Manual de Practicas

FECHA DE ENTREGA | VIERNES 5 DE JUNIO DEL 2015
MANUAL DE PRCTICAS
BIOLOGA
MOLECULAR
APLICADA
UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE INGENIERAS Y CIENCIAS
QUMICAS
ELVIS MARIAN CORTAZAR

MURILLO
M.C. JUANA RAMREZ AGUILERA
NDICE
INTRODUCCIN...........................................................................................................................................II
Prctica # 1 Extraccin de ADN en muestra sangunea.................................................................................3
Prctica #2 Cuantificacin de ADN de muestra sangunea por espectrofometra con luz UV....................9
Prctica #3 Electroforesis en gel de agarosa.................................................................................................13
Prctica #4 Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) para la amplificacin de la regin polimrfica
Dral del CYP2E1..............................................................................................................................................22
Prctica #5 Polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccin (R.F.L.P) para determinacin del
genotipo de la regin Dral del CYP2E1..........................................................................................................31
Prctica #6 Electroforesis en gel de poliacrilamida......................................................................................37
Prctica #7 Determinacin del genotipo de GSTM1 y GSTT1....................................................................42
INTRODUCCIN
La biologa molecular es el dominio de la biologa que busca explicaciones a las clulas y organismos
en trminos de estructura y funcin de molculas; las molculas ms frecuentemente analizadas son las
macromolculas del tipo protenas, cidos nucleicos y glcidos, as como conjuntos moleculares del
tipo membranas o virus1.Esto hace referencia al proceso de la transcripcin del gen para rendir el ARN,
la traslacin del ARN en las protenas y el papel juego de esas protenas en la funcin celular. Desde
haca 1960, los bilogos moleculares han desarrollado mtodos para determinar, para aislar, y para
manipular componentes moleculares en clulas incluyendo la DNA, el ARN, y las protenas.
Por mencionar algunas tcnicas, encontramos las siguientes:
Reaccin en cadena de Polimerasa (PCR),
1 Slater EC. Is biochemistry irreducible to chemistry? Trends Biochem Sci, 1988; 13: 378.
Reproduccin de la Expresin,
Electroforesis del Gel,
Macromolcula que borra y que sonda,
Matrices (microarreglos).
El diagnstico molecular es un trmino general que engloba un conjunto de tcnicas de biologa

molecular empleadas para la identificacin de los defectos moleculares subyacentes en una enfermedad
de carcter hereditario. En el laboratorio de biologa molecular, en el periodo febrero-junio del 2015,
realizamos un listado de prcticas sobre tcnicas moleculares con el fin de adquirir habilidad y destreza
para montar alguna tcnica y como punto final para la discusin de resultados, a fin de que la
interpretacin obtenida sea comparada con informacin ya establecida (artculos).
Prctica # 1 Extraccin de ADN en muestra sangunea

OBJETIVO
Extraer ADN de una muestra sangunea con el fin de usarla para prximas prcticas.
Conocer una metodologa fcil para la extraccin de ADN.
GENERALIDADES
La extraccin y purificacin de cidos nucleicos constituye la primera etapa de la mayora de los
estudios de biologa molecular y de todas las tcnicas de recombinacin de ADN. En este caso, los
mtodos de extraccin permiten obtener cidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para
despus realizar anlisis especficos de modificaciones genticas mediante la reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR). La calidad y la pureza de los cidos nucleicos son dos de los elementos ms
importantes en ese tipo de anlisis. Si se desea obtener cidos nucleicos muy purificados, que no
contengan contaminantes inhibidores, es preciso aplicar mtodos de extraccin adecuados.
Dada la gran variedad de mtodos de extraccin y purificacin de cidos nucleicos existentes, la
eleccin de la tcnica ms adecuada suele efectuarse conforme a los criterios siguientes:
cido nucleico diana;

organismo fuente;
material inicial (tejido, hoja, semilla, material transformado, etc.);
resultados deseados (rendimiento, pureza, tiempo que requiere la purificacin);
uso posterior (PCR, clonacin, etiquetado, transferencia, RT-PCR, sntesis de ADNc, etc.).
Mtodos de extraccin
Para extraer los cidos nucleicos del material biolgico es preciso provocar una lisis celular, inactivar
las nucleasas celulares y separar los cidos nucleicos de los restos de clulas. El procedimiento de lisis
idneo suele consistir en un equilibrio de tcnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el
material inicial complejo (un tejido, por ejemplo), pero suficientemente suave para preservar el cido
nucleico diana. Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes:
rotura mecnica (trituracin, lisis hipotnica, etc.);
tratamiento qumico (detergentes, agentes caotrpicos, reduccin con tioles, etc.);
digestin enzimtica (proteinasa K, etc.).
Tras la lisis celular y la inactivacin de las nucleasas, los restos de clulas se eliminan fcilmente por
filtracin o precipitacin.
Mtodos de purificacin
Los mtodos empleados para purificar los cidos nucleicos de extractos celulares suelen ser
combinaciones de dos o ms tcnicas de las siguientes:
extraccin/precipitacin;
cromatografa;
centrifugacin;
separacin por afinidad.
- Extraccin/precipitacin
A menudo se efecta una extraccin con disolventes para eliminar los contaminantes de los
cidos nucleicos. Por ejemplo, suele emplearse una combinacin de fenol y cloroformo con
objeto de eliminar las protenas. Para concentrar los cidos nucleicos suele realizarse una
precipitacin con isopropanol o etanol. Si la cantidad de cido nucleico diana es escasa,
puede aadirse a la mezcla un portador inerte (como el glucgeno) para favorecer la
precipitacin. Tambin puede realizarse una precipitacin selectiva con concentraciones
salinas elevadas (precipitacin salina) o una precipitacin de las protenas mediante cambios
del pH.
MATERIAL
Material necesario para extraccin de sangre.

Tubos de centrfuga de 15 mL, de polipropileno, fondo cnico, estriles.
Pipetas graduadas de 5 y 10 mL.
Tubos Eppendoff de 1.5 mL.
Reactivos
Solucin amortiguadora de lisis I (sacarosa 0.3 M, Tris-HCl. 0.010 M, MgCl2 0.005 M 6H2O,
tritn X-100 pH 7.5).

Solucin amortiguadora de lisis II (NaCl 0.075 M, EDTA 0.024 M).
3SDS al 10%.
Perclorato de sodio 5 M.
NaCl 6 M.
Isopropanol absoluto.
Etanol al 70%.
Solucin amortiguadora TE (Tris-HCl pH 8.0 10 mM, EDTA pH 8.0 1 mM).
Equipo
Centrfuga refrigerada con velocidad hasta 14,000 rpm y cabezales mltiples.

Rotor.
Bao de agua con control de temperatura.
Pipetas automticas de 0 a 20 L, 20-200L, 200 a 1000 L.
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METODOLOGA
RESULTADOS Y DISCUSIN
Se obtuvo una muestra de ADN, sin embargo no se puede afirmar la cantidad ni la pureza de la misma,
ya que solo es un procedimiento de obtencin. Para determinar estos parmetros se requiere de la
cuantificacin de la muestra mediante espectrofotometra con luz UV.
Imagen 1. Muestra de ADN obtenida por el procedimiento descrito anteriormente de clulas sanguneas (leucocitos). til
para la cuantificacin y aplicacin de tcnicas moleculares.
PREGUNTAS
1. Qu utilidad tiene hacer una extraccin de ADN?
La extraccin y purificacin de cidos nucleicos constituye la primera etapa de la mayora de los
estudios de biologa molecular y de todas las tcnicas de recombinacin de ADN. En este caso, los
mtodos de extraccin permiten obtener cidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes
para despus realizar anlisis especficos de modificaciones genticas mediante la reaccin en
cadena de la polimerasa (PCR).
Empezando por uno de sus usos ms beneficiosos que es la ingeniera gentica en animales. Esto se
hace ajustando el cdigo gentico del animal e introduciendo caractersticas que probablemente
harn al animal ms ideal, vivir ms, producir ms cras, etc. Adems, la ingeniera gentica
tambin incluye la clonacin, que significa una copia exacta de un animal que posee rasgos que
desean copiar. Esto adems es usado para duplicar clulas HeLa, la cuales son clulas humanas
esenciales utilizadas para estudiar diversas enfermedades como el cncer y el VIH y tambin para
buscar cura para dichos padecimientos. Otro buen uso de la extraccin de ADN es la creacin de
medicamentos que pueden utilizarse en humanos. La extraccin del ADN tambin es utilizada para
el diagnstico mdico. Finalmente, la extraccin de ADN se utiliza para combinar materiales
genticos con esos encontrados en la escena de un crimen para descubrir la identidad de la vctima,
identificar al asaltante y hasta reivindicar a personas que fueron acusadas falsamente. Este tal vez es
el uso ms conocido del aislamiento o extraccin de ADN.
2. Al realizar esta prctica de cul de los componentes sanguneos se obtiene el ADN? cmo se
separan?
De las clulas nucleadas (como leucocitos); Para extraer los cidos nucleicos del material
biolgico es preciso provocar una lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los
cidos nucleicos de los restos de clulas. El procedimiento de lisis idneo suele consistir en un
equilibrio de tcnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el material inicial
complejo, pero suficientemente suave para preservar el cido nucleico diana. Entre los
procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes:
rotura mecnica (trituracin, lisis hipotnica, etc.);
tratamiento qumico (detergentes, agentes caotrpicos, reduccin con tioles, etc.);
digestin enzimtica (Proteinasa K, etc.).
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3. Cul es la funcin del NaCl durante la extraccin?

