta con la aplicación de anticuerpos sobre cortes seriados.

Materiales importantes:
• Agua oxigenada al 3%
• Reactivo de recuperación antigénica: Buffer citrato th6
• Anticuerpo MONOCLONAL de ratón para detectar el antígeno específico.
• Anticuerpo secundario anti primario, anti-ratón: Multilink (Biogenex)
conjugado con peroxidasa.
¿Qué verga significa “anti-ratón"? porque se utiliza para detectar los anticuerpos
primarios que provienen de ratones. Diseñado para unirse a anticuerpos primarios
de ratón.
Este anticuerpo secundario tiene una alta afinidad por los anticuerpos primarios de
ratón y permite la detección y visualización del antígeno de interés en la muestra.

• Reemplazo al power block: BSA 5% en buffer PBST (Tween + Tris + NaCl) (para bloquear
reacciones no específicas)
• Estreptohabilina
Generalidades | primario o secundario:
Anticuerpo de reconocimiento se marca con biotina (se une a un marcador de biotina)

 La biotina (proteina): ofrece una fuerza de unión química considerable a la hora de

enlazarse con la estreptavidina (o avidina). En unión con la biotina, la habilina se llena
de una enzima especifica: peroxidasa o fosfatasa alcalina.

METODO PRIMARIO o directo: ANTICUERPOS MARCADO reconoce el antígeno

que quiero.

METODO SECUNDARIO o indirecto : Donde el ANTICUERPO 2 reconoce el

complejo inmune que va a formar ANTIGENO + ANTICUERPO 1

Un primer anticuerpo, o ANTICUERPO PRIMARIO, reconoce al antigeno de interés, luego se

agrega un ANTICUERPO SECUNDARIO que reconoce al primario (conjugado con una enzima)

CONJUGACIÓN: permite la detección y visualización del anticuerpo primario y, por ende, del
antígeno en la muestra. El anticuerpo secundario amplifica la señal de detección y ayuda a
mejorar la sensibilidad y especificidad.
 Mariana Mendoza | Ciencias Biologicas

CROMOGENO: sustancia que al ser oxidada por la acción de la enzima produce color.
Cuando no se fija el corte histológico NO HAY TINCIÓN.

¿Qué es lo que ocurre entre la enzima y el marcador?

Cada enzima reacciona con un colorante:

Enzima Cromógeno Coloración

Fosfatasa alcalina 3 Aminoetilcarbazol (carbazol) Rojo
Peroxidasa Diaminobencidina Café

Procedimiento | Preanalítico
Se nos entregaron dos muestras sumergidas previamente en formalina al 5%, tratadas
adecuadamente en bloques de parafina. 2 placas de vidrio de corte de colon.

FALTA DE REPRODUCIBILIDAD:
RELACION DE VOLUMEN ENTRE LO TISULAR Y LIQUIDO FIJADOR.

o La relación ideal implica 10/1 o 2/10, un parte tejido y diez de volumen.

o Si el espécimen es exageradamente grande hago una macro de 5x5 en 24 h de
formalina.

Todo esto induce a una falta de reproducibilidad dada la variedad de elecciones.

Fijación:
— SUMERGIR EN FORMOL y después sumergir en PARAFINA para mantener estructuras
— Tiempo de fijación: importante, tiene que ser lo suficiente como para tener un proceso
de fijación completa (empieza de afuera hacia adentro) pero no excesivo:

GROSOR: El corte histológico normalmente tiene 5 micrómetros o micras, trabajamos

con 2 micras y paso el bloque al microtomo para rebanadas.

Un corte muy delgado trae incomplitud del especimen y un corte muy GRUESO me da marcación
en profundidad. Esto genera variabilidad en la señal (propia de un corte que excede los 5
micrones.

La formalina tarda entre 12 a 24 hs en penetrar un tejido de 5 mm de grosor (SUPER LENTO)

o Poco tiempo: no logro que el total del espécimen quede totalmente inmortalizado.
o Exceso de tiempo: trae el problema de enmascaramiento antigénico o crosslink.

CROSSLINK DE PROTEINAS| El anticuerpo no reconoce el antígeno.

 Mariana Mendoza | Ciencias Biologicas

Ata, une y pliega sobre si mismas a las proteínas escondiendo el antígeno, Se necesitan
técnicas que permitan restaurar la estructura/forma u posición original para que lo
reconozca el anticuerpo

Procedimiento | Analítico
RECUPERACIÓN ANTIGENICA o RETRIVAL:
se hace incluso si la muestra tiene espesor y tiempo de fijación óptimo.