Puede realizarse una precipitacin selectiva con concentraciones salinas elevadas (precipitacin
salina).
4. Cul es la funcin del isopropanol durante la extraccin?
Para concentrar los cidos nucleicos suele realizarse una precipitacin con isopropanol o etanol.
5. Describe un mtodo para extraccin de ADN distinto al utilizado en esta prctica:
Mtodo de extraccin y purificacin con CTAB
El protocolo del mtodo del bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB) fue elaborado por
Murray y Thompson en 1980 y publicado posteriormente, en 1987, por Wagner y sus
colaboradores. El mtodo es adecuado para extraer y purificar ADN de vegetales y alimentos
derivados de vegetales y est especialmente indicado para eliminar los polisacridos y los
compuestos polifenlicos, que, de otro modo, alteraran la pureza del ADN y, por tanto, su
calidad. Este procedimiento se ha aplicado con frecuencia en gentica molecular de los
vegetales y ha sido probado en ensayos de validacin para detectar OGM. Se han elaborado
algunas variantes adicionales para adaptar el mtodo a una amplia gama de matrices de
alimentos transformados o sin transformar.
BIBLIOGRAFA
Laura Alejos Velsquez, M. d. (2015). Extraccin y purificacin del ADN. Mxico.
Sambrook J y Russell DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Nueva York. USA: 3 ed.
Ed, Cold Spring Harbor Laboratories.
Somma, M. (2015). Anlisis de la presencia de organismos genticamente modificados en muestras de
alimentos. JRC European Commission, 2-12.
Prctica #2 Cuantificacin de ADN de muestra sangunea por espectrofometra con luz UV

OBJETIVO
Mediante la espectrofotometra UV, cuantificar la concentracin de ADN obtenida de clulas
sanguneas (prctica 1).
GENERALIDADES
Una vez que se ha realizado la extraccin de ADN es necesario revisar la integridad y la cantidad del
mismo. Existen diversos mtodos para estimar la concentracin de cidos nucleicos en una
preparacin. Si la muestra es pura (no contiene cantidades significativas de contaminantes como
protenas, fenol, agarosa o incluso otros cidos nucleicos), su medicin mediante espectrofotometra de
la luz UV absorbida por las bases nitrogenadas es la ms adecuada. Por el contrario, si la cantidad de
ADN o ARN es muy pequea, o si la muestra contiene grandes cantidades de impurezas, la estimacin
de los cidos nucleicos se puede llevar a cabo por la intensidad de fluorescencia emitida por
compuestos como el bromuro de etidio.
Cuantificacin del ADN mediante espectrofotometra
El ADN, el ARN, los oligonucletidos e incluso los mononucletidos pueden cuantificarse
directamente en soluciones acuosas, en forma diluida o sin diluir, midiendo la absorbancia A (o
densidad ptica, DO) de luz ultravioleta (tambin puede hacerse en el intervalo visible). Si la muestra
es pura, es decir, no contiene cantidades significativas de contaminantes como protenas, fenol o
agarosa, la medicin espectrofotomtrica de la irradiacin ultravioleta absorbida por las bases es
sencilla y exacta. En este mtodo, los tampones acuosos con escasa concentracin inica (por ejemplo,
tampn TE) resultan idneos. Cuando la cantidad disponible de cidos nucleicos es escasa, puede
emplearse el mtodo de la placa de agarosa con bromuro de etidio.
Las protenas y los cidos nucleicos absorben la luz en el intervalo ultravioleta, a longitudes de onda
comprendidas entre los 210 y los 300 nm. Tal como se ha sealado anteriormente, la absorbancia
mxima de las soluciones de ADN y ARN corresponde a 260 nm y la de las soluciones de protenas, a
280 nm. Dado que las soluciones de ADN y ARN absorben parcialmente la luz a 280 nm y las que
contienen protenas hacen lo propio a 260 nm, el cociente de los valores obtenidos a 260 nm y a 280
nm (A260/A280) proporciona una estimacin del grado de pureza de los cidos nucleicos. Los
cocientes A260/A280 respectivos del ADN y el ARN puros son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Con un
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paso de luz de 10 mm y una longitud de onda de 260 nm, una absorbancia A = 1 corresponde
aproximadamente a 50 g/mL de ADN bicatenario, 37 g/mL de ADN monocatenario, 40 g/mL de
ARN o 30 g/mL de oligonucletidos. Si la muestra tambin contiene protenas, el cociente
A260/A280 ser considerablemente inferior a dichos valores y no podr determinarse con exactitud la
cantidad de cidos nucleicos. Debe precisarse que la espectrofotometra no permite identificar de forma
fiable impurezas de ARN presentes en las soluciones de ADN. Puede emplearse la absorbancia a 325
nm para poner de manifiesto la presencia de restos en la solucin o la suciedad de la cubeta.
Nota: Las ratios de absorbancia 260/280 nm permitieron estimar su pureza como: ptima (ratio 1,72,0), buena (ratio > 2,0), o presencia de protenas u otros contaminantes (ratio < 1,7). El ADN se
almacen a 20 C hasta su uso (Leiro-Fernndez et al., 2014).
MATERIAL
Tubos Eppendorf de 1.5 mL.
Celdas de cuarzo o de polipropileno para lectura en UV.
Reactivos
Muestra de ADN obtenida de la prctica 1.
Equipo
Microcentrfuga con velocidad hasta 14,000 rpm
Pipetas automticas de 2 a 20 L y de 200 a 1000 L.
Espectrofotmetro UV-Vis.
METODOLOGA
Despus de cuantificar la muestra se obtuvieron los siguientes resultados:
Absorbancias
260 nm
0.176
280 nm
0.084
[ ] 880 g/mL
[ ] 1.649 g/mL**
Ratio de 2.08**
Tabla 1. **Datos obtenidos por el espectrofotmetro Jenway.
Determinacin de concentracin de ADN manualmente
50 g / mL x 0.176 x 100=880 g/mL
50 g/mL: ADN bicatenario (eso es lo que corresponde teniendo una absorbancia de 1).
0.176: absorbancia a 260 nm.
100: factor de dilucin.
De acuerdo con los datos encontrados, los cocientes A260/A280 respectivos del ADN y el ARN puros
son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Quiz la frmula est mal aplicada, sin embargo se busc en la
literatura algunas frmulas ms y no concuerdan para obtener un resultado fiable.
El equipo Jenway arroj un resultado de 1.649 g/mL por lo que no concuerda el resultado obtenido
manualmente; sin embargo, el resultado obtenido con el equipo indica que esta aproximadamente
dentro de la clasificacin de ADN puro (1.8-2), y en cuanto al ratio estima una pureza buena
(ratio > 2,0). Concluyendo que la tcnica y los pasos hechos nos proporcion resultados dentro de los
rangos establecidos, descartando posible contaminacin, impurezas con protenas o dao en el ADN
que pudiese interferir en su lectura. No se descarta la posibilidad de que al realizar los clculos
manualmente, no se est siguiendo algn orden o alguna conversin de datos.
PREGUNTAS
1. Qu utilidad tiene realizar la cuantificacin del ADN obtenido?
Una vez obtenido el material gentico, es necesario revisar la integridad y la cantidad del
mismo mediante espectrofotometra.
2. Para el clculo de la concentracin de ADN por qu se utiliza el factor de 50?
Una densidad ptica (D.O) 260 de 1.0, corresponde aproximadamente a 50 g.mL-1 de ADN
doble cadena. Este valor se utiliza como factor para determinar los clculos del ADN.
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3. Por qu se efectan lecturas a 260 y 280 nm?

Las protenas y los cidos nucleicos absorben la luz en el intervalo ultravioleta, a longitudes de
onda comprendidas entre los 210 y los 300 nm. Tal como se ha sealado anteriormente, la
absorbancia mxima de las soluciones de ADN y ARN corresponde a 260 nm y la de las
soluciones de protenas, a 280 nm. Dado que las soluciones de ADN y ARN absorben
parcialmente la luz a 280 nm y las que contienen protenas hacen lo propio a 260 nm, el
cociente de los valores obtenidos a 260 nm y a 280 nm (A260/A280) proporciona una
estimacin del grado de pureza de los cidos nucleicos.
4. Cmo se obtiene el radio y qu significado tiene su valor?
Las ratios de absorbancia 260/280 nm permiten estimar la pureza del ADN como: ptima (ratio
1,7-2,0), buena (ratio > 2,0), o presencia de protenas u otros contaminantes (ratio < 1,7).
BIBLIOGRAFA
Laura Alejos Velsquez, M. d. (2015). Extraccin y purificacin del ADN. Mxico.
Leiro-Fernndez V, De Chiara L, Botana-Rial M, Gonzlez-Pieiro A, Tardio-Baiges A, NezDelgado M, Valverde Prez D, Fernndez-Villa A. Viabilidad de las muestras ganglionares
obtenidas por ecobroncoscopia para el estudio de alteraciones epigenticas en pacientes con
cncer de pulmn. Arch Bronconeumol. 2014: 50;(6).
Sambrook J y Russell DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Nueva York. USA: 3 ed.
Ed, Cold Spring Harbor Laboratories.
Somma, M. (2015). Anlisis de la presencia de organismos genticamente modificados en muestras de
alimentos. JRC European Commission, 2-12.
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Prctica #3 Electroforesis en gel de agarosa

OBJETIVO
Conocer y evaluar las ventajas de la tcnica de electroforesis en geles horizontales de agarosa
para el anlisis y caracterizacin de cidos nucleicos.
Separar cidos nucleicos segn su tamao y peso molecular.
Determinar la integridad de la extraccin realizada en la prctica 1.
GENERALIDADES
La electroforesis en geles de agarosa es una de las tcnicas analticas utilizadas en la caracterizacin de
cidos nucleicos en base a la forma y tamao de las molculas. La carga neta negativa, producto de los
grupos fosfatos en el ADN y el ARN, resulta en una migracin de las molculas hacia el nodo cuando
se aplica un campo elctrico; sin embargo la matriz, formada por la agarosa (un polisacrido ramificado
de unidades de D-galactosa y 3,6-anhidro-galactosa altamente hidrofbico) en la sales del tampn,
ofrece una resistencia al movimiento (Figura 1). Las molculas lineales de mayor tamao tendrn
dificultad para pasar por los poros de la matriz, quedndose en la regin superior del gel, mientras que
los fragmentos de menor tamao se movilizarn con facilidad, alcanzando la parte inferior del gel.
Figura 1. Esquema representativo de una corrida electrofortica
Dependiendo de la concentracin de agarosa en el gel, la matriz formada permitir la separacin

efectiva de diferentes tamaos de ADN durante la electroforesis (Tabla 1), en consecuencia, la masa
molecular relativa puede ser calculada utilizando un marcador de ADN de peso molecular conocido,
como referencia. Sin embargo existen otros factores que influyen en el grado de resolucin de los geles
de agarosa. La conformacin de las molculas afecta la migracin. El ADN plsmidos migra en orden
de velocidad desde el ms rpido al ms lento, de acuerdo a si est en forma superenrollada, lineal o
circular abierta.
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Tabla 1. Rango de separacin de molculas lineales de ADN doble cadena por electroforesis en geles horizontales de
acuerdo al porcentaje de agarosa.
El voltaje es otro factor que influye en la velocidad de migracin del ADN, a mayor voltaje una
migracin ms rpida; sin embargo el calor generado produce que el gel se derrita adems de
desmejorar la resolucin de la separacin de las molculas.
Generalmente los geles de agarosa en corrida horizontal son utilizados para separar fragmentos entre
100 pb hasta 20 kb. Para la separacin de molculas de menor tamao se utilizan geles de
poliacrilamida y para molculas mayores a 0,1 Mb hasta 2 Mb se han diseado los sistemas de
electroforesis de campo pulsado (Pulse Field Gel Electrophoresis o PFE) y electroforesis de campos
invertidos (Field Inverted Gel Electrophoresis, FIGE), ambos realizados en geles de agarosa de alta
concentracin (agarosa 1,5% a 2 %).
Previa a la colocacin de la muestra en los bolsillos del gel, se mezcla con el tampn de carga,
compuesto por un reactivo que incremente la densidad, como el glicerol o la sacarosa, y uno o dos
colorantes que permitan hacer el seguimiento de la corrida en tiempo real. Generalmente se utiliza el
azul de bromofenol y el cileno cianol, los cuales estn cargados negativamente y migran a un peso
molecular equivalente a 5 kb y 300 pb de ADN doble cadena respectivamente.
El mtodo ms conveniente y comnmente usado para la visualizacin del ADN separado en estos
geles de agarosa es la tincin con el colorante fluorescente bromuro de etidio (BrEt), el cual contiene
grupos planares tricclicos que se intercalan entre las bases del ADN, sin especificidad de secuencia.
Bajo estas condiciones, el colorante aumenta su fluorescencia, de modo que emite luz visible (color
naranja) cuando es excitado por radiacin ultravioleta.
Para el registro del resultado de la electroforesis que se visualiza mediante la exposicin a la luz UV
del gel teido con BrE, desde hace algunos aos se utiliza un aparato de fotodocumentacin que
digitaliza la imagen, el cual hace uso de programas especialmente diseados para este fin.
MATERIAL
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Matraz Erlenmeyer de 250 mL.

Tubos de centrfuga de 50 mL, de polipropileno, fondo cnico.
Papel de aluminio.
Esptula de plstico.
Bandejas de plstico para teido.
Reactivo
Agarosa.
2. TAE 1X.
Azul de bromofenol.
Bromuro de etidio 10g/L
Equipo
Balanza analtica.
Horno de microondas.
Cmara de electroforesis horizontal con fuente de poder.
Pipetas automticas de 2 a 20 L, 200 a 1000 L.
Transiluminador.
Fotodocumentador.
METODOLOGA
Figura 1. Gel de agarosa al 1.5, teida con

bromuro de etidio.
Se puede observar el resultado de la corrida de
electroforesis con muestra de la previa extraccin y
cuantificacin del ADN. Una mala extraccin o la
aplicacin
incorrecta
de
las
tcnicas
para
extraccin de ADN, puede interferir en su pureza y

por lo tanto en la separacin de la misma en
tcnicas de electroforesis.
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Para esta electroforesis, colocamos varios pocillos
en un mismo gel, pues lo que se deseaba observar

era si corra la muestra.
Se utiliza el gel de agarosa para hacer correr muestras de tamao ms grande entre (20 kb- 300 pb)
donde entra el ADN bicatenario. Para fragmentos pequeos de ADN, se utiliza el gel de poliacrilamida
siendo su poder de resolucin ms grande pero su forma de preparacin y manipulacin es difcil.
PREGUNTAS
1. Qu es la electroforesis?
La electroforesis es una tcnica de laboratorio comn utilizado para identificar, cuantificar, y
purificar fragmentos de cido nucleico.
2. En que se basa la electroforesis del ADN?
Las muestras se cargan en pocillos de un gel de agarosa o acrilamida y se someten a un campo
elctrico, causando que los cidos nucleicos cargados negativamente se muevan hacia el
electrodo positivo. Fragmentos de ADN ms cortos se desplazarn ms rpidamente, mientras
que los fragmentos ms largos permanecern ms cercano al origen del gel, lo que resulta en la
separacin basada en el tamao.
3. Por qu la matriz del gel de agarosa ofrece resistencia al paso de las molculas de ADN?
Si se fuerza a los cidos nucleicos a moverse a travs de un gel formado por una malla
tridimensional de un polmero como la agarosa, la friccin har que las molculas de mayor
tamao migren con ms lentitud, mientras las de menor tamao avanzan ms en el gel,
permitiendo que las diferentes molculas se separen en funcin del tamao. Del mismo modo,
molculas de ADN o ARN con topologas o estructuras tridimensionales diferentes tambin se
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comportaran de forma diferente ate la friccin con la malla del polmero, permitiendo su
separacin.
4. Cmo deben prepararse los geles de agarosa para separar con buena resolucin fragmentos de
ADN de distintos tamaos?
Pesar la masa apropiada de agarosa en un matraz erlenmeyer. Los geles de agarosa se
preparan usando p/v solucin porcentaje. La concentracin de agarosa en un gel depender
de los tamaos de los fragmentos de ADN que se separaron, con la mayora de los geles que
oscilan entre 0,5% -2%. El volumen del tampn no debe ser mayor que 1/3 de la capacidad
del matraz.
Aadir tampn de agarosa al matraz que contiene. Agite para mezclar. Los amortiguadores
ms comunes a usar en estos geles son TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA) y de TBE
(45 mM Tris-borato, 1 mM EDTA).
Fundir la mezcla de agarosa / tampn. Esto se realiza comnmente mediante el
calentamiento en un horno de microondas, pero tambin se puede hacer sobre una llama de
Bunsen. En intervalos de 30 s, retirar el matraz y agitar el contenido para mezclar bien.
Repita hasta que la agarosa se haya disuelto completamente.
Aadir bromuro de etidio (EtBr) a una concentracin de 0.5 g/mL. Alternativamente, el gel
puede tambin ser teido despus de electroforesis en el funcionamiento de un tampn que
contiene 0.5 mg/mL de bromuro de etidio durante 15-30 minutos, seguido de decoloracin en
la gestin de bfer por un perodo igual de tiempo.
Nota: EtBr es un carcingeno y debe desecharse de forma adecuada segn las regulaciones de la
institucin. Los guantes deben ser usados siempre al manipular geles que contienen bromuro
de etidio. Tintes alternativos para la tincin de ADN se encuentran disponibles, sin embargo
EtBr sigue siendo el ms popular debido a su sensibilidad y costo.
Dejar que la agarosa se enfre bien en la mesa de trabajo o por incubacin en un bao de 65
C el agua.
Coloque la bandeja de gel en el aparato de fundicin. Alternativamente, tambin se puede
pegar los bordes abiertos de una bandeja de gel para crear un molde. Colocar un peine
adecuado en el molde de gel para crear los pocillos.
Verter la agarosa fundida en el molde de gel. Retirar el peine y colocar el gel en el cuadro de
gel (figura 1).
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Figura 1. Un solidificado en gel de agarosa despus de la eliminacin del peine.
Tabla 1. Rango de separacin de tamaos de ADN en funcin de la concentracin y el tipo de agarosa utilizados.
Tomado de Electroforesis de ADN, Fierro F, 2015.
5. De qu factores depende la velocidad de migracin del ADN?

Sometidos a un campo elctrico, la carga negativa del ADN y el ARN har que estos se muevan en
direccin al nodo. Si se fuerza a los cidos nucleicos a moverse a travs de un gel formado por
una malla tridimensional de un polmero como la agarosa, la friccin har que las molculas de
mayor tamao migren con ms lentitud, mientras las de menor tamao avanzan ms en el gel,
permitiendo que las diferentes molculas se separen en funcin de su tamao. La resolucin y
velocidad de separacin de fragmentos de ADN por electroforesis son reguladas a travs de la
concentracin de agarosa (o acrilamida) en el gel y el voltaje aplicado durante la electroforesis.
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6. Cules son las funciones de los tampones de electroforesis como el TAE 1X? Qu otros
tampones de electroforesis son frecuentemente usados en laboratorio?
Como buffer de electroforesis y para la preparacin del gel puede utilizarse opcionalmente TAE
(Tris-Acetato EDTA) o TBE (Tris-Borato EDTA). El TAE tiene una menor capacidad de
amortiguacin que el TBE, y puede resultar en una acidificacin del medio si la electroforesis se
desarrolla durante un periodo muy prolongado, pero funciona muy bien con tiempos normales de
electroforesis, adems tiene una mayor capacidad de resolucin que el TBE para tamaos grandes
de ADN. Ambos suelen prepararse como soluciones concentradas, que pueden almacenarse a
temperatura ambiente (previa esterilizacin en autoclave), stas se diluyen con agua antes de cada
electroforesis para lograr la concentracin de uso: 1x para el TAE y 0.5x para el TBE.
Buffer TAE (50x) 1 L
Tris base, 242 g; cido actico glacial, 57.1 ml; 0.5 M EDTA pH 8, 100 ml. Ajustar hasta 1 litro con
agua destilada o desionizada.
Buffer TBE (5x) 1 L
Tris base, 54 g; cido brico, 27.5 g; 0.5 M EDTA pH 8, 20 ml. Ajustar hasta 1 litro con agua
destilada o desionizada.
El EDTA debe estar preparado previamente: Se aade al agua destilada o desionizada (un volumen
20% inferior al volumen final deseado) la cantidad adecuada de EDTA para obtener una
concentracin final de 0.5 M. Se ajusta el pH con NaOH hasta que el EDTA se disuelva y llegue
la solucin a un pH de 8. Se ajusta el volumen, se esteriliza y se conserva a temperatura
ambiente.
Buffer de carga
El buffer de carga debe tener una alta densidad que permita que la muestra se introduzca en el
pocillo del gel, adems de colorantes que nos indiquen cuando debe detenerse la electroforesis.
Existen varios tipos de buffers de carga, a continuacin se detallan los dos ms utilizados (la
inclusin de xileno cianol es opcional)
Buffer de carga tipo I (6x): 0.25% azul de bromofenol; 0.25% xileno cianol; 40%
sacarosa, en agua. Almacenar a 4C.

Buffer de carga tipo II (6x): 0.25% azul de bromofenol; 0.25% xileno cianol; 30%
glicerol, en agua. Almacenar a 4C.
7. Con qu propsito se mezcla la solucin de ADN con el tampn de carga? Cules son las
funciones de cada uno de los componentes, el glicerol, el azul de bromofenol?
18
Las muestras de ADN que deben cargarse en el gel de agarosa se mezclan en primer lugar con un
tampn de carga que por lo general contiene agua, sacarosa y un colorante (por ejemplo: cianol
de xileno, azul de bromofenol, verde de bromocresol, etc.)
El tampn de carga se emplea con tres fines:
Aumentar la densidad de las muestras para que las gotas de ADN caigan uniformemente
en el pocillo,
Aadir color a la muestra, simplificando de este modo el rpoceso de carga,
Incorporar un colorante a la muestra que, en un campo elctrico, se desplace hacia el