Busca: que los antígenos se expongan en las membranas para recuperar la antigenicidad que se
pudo haber llegado a perder con la parafina y la fijación, usamos Buffer citrato th6

1. Sumergimos en el buffer la muestra en la placa y se lleva al horno microondas

Este procedimiento presenta una gran variación en el rendimiento práctico. Algunas muestras
pueden recuperar la antigenicidad y otras no tanto lo que implica un resultado positivo o negativo
depende de cómo se haga. En estos casos puedo emplear el control:

Es posible emplear controles en base a qué clase de tejido SÉ que tengo:

estándares de referencia internos cuantificables
Por ejemplo, miocardiocitos del tejido cardíaco.

Si no tengo control, las marcas de inmunohistoquimica en el mejor de los casos solo pueden ser
semicuantitativas

• Puedo tomar anticuerpo que reconozca miocardiocitos y aplicarlo a una muestra que SE que los
tiene, si NO los reconoce entonces se sobreentiende que la muestra tuvo demasiado tiempo de
fijación o no se realizó una correcta recuperación antigénica

Recuperación antigénica/Retrival –> Parafina –> Desparafinización

DESPARAFINIZACIÓN
Los solventes utilizados para retirar la cera arrastran los lípidos presentes en las membranas de
las células superficiales. La porción lipídica del corte histológico se ve afectada. Si el marcador que
se desea visualizar está asociado a una estructura lipídica pues me

BLOQUEO DE SUSTANCIAS ENDOGENAS depende del marcador utilizado en el anticuerpo

o Previene la unión no específica de los anticuerpos a proteínas presentes en la muestra que

podrían interferir con la detección del antígeno de interés.
o Anticuerpo etiquetado con biotina + actina. La biotina está en todas las celulas.
o Se hace con agua oxigenada 3%, 13 minutos

Tomo los 30 ml de H202 comercial + 970 ul de agua destilada.

El agua oxigenada va a reaccionar con la peroxidasa endógena y la oxida.
 Mariana Mendoza | Ciencias Biologicas

Se degrada la biotina endógena, solo queda biotina presente en el tejido y unida al anticuerpo.

Un efecto que puede ocurrir es la formación de una marca café granular, la cual es considerada
una marca inespecífica. Este fenómeno ocurre cuando la sustancia endógena presente en el
tejido no se elimina adecuadamente.

POWER BLOCK | BLOQUEO UNIVERSAL BSA 5% en buffer PBST (Tween + Tris + NaCl)

Para prevenir la unión del anticuerpo con proteínas de baja afinidad, uniones inespecíficas, le
meto al tejido un coctel de proteínas genéricas solubles. Proteínas estructurales que forman parte
del tejido hacen uniones débiles y solo quedan potenciales uniones con mucha fuerza de unión.

ANTICUERPO PRIMARIO
Concentración 1/100, una gota en corte experimental (50 microlitros c/vidrio)
Tiempo 40 minutos
Anticuerpo MONOCLONAL de ratón.

Control:
con anticuerpo primario: 100 ul de PBS y 1 ul de anticuerpo. (50 c/vidrio)
sin anticuerpo primario: 50 ul de PBS y 0,5 ul de anticuerpo (50 en experimento)
.
ANTICUERPO SECUNDARIO
Concentración 1/100, una gota en corte experimental, control vario (50 microlitros c/vidrio)
Tiempo 40 minutos
Antiprimario, anticuerpo anti-ratón conjugado con peroxidasa.

Control:
con anticuerpo secundario: 100 ul de PBS y 1 ul de anticuerpo. (50 c/vidrio)
sin anticuerpo secundario: 50 ul de PBS y 0,5 ul de anticuerpo (50 en experimento)

Anticuerpo: multilink de Biogenex. Anticuerpo biotinilado (conjugado con biotina)

Tiene un cóctel de secundarios, reconoce distintos roedores. El sentido de todo esto es funcionar
con distintos tipos de IHQ independiente del anticuerpo con el que arranque, por lo que es muy
versátil. Un secundario universal.

ADJUNTO DE HABIDINA CONJUGADA PEROXIDASA

Concentración 100 ul de PBS y 2 ul del reactivo de estreptavidina x peroxidasa
Tiempo 40 minutos en vidrio experimento y vidrio control

Luego de esperar 40 minutos aplicamos diaminobencidina.

 Mariana Mendoza | Ciencias Biologicas

POSIBLES PREGUNTAS
¿Si me dan un caso hipotético donde me quede sin reactivo y tengo que utilizar un título +
diluido del recomendado qué consideraciones debo tener?
Aumentar el tiempo de incubación y aumentar la temperatura. Si aumento la temperatura
potenció el vending, la unión de anticuerpos.