nodo a una velocidad previsible.
8. Qu es el bromuro de etidio y cul es su funcin en esta prctica?
El bromuro de etidio (BrEt) es un agente intercalante (se intercala entre las bases nitrogenadas) que
se usa como colorante fluorescente para la visualizacin de cidos nucleicos en geles de agarosa
y poliacrilamida. El BrEt absorbe luz ultravioleta de = 300 nm, y emite una luz naranja a590
nm, mediante la cual podemos observar la posicin y cantidad relativa del ADN en el gel tras la
electroforesis.
9. Qu riesgos existen al utilizar el bromuro de etidio y que tratamiento debe darse a las soluciones
que lo contienen?
El bromuro de etidio es un fuerte agente mutagnico y posiblemente cancergeno y teratgeno. Debe
ser manipulado con extrema precaucin en el laboratorio. El uso de guantes, lentes de proteccin
y bata de laboratorio es obligatorio.
Tratamiento de la solucin de trabajo conteniendo bromuro de etidio
Armar el sistema de descontaminacin de bromuro de etidio, que consiste en un embudo de plstico
de aproximadamente 30 cm de dimetro cuyo interior contiene dos capas de papel filtro simple
seguido de una doble capa de gasa.
Conectar el embudo a un recipiente de plstico para almacenar la solucin filtrada.
Sobre este revestimiento colocar el carbn activado (se recomienda 100 mg de carbn activado por
cada 100 ml de solucin).
Agregar la solucin de trabajo conteniendo el bromuro de etidio en el sistema de descontaminacin.
Nota: Utilizar el mismo carbn activado hasta verificar que pierda la capacidad de inactivar al
bromuro de etidio.
PREPARACIN DE LA SOLUCION DE DESCONTAMINACION
Reactivos: Nitrito de sodio (NaNO2), cido hipofosforoso (H3PO2)
Procedimiento: Disolver en un frasco de vidrio 4,2 g de NaNO 2 en 20 mL de H3PO2 al 50% y
enrazarlo con 300 ml de agua destilada. Verificar el pH el cual debe ser de 1,8. El volumen a
preparar depende del tamao de la superficie a descontaminar.
19
10. Cmo se valora la integridad y la concentracin del ADN con esta tcnica?
Los cidos nucledos separados en geles de agarosa pueden visualizarse mediante tincin con
colorantes fluorescentes, lo cual permite evaluar su integridad y estimar su concentracin
mediante un anlisis comparativo con patrones de concentracin conocida. Los colorantes
fluorescentes actan mediante insercin entre las pares de bases que conforman el cido nucleico.
La tcnica para la cuantificacin de ADN consiste simplemente en la utilizacin de una secuencia de
concentraciones de solucin patrn de ADN con la que se comparan muestras de ADN de
concentracin desconocida. El clculo de las concentraciones se hace bajo la luz ultravioleta
segn la fluorescencia. Debe evitarse la exposicin prolongada a la luz ultravioleta, incluso con
mscara de proteccin. La estimacin de las concentraciones de ADN puede realizarse sobre una
fotografa digital del gel tomada bajo luz ultravioleta si se cuenta con un analizador de imgenes.
BIBLIOGRAFA
Duina-Posso D, Herrera TG. (2008). Uso de marcadores microsatlites para la estimacin de diversidad
gentica en plantas. Ediciones IVIC.
Fierro F. (2015). Electroforesis de AND. Departamento de Biotecnologa, Universidad Autnoma
Metropolitana-Unidad Iztapalapa. Mxico, D.F.
Lee P, Costumbrado Y, Hsu J, Kim CY, Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA
Fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923, doi:10.3791/3923 (2012).
Westermeiner, R. (1997). Electrophoresis in practice: a guide to methods and Applications of DNA and
protein separation. VCH, Weinheim.
CNSP. (Centro Nacional de Salud Pblica). 2006. Manejo, tratamiento y eliminacin de bromuro de
etidio. Edicin 1, pp 2.
20
Prctica #4 Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) para la amplificacin de la regin

polimrfica Dral del CYP2E1
OBJETIVO
Amplificar la regin especfica del ADN para el sitio Dral l del gen CYP2E1, localizado en el
intrn 6.
Conocer y aprender a realizar la tcnica de PCR.
GENERALIDADES
PCR son las siglas en ingls de Polymerase Chain Reaction o Reaccin en Cadena de la Polimerasa. La
idea bsica de la tcnica es sintetizar muchas veces un pedazo o fragmento de ADN utilizando una
polimerasa que puede trabajar a temperaturas muy elevadas, ya que proviene de la bacteria Thermus
aquaticus que vive a altas temperaturas (79C a 85C), de ah su nombre comercial ms conocido: taq
polimerasa. Cuando hacemos una reaccin de PCR simulamos lo que sucede en una clula cuando se
sintetiza el ADN y en el tubo se mezclan todos los ingredientes necesarios para hacerlo: la polimerasa,
el ADN del organismo que queremos estudiar donde se encuentra el fragmento que queremos
sintetizar-, los oligonucletidos (llamados tambin primers, iniciadores, cebadores, oligos, etc.)
necesarios para que se inicie la transcripcin, dinucletidos (dNTPs), y las condiciones para que la
enzima trabaje adecuadamente (cierto pH, determinadas cantidades de magnesio en forma de MgCl 2,
KCl, y pueden necesitarse otras sales o reactivos, dependiendo de cada polimerasa). Esta tcnica tan
ingeniosa tiene muchsimas aplicaciones distintas y se ha convertido en una herramienta muy
importante en la biologa molecular; sus aplicaciones van desde la gentica de poblaciones, evolucin
molecular y genmica hasta la medicina forense.
La PCR se basa en el mecanismo de la replicacin in vivo del ADN: el ADN bicatenario se desenrolla y
pasa a ADN monocatenario, se duplica y se vuelve a enrollar. Esta tcnica consiste en ciclos repetitivos
de:
desnaturalizacin del ADN por fusin a temperatura elevada, a fin de convertir el ADN
bicatenario en ADN monocatenario;
unin (anillamiento) de dos oligonucletidos, utilizados como cebadores, al ADN diana;
extensin de la cadena de ADN por adicin de nucletidos a partir de los cebadores utilizando
ADN polimerasa como catalizador, en presencia de iones Mg2+.
Los oligonucletidos consisten normalmente en secuencias relativamente cortas, que son diferentes
entre s y complementarias de los sitios de reconocimiento que flanquean el segmento de ADN diana
21
que debe amplificarse. Las fases de desnaturalizacin del ADN molde, anillamiento del cebador y
extensin del cebador constituyen un ciclo del mtodo de amplificacin por PCR. La figura 1 ilustra
las tres fases principales del proceso de amplificacin por PCR.
Figura 1. Fases de la amplificacin por PCR. Tomado de Anlisis de la presencia de organismos genticamente
modificados en muestras de alimentos. Somma y Querci. 2015.
Tras cada ciclo, las hebras de ADN recin sintetizadas pueden servir de ADN molde para el ciclo
siguiente. Como se indica en la figura 2, el producto principal de esta reaccin exponencial es un
segmento de ADN bicatenario cuyos extremos vienen definidos por los extremos 5 de los
oligonucletidos cebadores y cuya longitud viene dada por la distancia entre los cebadores. Los
productos de una primera ronda de amplificacin efectiva son molculas de ADN de diferentes
tamaos, cuyas longitudes pueden superar la distancia entre los sitios de unin de los dos cebadores. En
la segunda ronda, estas molculas generan hebras de ADN de longitud definida que se acumulan de
forma exponencial en rondas posteriores de amplificacin y constituyen los productos dominantes de la
reaccin. As, la amplificacin, que es el nmero final de ejemplares de la secuencia diana, se expresa
con la siguiente ecuacin:
(2n -2n)x
donde n es el nmero de ciclos, 2n es el nmero de molculas del primer producto obtenidas tras el
primer ciclo y de los segundos productos obtenidos tras el segundo ciclo con longitud indefinida, x es
el nmero de ejemplares del ADN molde original. Tericamente, al cabo de 20 ciclos de PCR habr una
amplificacin de 220 veces, suponiendo que cada ciclo tiene un rendimiento del 100 %. El rendimiento
de una PCR vara de un ADN molde a otra y depende del grado de optimizacin que se haya
22
conseguido. En los prrafos siguientes se encuentra una descripcin pormenorizada de las tres fases de
la amplificacin por PCR (desnaturalizacin del ADN molde, anillamiento del cebador y extensin).
Figura 2. La amplificacin exponencial del ADN mediante PCR.
CYP2E1
Dentro de la superfamilia del CYP450, el CYP2E1 es una enzima toxicolgicamente importante, de
gran inters para la medicina industrial y medio ambiental ya que tiene la habilidad de convertir
numerosos sustratos del medio ambiente a citotoxinas y est relacionado con la activacin de una
amplia variedad de xenobiticos; ms de 70 compuestos orgnicos tales como alcoholes, aldehdos,
teres, cidos grasos, cetonas, hidrocarburos alifticos y aromticos, dialquilnitrosaminas,
etilcarbamatos, solventes halogenados o frmacos, son metabolizados por el CYP2E1 (Hong y Yang,
1997; Lucas et al., 2001; Bolt y Roos, 2003).
Cuantitativamente, es una de las ms abundantes isoformas del citocromo P-450, comprende
aproximadamente el 7% de todas las isoformas de esta enzima expresadas en el hgado. Aunado a ello,
se ha visto que la naturaleza polimrfica de su gen es significativa para las diferencias interindividuales
en la toxicidad a sus sustratos; por ello, la asociacin del polimorfismo gentico del CYP2E1 y la
susceptibilidad a los daos producidos por exposicin a txicos han recibido atencin creciente (Hong
y Yang, 1997; Bolt y Roos, 2003, Gonzles-Jasso, 2003).
El CYP2E1, tiene un papel importante en la biotransformacin de diversos xenobiticos por el amplio
espectro de compuestos qumicos que metaboliza, por lo que las posibles consecuencias de las
diferencias interindividuales e intertnicas de susceptibilidad pueden estar relacionadas con la
expresin individual de sntomas clnicos de intoxicacin (Bolt y Roos, 2003).
23
MATERIAL
Tubos Eppendoff de 0.65 ml estriles
Puntas para micropipeta estriles
Bao de hielo
Papel Parafilm
Pipetas automticas de 0.1 a 2.5 l, 2 a 20 l, 20-200 l, 200 a 1000 l
Papel de aluminio
Esptula de plstico
Reactivo
Equipo de reactivos para PCR
Primers
para el sitio polimrfico DraI: 5-AGT-CGA-CAT-GTG-ATG-GAT-CCA-3
5-GAC-AGG-GTT-TCA-TCA- TGT-TGG-3
Agua inyectable estril
Agarosa
TAE 1X
Azul de bromofenol
Bromuro de etidio 10g/l
Marcador de 100 pares de bases
Equipo
Termociclador
Transiluminador
Fotodocumentador
Microcentrfuga
Vortex
Balanza analtica
Horno de microondas
Cmara de electroforesis horizontal con fuente de poder
24
METODOLOGA
En bao de hielo, preparar una mezcla de reactivos (pool) de acuerdo al nmero de muestras a trabajar,
considerando que para cada muestra se requieren las siguientes cantidades de reactivos:
Componente
Volumen
Solucin de MgCl2 25 mM
Solucin buffer 10 X libre de MgCl2
Mezcla de nucletidos para PCR (10 mM cada uno)
1.2 L
4 L
0.4 L
Oligonucletidos del CYP2E1 para DraI (sentido)

Oligonucletidos del CYP2E1 para DraI (antisentido)
0.8 L
0.8 L
Taq polimerasa
ADN molde
Agua libre de nucleasas para un volumen final de
0.1 L
2 L
10.7 L
Concentraci
n final
1.5 mM
1.0X
200 M cada
uno
0.8 M
0.8 M
1.25 u
0.5 a 1 g
En un microtubo de 0.65 ml colocar el pool de reactivos y el ADN molde, mezclando bien con la
misma pipeta. Colocarlo en el termociclador bajo el siguiente programa:
1. 3 minutos a 94 C
Desnaturalizacin del ADN
2. 1 minuto a 94 C
Desnaturalizacin final
3. 1 minuto a 60 C
Alineacin
4. 1 minuto a 72 C
Elongacin de la cadena
5. Repetir 35 ciclos a partir del punto 2

6. 7 minutos a 72C
Elongacin final
7. 4C
Una vez terminada la reaccin proceder a verificar la obtencin de los fragmentos requeridos de
373 pb mediante electroforesis en gel de agarosa al 1.5 %, tal como se realiz en la prctica No. 3,
colocando en el primer pozo el marcador de pares de bases.
Se tuvo muchas complicaciones para realizar esta prctica; analizndola podemos mencionar algunos
factores que intervinieron:
Los volmenes asignados para realizar la solucin estaban mal calculados,
Se confundi al colocar el componente (colocando otro),
El mal manejo de las pipetas y los volmenes colocados,
25
La caducidad de los componentes.

Figura 1. Gel de agarosa al 1.5% teida con bromuro de
etidio.
En esta prctica solo se corri el producto de la PCR
obtenida, se puede observar que en todos los pocillos
corri bien el material depositado. En el primer pocillo
est el marcador de pares de bases y se observa que las
dems muestras corrieron a la misma altura, concluyendo
que la correcta manipulacin de la tcnica de PCR nos
brind buenos resultados en la multiplicacin de cadenas
de ADN. Esto se nota en la electroforesis al ser
comparado con el tamao del marcador.
No se realiz en esta prctica la amplificacin de la regin especfica del ADN para el sitio Dral l del
gen CYP2E1, pues esta prctica tena ms fin demostrativo para aprender a realizar la tcnica de PCR.
PREGUNTAS
1. En que se basa la reaccin de PCR?
La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es una tcnica de laboratorio utilizada para
amplificar secuencias de ADN. El mtodo utiliza secuencias cortas de ADN llamados cebadores
para seleccionar la parte del genoma a amplificar. La temperatura de la muestra se sube y se
baja repetidamente para ayudar a la enzima de replicacin del ADN a duplicar la secuencia del
ADN que est siendo copiada. Con esta tcnica se pueden producir un billn de copias de la
secuencia en estudio en slo unas pocas horas.
2. Qu son los oligonucletidos?
Los oligonucletidos consisten normalmente en secuencias relativamente cortas, que son
diferentes entre s y complementarias de los sitios de reconocimiento que flanquean el segmento
de ADN diana que debe amplificarse. Los oligonucletidos compuestos por 2'desoxirribonucletidos son fragmentos de ADN y se utilizan a menudo en la reaccin en cadena
de la polimerasa, un procedimiento que puede amplificar en gran medida casi cualquier pequea
cantidad de ADN. All, el oligonucletido se conoce como un cebador, lo que permite la ADN
polimerasa para extender el oligonucletido y replicar la hebra complementaria.
26
3. Para qu se agrega cloruro de magnesio?

Los iones Mg2+: Los iones de magnesio estimulan a la enzima TaqPol para que incorpore los
dNTPs; forman un complejo soluble con los dNTP, lo cual es fundamental para la
incorporacin de estos; estimulan la actividad polimersica; aumentan la Tf de la interaccin
cebador/ADN molde (con lo que estabilizan la interaccin entre las dos cadenas).
4. Durante la PCR Qu sucede en la fase de desnaturalizacin?
Desnaturalizacin inicial. Habitualmente la PCR utiliza un ciclo de desnaturalizacin
(separacin de la doble hlice porque los puentes de hidrgeno se rompen), la temperatura y el
tiempo se determinan de acuerdo a las caractersticas del ADN y de la ADN polimerasa
utilizada, por lo general es entre 94 y 96 C durante 5-10 minutos. 2.2 Ciclos de la PCR. Se
realizan ciclos sucesivos de desnaturalizacin, alineamiento y extensin, generalmente estas
etapas se repiten entre 25 y 35 veces. 2.2.1 Desnaturalizacin. En esta etapa es muy importante
que el ADN molde se desnaturalice completamente. Para lograrlo de manera adecuada se
recomiendan temperaturas de 94 C durante 30 segundos a 1 minuto. Si el ADN tiene un alto
contenido de guaninas y citosinas, se recomienda aumentar el tiempo o la temperatura. La
actividad de la enzima decrece muy rpido a partir de los 95 C, por lo que a estas temperaturas
o superiores es aconsejable disminuir el tiempo de incubacin.
5. Durante la PCR Qu sucede en la fase de alineacin?
Alineamiento. Al disminuir la temperatura de incubacin los iniciadores se unen al ADN molde
en las zonas 3complementarias. Ambos iniciadores se unen de manera especfica al ADN
flanqueando el fragmento que se quiere amplificar. En este caso, la temperatura y el tiempo van
a depender de 3 factores relacionados con los iniciadores: la concentracin, el nmero de bases
y el porcentaje de guaninas-citosinas. En la prctica, la temperatura de alineamiento oscila entre
45 y 65 C durante un tiempo entre 30 segundos y 1 minuto. Un aumento de temperatura o del
tiempo favorece la especificidad porque disminuye las uniones incorrectas de los iniciadores
con la hebra molde.
6. Durante la PCR Qu sucede en la fase de elongacin?
Extensin. Esta etapa, tambin conocida como elongacin, amplificacin o polimerizacin,
consiste en la sntesis de la nueva cadena de ADN, a partir del extremo 3 del iniciador por
accin de la ADN polimerasa, empleando como sustrato los cuatro dNTPs. En la mayora de las
reacciones, la etapa de extensin se realiza a 72 C porque es la temperatura a la cual la Taq
polimerasa (enzima ms utilizada) alcanza su mayor actividad. El tiempo de extensin depende
27
de la longitud del fragmento a amplificar, la Taq polimerasa aade de 500 a 1000 nucletidos
por minuto. 2.3 Extensin final. Generalmente, al terminar los ciclos, se realiza una ltima
extensin de aproximadamente 5 minutos a 72 C para permitir que la polimerasa termine de
sintetizar todos los fragmentos que pueden haber quedado incompletos.
Iniciador = cebador = primer
Primer polimerasa termoestable conocida como Taq polimerasa, a partir de la bacteria Thermus
aquaticus que vive en ambientes acuticos con temperaturas cercana a los 100 C. Esta nueva
enzima permiti la simplificacin y automatizacin de la PCR, sin necesidad de adicionar
polimerasa en cada uno de los ciclos (Saiki et al. 1988). La Taq polimerasa es la enzima ms
utilizada en la PCR, pero presenta la desventaja de que no tiene actividad correctora
(actividad nucleasa 3 5), por lo que existe la probabilidad de introducir errores durante el
copiado del ADN.
BIBLIOGRAFA
Bolt HM, Roos PH, Their R. The cytochrome P-450 isoenzyme CYP2E1 in the biological processing
of industrial chemicals: consequences for occupational and environmental medicine. Int Arch
Occup Environ Health 2003; 76: 174-185.
Gonzlez-Jasso E, Lpez T, Lucas D, Berthout F, Manno M, Ortega A, et al. CYP2E1 regulation by
benzene and other small organic chemicals in rat liver and peripheral lymphocytes. Toxicol Lett
2003; 144: 55-67.
Hong JY, Yang CS. Genetic polymorphism cytocrome P450 as a biomarker of susceptibility to
environmental toxicity. Environ Healt Perspect 1997; 105 (Suppl 4): 759-762.
Lucas D, Ferrara R, Gonzales E, Albores A, Manno M, Berthou F. Cytochrome CYP2E1 phenotyping
and genotyping in the evaluation of health risks from exposure to polluted environments. Toxicol
Lett 2001; 124 (1-3): 71-82.
Somma M, Querci M. (2015). Anlisis de la Presencia de Organismos Genticamente Modificados en
Muestras de Alimentos. PCR. European Commission JRC.
28
Prctica #5 Polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccin (R.F.L.P) para

determinacin del genotipo de la regin Dral del CYP2E1
OBJETIVO
Reconocer la importancia de los polimorfismos genticos y aplicar la tcnica R.F.L.P para su
identificacin.
GENERALIDADES
Los fragmentos de restriccin de longitud polimrfica (RFLPs) son un tipo de polimorfismo que resulta
de la variacin en la secuencia de ADN reconocida por las enzimas de restriccin. Estas son enzimas
bacterianas que utilizan los cientficos para cortar molculas de ADN en lugares conocidos. Los RFLPs
(se pronuncia "rif lips") y que se utilizan como marcadores en los mapas genticos. Por lo general, para
visualizar los RFLPs se utiliza la electroforesis en gel.
Esta tcnica ha demostrado ser til para el diagnstico de mutaciones puntuales causadas por el cambio
de una base nitrogenada o pequeas deleciones o inserciones que crean o destruyen un sitio de
restriccin. Se basa en la deteccin de fragmentos de ADN de distinto peso molecular o de longitudes
diferentes, de manera que, mediante el anlisis de los polimorfismos en el tamao de los fragmentos de
restriccin, es posible determinar la presencia o no de la mutacin, y por tanto, el genotipo del
individuo (Zbar et al., 1996).
CYP2E1
Especial mencin merece el CYP2E1, que es una de las enzimas CYP ms estudiadas tanto en animales
como en humanos, debido a su papel en el metabolismo del etanol y por su participacin en la
activacin metablica de una serie de procarcingenos, como N-dimetil nitrosamina y de solventes
orgnicos como el tetracloruro de carbono y el benceno (Lieber, 1997). El contenido heptico de
CYP2E1 es alrededor de 7% del CYP total y tambin se encuentra presente en el cerebro y pulmn. La
mayora de sus 70 sustratos demostrados son molculas pequeas e hidrofbicas (Ronis et al., 1996),
29
incluyendo slo algunos pocos productos farmacuticos como paracetamol, clorzoxazona, enflurano y
halotano (Guengerich, 1995). El disulfiram es el inhibidor del CYP2E1 usado en clnica y muchos de
sus sustratos son adems sus inductores, tal como acetona, etanol, piridina, pirazol e isoniazida (Ronis
et al., 1996). El CYP2E1 adems metaboliza acetominofn, formando N-acetil-p-benzoquinoneimina
(NAPQI), metabolito hepatotxico el que en condiciones normales se elimina conjugado con glutatin.
En una situacin de sobredosis de acetominofn o frente a una ingesta aumentada de etanol (fuerte
inductor de CYP2E1) se puede producir hepatotoxicidad.
Adems de activar procarcingenos, el CYP2E1 es importante en patologa puesto que se ha descrito
como una de las enzimas que produce mayor cantidad de especies reactivas de oxgeno (anin
superxido y H2O2), las que son formadas en presencia o en ausencia de sustrato y que seran los que
posteriormente causaran dao tisular (Lieber, 1997).
MATERIAL
Pipetas automticas de 0.1 a 2.5 L, 2 a 20 L, 20-200 L, 200 a 1000 L
Puntas para micropipeta estriles
Matraz Erlenmeyer de 250 mL
Papel de aluminio
Papel Parafilm
Esptula de plstico
Tubos Eppendoff de 0.65 mL estriles
Bao de hielo
Reactivo
Agua inyectable estril
Enzima de restriccin DraI
Albmina bovina srica acetilada
Solucin amortiguadora B
Agarosa
30
TAE 1X
Azul de bromofenol
Bromuro de etidio 10 g/L
Marcador de 100 pares de bases
Equipo
Bao de agua con control de temperatura
Transiluminador
Fotodocumentador
Microcentrfuga
Vortex
Balanza analtica
Horno de microondas
Cmara de electroforesis horizontal con fuente de poder
METODOLOGA
Digerir el producto de PCR con la enzima de restriccin DraI, bajo las siguientes condiciones:
En bao de hielo elaborar una mezcla de reactivos (pool) de acuerdo al nmero de muestras a
trabajar y a los reactivos especificados en la siguiente tabla:
Componente
Solucin buffer 10X
Albmina bovina srica acetilada (10 g/L)
Producto de PCR correspondiente
Enzima de restriccin DraI, 10 u/L
Agua estril desionizada para un volumen final de
Volumen
2 L
0.2 L
3 L
0.5 L
20 L
En un microtubo de 0.65 mL colocar el producto de PCR y el pool de reactivos. Incubarlo a 37C por
tres horas.
31
Una vez terminada la reaccin proceder a verificar los patrones de corte de los fragmentos
correspondientes mediante electroforesis en gel de agarosa al 2 %.
Observar los resultados en el transiluminador y hacer la interpretacin de acuerdo a la siguiente
tabla:
Patrones de corte de la enzima de restriccin DraI
Patrn de corte
240 pb
133 pb
373 pb
240 pb
133 pb
373 pb
Resultado
DD (homocigoto
silvestre)
CD (heterocigoto)
CC (homocigoto
mutado)
Prctica muy similar a la 7.
La siguiente imagen muestra un estudio previo sobre el anlisis del polimorfismo del CYP2E1 y su
influencia sobre intoxicaciones con plaguicidas.
Figura 1. Polimorfismo de longitud de fragmentos de
restriccin para el CYP2E1. Patrones de corte con la
enzima Dral de los fragmentos amplificadores del ADN
genmico con los oligonucletidos especficos para el
CYP2E1. Gel de agarosa al 1.5% teido con bromuro
de etidio en donde se observan los patrones de corte.
Carril 1: marcadores de tamao molecular; carril 2:
homocigoto mutado; carril 3: heterocigoto; carril 4:
homocigoto silvestre; carril 5: homocigoto silvestre.
Tomado de Yerena et al., 2005; Influencia del polimorfismo del
CYP2E1 sobre el riesgo de intoxicacin aguda por exposicin a
plaguicidas.
32
Los fragmentos de restriccin de longitud polimrfica (RFLPs) son polimorfismos resultado de la