¿De que se corre riesgo si aumento la temperatura?

De que se unan otras cosas. + Temperatura favorece uniones o límite haciendo este tipo de
cosas es que se me descontrola el inespecífico. Si incubo calentándolo empieza a unirse el
inespecífico.

¿Qué es el primario? Monoclonal producida en ratón.

¿Como tiene que ser el secundario? Es anti primario, tiene que ser anti-ratón.
¿Si me dicen en un protocolo que hicieron un bloqueo de peroxidasa endógena?
Ya sé que el anticuerpo secundario marcado tiene que ser de conjugado con peroxidasa.

¿Por qué me venden el antígeno conjugado con biotina?

Me sirve para personalizar la colocación dependiendo la coloración del tejido. Puedo meterle
avidina conjugada con fosfatasa o peroxidasa.

• El 99% de los monoclonales son de raton, si vemos un monoclonal ya sé que es de ratón.

• Anticuerpo mas diluido implica más que le tengo que dar:
▪ - Concentración + tiempo, + Concentración – tiempo
▪
¿Que metodología elijo para el mismo objetivo (detectar proteínas) dependiendo de sus
diferencias?
ELISA o western, sirven para medir proteinas y es un muy bien método cualitativo y cuantitativo.

¿Por qué es un buen metodo cuantitativo?

Porque emplea una reacción inmunologica. Reacción de reconocimiento inmunologico, puedo
usar un anticuerpo monoclonal con alta puntualidad frente a un determinado marcado.

¿Cuando iría con un Eliza y cuando con un western?

Si la muestra tiene medio liquido/es liquida voy con el elisa.
Si el espécimen que me dan es tisular, me voy a western.
Si me dicen oye me gustaría que me des la localización, entonces uso inmunohistoquimica.

MARCACIÓN

Entra la posibilidad de elegir de manera comercial el color que quiero emplear si uso
FLUORESCENCIA. ¿Como es la inmunohistoquimica DISCUTIDA DE FORMA CUANTITATIVA?

La elección de la marcacion debe ser FLUORESCENCIA, anticuerpos fluorescentes (acoplados a

fluorocromos) para marcar antígenos específicos en tejidos biológicos.

¿Cual es la diferencia?
Los sistemas de color tienen posibilidad de amplificar mucho la señal, pero llegan a exagerar.
 Mariana Mendoza | Ciencias Biologicas

El miedo que da este proceso es que no salga color, al ser tan directo hay posibilidad de que no
alcance la sensibilidad.

La marcacion es la variables que puede volver la inmunohistoquimica un análisis cuantitativo,

esto si se elige la fluorescencia.

¿Qué haría usted para volver una inmunohistoquímica cuantitativa?

• NO FIJAR LA MUESTRA.
• ELIMINO LA PARAFINA
Evito la desparafinización. — Este paso está asociado a una alteración en la cantidad de
receptores y perjudica la muestra antes de la marcación: SOLVENTE QUE SOLUBILIZA TODOS
LOS LIPIDOS DE MEMBRANA puede haber arrastrado al receptor de membrana antes de hacer
la marcación.

1. Saco la muestra del paciente y voy directamente a congelar, corto en criostato y le pongo un
anticuerpo primario marcado con un fluorocromo. NO HABIDINA, NO PEROXIDASA O
ENZIMA, RELACION 1 A 1.

2. Después de que marco así me lo llevó a un microscopio de fluorescencia

 Mariana Mendoza | Ciencias Biologicas

No estuvo en contacto con solventes, no estuvo con parafina, no le puse fijación, lo que hace que
la muestra sea lo más fresco posible. Además la detección fluo es mas fácil de detectar para los
softwares.

UNA VERGA: ANALISIS POR IMAGENES

Miden cantidad de marcación mediante el cálculo de la absorción, por lo que la relación no-lineal
que ocurre en niveles superiores entre cantidad de antígeno e intensidad puede resultar inexacta.

ULTIMA POSIBLE PREGUNTA

¿Por qué la técnica de inmunohistoquímica (IHQ) no es cuantitativa a pesar de tener

similitudes con el ensayo de ELISA, pero aplicado en muestras in situ?

Las diferencias en las muestras, preparación, interpretación y falta de estándares de calibración

hacen que la IHQ sea una técnica cualitativa y semi-cuantitativa en lugar de cuantitativa.

- Variabilidad de la fijación y preparación de las muestras

- Interpretación subjetiva (La IHQ implica la evaluación visual de la intensidad de la tinción)
- Ausencia de estándares de calibración

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