variacin en la secuencia de ADN reconocida por las enzimas de restriccin. Estas son enzimas
bacterianas utilizadas para cortar molculas de ADN en lugares conocidos.
Los polimorfismos de genes son temas importantes, ya que de ello derivan muchas enfermedades
debido a la poca o nula actividad enzimtica que presenta el organismo frente agentes extraos que
tienen que ser metabolizados y eliminados.
PREGUNTAS
1. Qu son las enzimas de restriccin, cmo actan?
Las enzimas de restriccin son nucleasas que cortan ADN de doble cadena cuando reconocen un
patrn de secuencia especfico. Generan fragmentos de ADN conocidos como fragmentos de
restriccin. Las enzimas de restriccin son herramientas imprescindibles en biologa molecular,
ingeniera gentica y biotecnologa.
Las enzimas de restriccin reconocen una secuencia de ADN entre 4-8 bp. El sitio de
reconocimiento se llama sitio de restriccin, y la enzima rompe un enlace fosfodiester en la hebra
de arriba (sens) y otro enlace fosfodiester en la hebra complementaria (antisens).
2. En qu consiste el RFLP?
Es una tcnica muy frecuentemente utilizada en los estudios moleculares, y consiste en la
combinacin de dos mtodos b- sicos en el trabajo molecular. En primer lugar se realiza una
amplificacin por PCR del gen que queremos estudiar, y posteriormente se realiza la digestin (o
corte en fragmentos) del producto amplificado con enzimas de restriccin, para ver los
fragmentos resultantes o fragmentos de restriccin de ese gen. Este mtodo es til para detectar
pequeas inserciones o deleciones en determinados fragmentos de restriccin de un gen, ya que el
tamao de los mismos se ver aumentado o disminuido, respectivamente. En otros casos, ciertas
mutaciones puntuales en un gen, que alteran la secuencia de nucletidos del mismo, pueden crear
33
nuevos sitios de restriccin o hacer desaparecer aquellos presentes en el gen normal, lo que
alterar el patrn de los fragmentos de restriccin observables en electroforesis.
3. Qu secuencia corta la enzima DraI?

Las marcadas con amarillo:
ggaggcggca ggctaaccca cccgtgagcc agtcgagtct acattgtcag ttctcacctc
gaggggtgcc aaaaaccaga gggaagcaaa ggcccctgaa gcctctgcca gaggccaacg
ccccttcttg gttcaggaga ggtgcagtgt taggtgcagc acaaccaatg acttgcttat
gtggctaata aattgtcaag agaaaaactg ggttagaatg caatatatag tatgtagtct
catttttgta taaatacaag tatagaatgg cataactcaa aatccacaag tgatttggct
ggattgtaaa tgacttttat tttcttcatt tctcatcata ttttctatta tacataaaga
ttcattgtta atataaaagt acaaaattgc aacctatgaa ttaagaactt ctatatattg
ccagttagaa gacagaatga aaaacattct cttcattcta accacacaca caaaaaagct
ccacaaaata cctatggact accttcatag aaggtggaag agggtctgta tgaagaaaat
gcttaataca tgaaagaaga agctagtcaa tgtggaggtc tattgtgcgc cgggatcaac
aaagacaaga tatgtttaaa atggtgttct aaatttaccc taatgtaaaa caaatccaat
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tgtattacat aaaccctact ccaaacaaat gcatggggat gtggctggag ttccccgttg
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aacatgttcc tggatgtgtt tgctggcaca gtgacaggtg ctagcaacca gggtgttgac
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34
gaatcagcct ttgaaacgat ggccaacagc agctaataat aaaccagtaa tttgggatag

acgagtagca agagggcatt ggttggtggg tcaccctcct tctcagaaca cattataaaa
accttccttt ccacaggatt gtcctcccgg gctggcagca gggccccagc ggcaccatgt
ctgccctcgg agtcaccgtg gccctgctgg tgtgggcggc cttcctcctg ctggtgtcc
4. Qu es un sitio polimrfico?
Nmero de posiciones en un conjunto de secuencias alineadas, donde se puede observar al menos
una mutacin nmero de posiciones en un conjunto de secuencias alineadas, donde se puede
observar al menos una mutacin
5. Qu importancia tiene determinar este genotipo?

El CYP2E1, tiene un papel importante en la biotransformacin de diversos xenobiticos por el
amplio espectro de compuestos qumicos que metaboliza, por lo que las posibles consecuencias
de las diferencias interindividuales e intertnicas de susceptibilidad pueden estar relacionadas con
la expresin individual de sntomas clnicos de intoxicacin (Bolt y Roos, 2003).
BIBLIOGRAFA
Bolt HM, Roos PH, Their R. The cytochrome P-450 isoenzyme CYP2E1 in the biological processing
of industrial chemicals: consequences for occupational and environmental medicine. Int Arch
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1995; 179-231.
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Mutat. 7ma. ed. Barcelona: Elsevier Mason; 1996. ; 8 (4): p. 348-57.
36
Prctica #6 Electroforesis en gel de poliacrilamida

OBJETIVO
Realizar la tcnica de electroforesis en gel de poliacrilamida, con previa indagacin de los
fundamentos de la misma.
GENERALIDADES
La electroforesis en geles de poliacrilamida es utilizada para ver secuencias de ADN de bajo peso
molecular, entre 80pb y 300pb. Ha sido ampliamente utilizada para el trabajo con microsatlites o SSR
en la construccin de mapas de ligamiento, estudios poblacionales y en la seleccin asistida por
marcadores moleculares (MAS). Adicionalmente es una herramienta til para el aislamiento de
pequeas secuencias cuyo trabajo se dificulta en geles de menor resolucin, geles de agarosa.
La tcnica consiste en la elaboracin de una fina capa de gel de acrilamida adherida a una lmina de
vidrio por la cual migra el ADN. Al igual que en un gel de agarosa, la migracin responde a la carga
negativa neta de la molcula de ADN y la concentracin del gel. Las secuencias de ADN ms pequeas
migran a mayor velocidad mientras que las grandes se quedan atrs.
La tcnica se lleva a cabo en cinco pasos: el montaje de la cmara de electroforesis, la preparacin de la
solucin de poliacrilamida y el llenado de la cmara, la pre-corrida del gel, la corrida de las muestras y
la tincin del gel.
Los geles de poliacrilamida pueden ser desnaturalizantes o no. Los que los son, se utilizan para la
corrida de microsatlites. Estos presentan altas concentraciones de urea (5M) y son corridos a elevadas
temperaturas (50-55C), permitiendo que las hebras de ADN permanezcan separadas durante la
electroforesis. Priori a la servida de este tipo de gel, los productos de PCR son desnaturalizados, a fin
de incrementar la resolucin de la separacin, mediante calentamiento a 95C y tratamiento con
formamida.
La visualizacin de las bandas puede hacerse directamente por tincin con bromuro de etidio (geles de
agarosa) o nitrato de plata, a travs de autoradiografa utilizando iniciadores marcados con
radioistopos en la reaccin de PCR o mediante fluorescencia cuando se utilizan geles de
secuenciacin. La deteccin mediante fluorescencia es el mtodo analtico con mayor sensibilidad,
mientras que la deteccin radioactiva y mediante tincin con AgNO3 tienen sensibilidad equivalente
(Comisine et al., 1995, Christensen et al., 1999, Creste et al., 2001).
37
El tratamiento de desechos luego de los procesos de electroforesis y tincin son de vital importancia a
fin de evitar la contaminacin de los espacios de trabajo y del personal. La solucin de AgNO 3 debe ser
precipitada con sales y filtrada antes de ser descartada en el lavaplatos. Los restos de poliacrilamida,
luego del desprendimiento de geles, al igual que todos aquellos desechables en contacto con ella
(servilletas, guantes, puntas, etc.), deben ser depositados en bolsas plsticas aptas para incineracin
debidamente etiquetadas.
Figura 1. Pasos a seguir para instalar el gel de poliacrilamida en su base.
MATERIAL
Matraz Erlenmeyer de 50 mL
Tubos de centrfuga de 50 mL, de polipropileno, fondo cnico
Bandejas de plstico para teido
Reactivo
Solucin de Acrilamida/bisacrilamida 29:1
Buffer TBE (Tris-borato-EDTA) 5x y 1X
Persulfato de amonio al 10%
TEMED (N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina)
Azul de bromofenol
Marcador de pb
38
Bromuro de etidio 10g/L
Equipo
Cmara de electroforesis vertical con aditamentos y fuente de poder
Pipetas automticas de 2 a 20 L, 200 a 1000 L
Transiluminador
Fotodocumentador
METODOLOGA
1.
Colocar el soporte para preparar los geles sobre una superficie plana y ponerle las gomas de
hule en la parte inferior. Los vidrios para preparar los geles deben limpiarse perfectamente con
alcohol al 70% y dejar secar.
2.
Alinear los vidrios (uno grande y uno pequeo) y fijarlos dentro del marco correspondiente.
Colocarlos en el soporte, alinendolos bien con la goma inferior.
3.
Llenar el espacio de los geles con agua destilada para verificar que no haya fugas, en cuyo caso
debern armarse nuevamente. Eliminar el agua destilada.
4.
Preparar una solucin de poliacrilamida al 10%. Para 9 mL de mezcla (cantidad suficiente para
dos geles), aadir:
5.094 mL de agua destilada
2.997 mL de poliacrilamida 29:1
0.9 mL de TBE 5x
72 L de persulfato de amonio
9 L de TEMED
El TEMED, debe agregarse al final e inmediatamente despus de adicionarlo, vaciar la mezcla en las
placas previamente armadas para, al final, colocar los peines y dejar solidificar.
5.
Retirar los peines, quitar los vidrios con geles del soporte y lavar los pozos con TBE 1X.
6.
Hacer el montaje de los vidrios con los geles en el soporte de los electrodos, el vidrio pequeo
debe ir hacia adentro. Inmediatamente deslizarlos dentro de la cmara, cuidando que queden bien
alineados en la parte inferior y fijarla con los seguros. Llenar la cmara interior con TBE 1X.
7.
Preparar las muestras mezclando 10 L de producto de restriccin y 0.5 L de azul de

bromofenol. Colocarlas en los pozos. En uno de los pozos colocar 5 L de marcador de pb
39
8.
Colocar la cmara dentro del tanque y agregar un poco de buffer de corrida. Tapar el tanque,
conectarla y encender la fuente de poder. Hacer el corrimiento a 80-100 volts durante
aproximadamente 45 minutos.
9.
Sacar los geles de la cmara de electroforesis y teirlos colocndolos a temperatura ambiente

durante 30 a 45 minutos en buffer TBE 1X adicionado de bromuro de etidio, a una concentracin
de 0.5 g/mL.
10. Lavar el gel en agua destilada durante 5 minutos.

11. Visualizar los resultados en el transiluminador con luz ultravioleta, procediendo a digitalizar la
imagen del gel.
Solo se realiz el gel de poliacrilamida como prctica ilustrativa, en otras prcticas (RFLP) se utiliz el
gel para correr algunas muestras.
El gel de poliacrilamida es efectivo para separar fragmentos de ADN pequeos y tiene un alto grado de
resolucin a comparacin con el gel de agarosa.
Figura 1. Preparacin de gel de poliacrilamida al 10%.

Se obtuvo dificultad para realizar el gel: se presentaron
fugas debajo de la goma, el gel se peg al cristal, algunas
veces no solidific. La caducidad de los componentes, la
temperatura a la que se realiza la tcnica junto con los
compuestos, la cantidad que se agrega influye en la
composicin, solidificacin y funcionalidad del gel.
La prctica constante para elaborar un buen gel de poliacrilamida es importante pues evita que
interfiera en la separacin de nuestro ADN.
PREGUNTAS
1. Qu es la poliacrilamida?
La poliacrilamida es un homopolmero de acrilamida. Se forma por copolimerizacin de dos
compuestos, la acrilamida y la bis-acrilamida (N,N-metiln-bis-acrilamida), en una reaccin
40
iniciada por la tetrametiletilndiamina (TEMED) y el persulfato de amonio. El radical persulfato

activa al TEMED, el cual a su vez activa al monmero de acrilamida para que se polimerice. Las
cadenas de poliacrilamida son entrecruzadas al azar por la bisacrilamida, formndose as una red
de porosidad bastante uniforme, que puede ser regulada variando las condiciones de la reaccin y
las concentraciones de los monmeros.
2.- Cul es la funcin del TEMED?

La reaccin de polimerizacin se inicia por un sistema redox de catlisis. El TEMED cataliza la
formacin de radicales libres que dirigen la reaccin a partir del ion persulfato que se aade en
forma de APS (persulfato amnico) y que acta como iniciador.
3.- En qu casos es mejor utilizar geles de poliacrilamida y en cules de agarosa?

Los geles de poliacrilamida son ms efectivos para separar fragmentos pequeos de ADN (5-500
pb); su poder de resolucin es extremadamente grande, pudiendo separar fragmentos que difieren
apenas 1pb. Aunque este tipo de geles corre rpidamente y en comparacin a los geles de
agarosa, pueden acomodarse un nmero mayor de muestras, poseen la desventaja de ser ms
difciles de preparar y manejar que aquellos, y como caracterstica distintiva los de poliacrilamida
se corre verticalmente en un campo elctrico constante. Los geles de agarosa poseen un poder
resolutivo menor respecto de los de poliacrilamida, pero poseen un rango mayor de separacin.
Mediante concentraciones variables de agarosa, se pueden separar fragmentos de ADN desde 200
hasta aproximadamente 500 kb de longitud. Este tipo de geles usualmente se corren en
configuracin horizontal.
BIBLIOGRAFA
Christensen M, Sunde L, Bolund L, Orntoft TF. 1999. Comparison of three methods of microsatellite
detection. Scandinavian Journal Clinical and Laboratory Investigation 59:167-178.
Comisine S, Leone P, Redaelli L, DeGiuli L, Zhang Y, Ferreti L. 1995. Characterization of bopvine
microsatellites by silver staining. Jornal of Animal Breeding and Genetics 112:415-420.
41
Crest S, Tulman-Neto A, Figueira A. 2001. Detection off single sequence repeat polymorphisms in
denaturing polyacrilamide sequencing gels by silver staining .Plant Molecular Biology Reporter
19:299-306.
42
Prctica #7 Determinacin del genotipo de GSTM1 y GSTT1

OBJETIVO
Determinar el genotipo de GSTM1 y GSTT1 mediante la tcnica de PCR mltiple aleloespecfico.
Conocer y manipular la tcnica de PCR mltiple alelo-especfico.
GENERALIDADES
La PCR Alelo Especifica (ASO-PCR) es un sistema de PCR que utiliza cebadores o primers
especficos de forma que permite amplificar exclusivamente un alelo concreto y no el resto de alelos
posibles. De este modo tendremos solamente producto amplificado en el caso de que exista una
mutacin concreta en el ADN del paciente.
Cada individuo tiene un grado diferente de susceptibilidad de llegar a desarrollar cncer gstrico. Estas
diferencias pueden ser producto de ciertos polimorfismos genticos. Algunos de los polimorfismos que
han sido estudiados como factores de riesgo de cncer gstrico son los polimorfismos del gen de la
interleucina 1- (El-Omar et al. 2000) o de genes involucrados en el metabolismo de sustancias
cancergenas, entre otros (Nishimoto et al. 2000, Cai et al. 2001, Saadat y Saadat 2001).
Actualmente las principales enzimas conocidas involucradas en el metabolismo de sustancias
cancergenas pertenecen a las familias citrocromo P450 y Glutatin S-transferasa. Estas participan en la
activacin y desintoxicacin de sustancias que podran actuar como factores de riesgo o de proteccin
de cncer gstrico. Las sustancias cancergenas pueden provenir de los alimentos, drogas u otro tipo de
sustancias qumicas que ingresan al cuerpo o de sustancias endgenas (Lang y Pelkonen 1999). Los
individuos que cargan la forma ms activa de una enzima relacionada con la activacin de los
carcingenos, o los alelos menos eficientes de las enzimas de desintoxicacin, podran presentar un
mayor riesgo de desarrollar cncer (Krajinovic et al. 1999).
Las glutation S-transferasas son una familia de enzimas involucradas en mecanismos de detoxificacin
celular, eliminando xenobiticos y substancias nocivas para las clulas. Los genes que codifican la
sntesis de las isoformas GSTM (mu)1, GSTT (theta)1 y GSTP (pi) son altamente polimrficos. Existen
2 polimorfismos caracterizados por una delecin de los genes GSTM1 y GSTT1 que conllevan una
prdida total de la activad enzimtica correspondiente y cuya presencia se ha asociado con un mayor
riesgo de desarrollar ciertos tipos de cncer. Se produce una disminucin de la actividad detoxificadora
cuando se hereda delecionado del gen GSTM1; es decir, ser portador en homocigosis de una delecin
en el gen GSTM1 causa una disminucin de la actividad enzimtica. De igual modo que con el gen
43
GSTM1, si se hereda en homocigosis una delecin del gen GSTT1 se produce una disminucin de la
actividad detoxificadora. El glutatin S transferasa M1 (GSTM1) est implicada en la detoxificacin de
hidrocarburos aromticos policclicos (HAP) y benzo (a) pireno en el humo del tabaco. El
glutatin S transferasa T1 (GSTT1) est implicada en reacciones de activacin y de desintoxicacin y
cataliza la conjugacin de productos qumicos industriales, por ejemplo, xidos de etileno, con
glutatin. Deleciones homocigticas de los GSTM1 y GSTT1 genes son comunes y dan como resultado
una prdida completa de la actividad de la enzima.
MATERIAL
Matraz Erlenmeyer de 250mL

Papel aluminio
Esptula de plstico
Puntas para micropipeta estriles (Corning)
Bao de hielo
Tubos Eppendorf de 0.5mL estriles (Corning)
Reactivo
Equipo de reactivos para PCR (GoTaq PCR CoreSystem, Promega)
Primers (IDT):
GSTM1:
G1 - 5' GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C 3'
G2 - 5' GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G 3'
Prctica 7
GSTT1:
T1 - 5' TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC 3'
T2 - 5' TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA 3'
CYP1A1:
A - 5' GAA CTG CCA CTT CAG CTG TCT 3'
B- 5' CAG CTG CAT TTG GAA GTG CTC 3'
Agua inyectable estril (Pisa)
Agarosa (Promega)
TAE 1X
Azul de bromofenol
Bromuro de etidio (10 mg/mL, Promega)
Marcador de pares de bases (100bp DNA ladder, Promega)
Equipo
Vortex (Genie 2)
Microcentrfuga (Labnet)
44
Micropipetas de 0.1 a 2.5L; 2 a 20L; 20 a 200L; 100 a 1000L

Termociclador (Techne TC-512)
Transluminador (SyngeneBioImaging)
Fotodocumentador (SyngeneBioImaging)
Balanza analtica (Kern ALS220-4))
Horno de microondas (LG)
Cmara de electroforesis horizontal con fuente de poder (BioRad)
Congelador a -70C (Revco)
Refrigerador a 4C (LG)
METODOLOGA
En bao de hielo, preparar una mezcla de reactivos (pool) de acuerdo al nmero de muestras a trabajar,
considerando que para cada muestra se requieren las siguientes cantidades de reactivos:
Componente
Volumen
Concentracin
Solucin de MgCl2 25 mM
Solucin buffer 5 X libre de MgCl2
Mezcla de nucletidos para PCR (10 mM c/u)
Primer IA11
Primer IA12
Primer G1
Primer G2
1.2 L
4.0 L
0.4 L
1.4 L
1.4 L
1.4 L
1.4 L
final
1.5 mM
5.0X
200 M cada uno
0.7 M
0.7 M
0.7 M
0.7 M
Primer T1
1.4 L
0.7 M
Primer T2
Taq polimerasa
ADN molde
Agua libre de nucleasas para un volumen final de
1.4 L
0.2 L
3 L
20 L
0.7 M
1.25 u
0.5 a 1 g
En un microtubo de 0.65 mL colocar el pool de reactivos y el ADN molde, mezclando bien con la
misma pipeta. Colocarlo en el termociclador bajo el siguiente programa:
10 minutos a 94 C
Desnaturalizacin del ADN
PRIMERA SERIE DE 20 CICLOS

30 segundos a 94 C
30 segundos a 63 C
Alineacin
60 segundos a 72 C
SEGUNDA SERIE DE 27 CICLOS

30 segundos a 94 C
45
30 segundos a 46 C
Alineacin
60 segundos a 72 C
7 minutos a 72C
Elongacin final
4C
Una vez terminada la reaccin llevar a cabo una electroforesis en gel de poliacrilamida con los
productos de PCR obtenidos, tal como se describe en la prctica # 6, colocando en el primer pozo el
marcador de pares de bases.
Figura 2. Representacin grfica de las posibles bandas observadas en un gel de agarosa al 2%. 1) Se observa la banda de
GSTT1 y la banda de GSTM1, ambos son positivos; 2) Tanto GSTT1 como GSTM1 no presentan la banda, ambos son
nulos.
Mediante esta prctica se observ la variabilidad que presentan los individuos, encontrndose que el
genotipo homocigoto silvestre para DraI (DD), de acuerdo a la literatura, rige funcionamiento en la
actividad enzimtica por lo tanto brinda proteccin ante los factores externos que puedan provocar
alguna enfermedad (principalmente radicales libres u otros factores que propensa al individuo a
contraer cncer); mientras que la presencia de genotipos con alelo mutado (CD,CC) est asociada con
un mayor riesgo de una disminucin de la actividad detoxificadora cuando se hereda delecionado el
gen GSTM1, por lo que la determinacin de este polimorfismo del CYP2E1 puede tener utilidad como
biomarcador de riesgo.
46
Se puede observar que la poblacin con genotipo DD es mayor que los individuos que presentan
genotipo con alelo mutado (CD, CC).
El gen GSTM se localiza en el cromosoma 1p13 y hasta el momento se conocen 5 variantes allicas:
GSTM1, GSTM2, GSTM3, GSTM4 y GSTM5. Se produce una disminucin de la actividad
detoxificadora cuando se hereda delecionado del gen GSTM1; es decir, ser portador en homocigosis de
una delecin en el gen GSTM1 causa una disminucin de la actividad enzimtica. La clase theta de las
GST comprende dos genes que codifican dos protenas GSTT1 y GSTT2. De igual modo que con el
gen GSTM1, si se hereda en homocigosis una delecin del gen GSTT1 se produce una disminucin de
la actividad detoxificadora. En cuanto a la subfamilia de GSTP comprende un nico gen GSTP1 en el
que se han descrito dos variantes allicas que difieren en la base 313 del cDNA, una adenina (A) por
una guanina (G); esta diferencia produce un cambio de una valina (Val) por una isoleucina (Ile) en el
codn 105 de la secuencia aminoacdica provocando una unin defectuosa de la enzima al sustrato, y
con ello una disminucin de la actividad detoxificadora (Strange y Spiteri, 2001; Ye y Song, 2005;
Frova 2006).
Ser portador en homocigosis de delecin en el gen GSTM1 y/o GSTT1 se ha asociado con una mayor
susceptibilidad a desarrollar distintos tipos de cncer (Parl, 2005; Ye y Song, 2005; White et al., 2008),
enfermedad heptica por alcoholismo (Brind et al., 2004) y otras enfermedades de carcter inflamatorio
(Brind et al., 2004; Miller et al., 2003).
PREGUNTAS
1. Qu es la farmacogenmica?
Se encarga de comprender las bases genticas de la enfermedad y as poder definir nuevas
dianas teraputicas o marcadores moleculares que evalen la eficacia de nuevos frmacos. Su
objetivo final es conseguir nuevos y efectivos frmacos para las enfermedades comunes que
carecen de tratamiento adecuado en la actualidad. La farmacogentica es el estudio de la
respuesta farmacolgica del individuo segn el genotipo, o dicho de otra manera, el estudio del
papel de la herencia en la variacin individual de la respuesta farmacolgica, tanto en lo que se
refiere a eficacia en la respuesta como a efectos adversos.
47
2. Qu importancia tiene el CYP2D6 dentro de la farmacogenmica?

Polimorfismos de la enzima CYP2D6 en el metabolismo de muchos medicamentos, pues esta
cataliza la biotransformacin oxidativa de alrededor del 25% de los medicamentos de uso
comn.
3. A qu se refiere el trmino de metabolizador pobre o lento?
Un metabolizador pobre (PM, Poor Metabolizer) no es capaz de procesar los frmacos por
carecer de alelos funcionales (CYP2C19, CYP2D6 y TPMT), o por tener alelos que producen
variantes poco funcionales de la enzima o carecer de la enzima.
4. Cul es la diferencia entre una PCR simple y una tetraprimer?
Tetraprimer: permite la deteccin de cualquier mutacion puntual. Esta tcnica permite la
amplificacin enzimtica de alelos especficos, mediante el uso de cebadores que estn
diseados para discriminar entre secuencias que difieren en una nica base.
5. Por qu en esta prctica se deben realizar dos series de ciclos?

Porque la segunda ronda de ciclos le da al producto de la PCR una mayor especificidad a los
primers para realizar la elongacin final y detectar el alelo.
48
6. En esta prctica cmo se diferencia un homocigoto silvestre de un homocigoto mutado y de un

heterocigoto?
7. Qu importancia tiene la determinacin del genotipo de GSTM1 Y GSTT1?

Las glutation S-transferasas son una familia de enzimas involucradas en mecanismos de
detoxificacin celular, eliminando xenobiticos y substancias nocivas para las clulas. Los
genes que codifican la sntesis de las isoformas GSTM (mu)1, GSTT (theta)1 y GSTP (pi) son
altamente polimrficos. Existen 2 polimorfismos caracterizados por una delecin de los
genes GSTM1 y GSTT1 que conllevan un prdida total de la activad enzimtica correspondiente
y cuya presencia se ha asociado con un mayor riesgo de desarrollar ciertos tipos de cncer. Se
produce una disminucin de la actividad detoxificadora cuando se hereda delecionado del gen
GSTM1; es decir, ser portador en homocigosis de una delecin en el gen GSTM1 causa una
disminucin de la actividad enzimtica. De igual modo que con el gen GSTM1, si se hereda en
homocigosis una delecin del gen GSTT1 se produce una disminucin de la actividad
detoxificadora. El glutatin S transferasa M1 (GSTM1) est implicada en la detoxificacin de
hidrocarburos aromticos policclicos (HAP) y benzo (a) pireno en el humo del tabaco. El
glutatin S transferasa T1 (GSTT1) est implicada en reacciones de activacin y de
desintoxicacin y cataliza la conjugacin de productos
ejemplo, xidos
de
etileno,
con
qumicos
glutatin. Deleciones
industriales, por
homocigticas
de
los GSTM1 y GSTT1 genes son comunes y dan como resultado una prdida completa de la
actividad de la enzima.
8. A qu fase de biotransformacin corresponde?
49
Fase II
9. Qu diferencia hay entre una PCR convencional y PCR MLTIPLE ALELO-ESPECFICO?
La PCR consiste en la obtencin de mltiples copias in vitro de una secuencia especifica de
ADN. Est diseada para producir una amplificacin selectiva, unas 10 6 veces, de las secuencia
diana de ADN.
La PCR alelo-especifica (denominada tambin ARMS-Sistema de Mutacin Refractario a
Amplificacin), es una modalidad de PCR en la que, debido al cebador utilizado,
complementario a un alelo concreto de un gen, permite la amplificacin de un alelo especfico
individual y no del resto de alelos posibles.
BIBLIOGRAFA
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51

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FECHA DE ENTREGA | VIERNES 5 DE JUNIO DEL 2015

ELVIS MARIAN CORTAZAR

El diagnstico molecular es un trmino general que engloba un conjunto de tcnicas de biologa

Prctica # 1 Extraccin de ADN en muestra sangunea

cido nucleico diana;

Material necesario para extraccin de sangre.

tritn X-100 pH 7.5).

Centrfuga refrigerada con velocidad hasta 14,000 rpm y cabezales mltiples.

3. Cul es la funcin del NaCl durante la extraccin?

Prctica #2 Cuantificacin de ADN de muestra sangunea por espectrofometra con luz UV

3. Por qu se efectan lecturas a 260 y 280 nm?

Prctica #3 Electroforesis en gel de agarosa

Figura 1. Esquema representativo de una corrida electrofortica

Dependiendo de la concentracin de agarosa en el gel, la matriz formada permitir la separacin

Matraz Erlenmeyer de 250 mL.

Figura 1. Gel de agarosa al 1.5, teida con

extraccin de ADN, puede interferir en su pureza y

en un mismo gel, pues lo que se deseaba observar

Figura 1. Un solidificado en gel de agarosa despus de la eliminacin del peine.

5. De qu factores depende la velocidad de migracin del ADN?

sacarosa, en agua. Almacenar a 4C.

Aadir color a la muestra, simplificando de este modo el rpoceso de carga,

Incorporar un colorante a la muestra que, en un campo elctrico, se desplace hacia el

Prctica #4 Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) para la amplificacin de la regin

Figura 2. La amplificacin exponencial del ADN mediante PCR.

para el sitio polimrfico DraI: 5-AGT-CGA-CAT-GTG-ATG-GAT-CCA-3

Oligonucletidos del CYP2E1 para DraI (sentido)

Desnaturalizacin del ADN

5. Repetir 35 ciclos a partir del punto 2

La caducidad de los componentes.

3. Para qu se agrega cloruro de magnesio?

Prctica #5 Polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccin (R.F.L.P) para

Los fragmentos de restriccin de longitud polimrfica (RFLPs) son polimorfismos resultado de la

3. Qu secuencia corta la enzima DraI?

gaatcagcct ttgaaacgat ggccaacagc agctaataat aaaccagtaa tttgggatag

5. Qu importancia tiene determinar este genotipo?

Prctica #6 Electroforesis en gel de poliacrilamida

Figura 1. Pasos a seguir para instalar el gel de poliacrilamida en su base.

Bromuro de etidio 10g/L

Preparar las muestras mezclando 10 L de producto de restriccin y 0.5 L de azul de

Sacar los geles de la cmara de electroforesis y teirlos colocndolos a temperatura ambiente

10. Lavar el gel en agua destilada durante 5 minutos.

Figura 1. Preparacin de gel de poliacrilamida al 10%.

iniciada por la tetrametiletilndiamina (TEMED) y el persulfato de amonio. El radical persulfato

2.- Cul es la funcin del TEMED?

3.- En qu casos es mejor utilizar geles de poliacrilamida y en cules de agarosa?

Prctica #7 Determinacin del genotipo de GSTM1 y GSTT1

Matraz Erlenmeyer de 250mL

Micropipetas de 0.1 a 2.5L; 2 a 20L; 20 a 200L; 100 a 1000L

Desnaturalizacin del ADN

PRIMERA SERIE DE 20 CICLOS

SEGUNDA SERIE DE 27 CICLOS

2. Qu importancia tiene el CYP2D6 dentro de la farmacogenmica?

5. Por qu en esta prctica se deben realizar dos series de ciclos?

6. En esta prctica cmo se diferencia un homocigoto silvestre de un homocigoto mutado y de un

7. Qu importancia tiene la determinacin del genotipo de GSTM1 Y GSTT1?

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