CENTRO UNIVERSITARIO DEL SUR

Integrantes (Equipo 9):

● Arias Romero Ana Karen
● López Pintor Melissa
● Moreno Macias Arturo Josué
Biología Molecular
División de ciencias de la salud
Departamento de ciencias básicas para la salud

2020-B

Ing. En Sistemas Biológicos

REPORTE PRÁCTICA II. “CITOMETRÍA DE

FLUJO del hongo Galactomyces”.

● Introducción.
Los galactomyces o galactomitos son un género de hongos de la familia Dipodascaceae, son
fermentados y filtrados cuidadosamente para obtener el ingrediente conocido como filtrado
de fermento de galactomyces, el cual brinda múltiples beneficios a nivel celular a la piel.

El filtrado de fermento de galactomyces es un extracto derivado de levadura densa en

nutrientes, un subproducto del proceso de fermentación del sake. Se dice que los efectos de
los galactomyces fueron descubiertos por primera vez por los cerveceros de sake, quienes
notaron que sus manos permanecían jóvenes y sin manchas a pesar de que el resto de sus
cuerpos envejecía. Galactomyces era supuestamente el ingrediente secreto detrás de sus
manos más jóvenes, suaves y brillantes.

En cosmética se utiliza como agente hidratante y tiene efectos antioxidantes. Algunos de los
efectos o beneficios que el filtrado de fermento de galactomyces provee a la piel son:

● Reducción significativa del tamaño de poros y puntos negros.

● Promueve un tono de piel uniforme, controlando la hiperpigmentación.
● Nutre y revitaliza la piel, reduciendo los signos del envejecimiento.
● Mejora la humedad de la barrera cutánea, protegiendo la piel del estrés ambiental.
● Regula la secreción de sebo.
● Disminuye el acné.

Por otro lado, tenemos a la citometría de flujo, la cual es una técnica de análisis que permite
identificar a diferentes poblaciones celulares simultáneamente, es un método rápido objetivo
y cuantitativo de análisis de células, núcleos, cromosomas, mitocondrias u otras partículas en
suspensión, mide múltiples parámetros celulares, como el tamaño, forma y complejidad.

La información producida puede agruparse en dos tipos fundamentales: la generada por la

dispersión de la luz y la relacionada con la emisión de luz por los fluorocromos presentes en
la célula o partícula al ser excitados por el rayo luminoso. Las señales luminosas detectadas
se transforman en impulsos eléctricos que se amplifican y se convierten en señales digitales
que son procesadas por una computadora. Un citómetro de flujo se encuentra compuesto por
tres principales sistemas, el de fluidos, el óptico, y el electrónico.
Las aplicaciones más relevantes de la citometría de flujo en la práctica médica se relacionan
con la hematología e inmunología clínicas, midiendo parámetros como número y
clasificación de células sanguíneas.

● Pregunta investigación:

¿Para que se van a usar las células estudiadas por citometría de flujo o que información
se busca? Se pretende estudiar las células del filtrado de fermento de Galactomyces, a partir
de un cultivo celular, con el fin de conocer si mediante su función antioxidante son capaces
de regular o inhibir la expresión de marcadores involucrados en el proceso de estrés
oxidativo, como el marcador CDKN2A/p16INK4A, el cual es una proteína que induce la
detención del ciclo celular. La acumulación de la proteína CDKN2A es un marcador de
senescencia en varios tipos de células.

● Objetivo:

Conocer, identificar y ser capaces de recrear todos los pasos involucrados en la técnica de
citometría de flujo realizada en el hongo galactomyces, así como analizar su importancia y
utilidad en el ámbito científico.

● Método.
Protocolo según Beckman Coulter Life Sciences. Protocolo para el análisis del ciclo
celular mediante citometría de flujo.

Materiales

● Kit de ciclo celular (Beckman Coulter, número de pieza C03551)*

● Tampón PerFix-nc 1 (Beckman Coulter, número de pieza B10825)
● Ciclina A2-FITC
● Suero de ternero fetal (FCS)
● Solución salina tamponada con fosfato (PBS)
● Fosfo-histona H3 mAB-A647 de conejo
● Citómetro de flujo CytoFLEX equipado con un láser azul y rojo (Beckman Coulter)*
● Software de análisis Kaluza versión 2.1 o superior (Beckman Coulter)*

Fijación de la muestra (procedimiento recomendado)

1. Coseche las células.

2. Añada 1 x 106 células en un tubo de 5 ml.
3. Centrifugue los tubos a 300 x g durante 5 minutos; aspire el sobrenadante.
4. Resuspenda el sedimento en 50 μl de FCS sin diluir.
5. Añada 2,5 μl de tampón PerFix-nc 1, agite en remolino inmediatamente e
incube durante 15 minutos a 18-25 °C.
6. Añada 3 ml de PBS.
7. Centrifugue los tubos a 300 x g durante 5 minutos; aspire el sobrenadante.
8. Resuspenda el sedimento en 3 ml de PBS.
9. Centrifugue los tubos a 300 x g durante 5 minutos; aspire el sobrenadante.
10. Continúe con el procedimiento de tinción.

Procedimiento de tinción: Tinción del ciclo celular

1. Resuspenda el sedimento de células fijas en el kit de ciclo celular de 0,5 ml,

agite en remolino el tubo e incube durante 15 minutos, protegiéndolo de la
exposición directa a la luz, entre 18 y 25 °C.
 2. La muestra está lista para la adquisición (consulte Medición de fluorescencia
de las células mediante citometría de flujo).

Medición de fluorescencia de las células mediante citometría de flujo.

1. Configure y ajuste el citómetro de flujo CytoFLEX con un láser azul (488 nm) y
filtros de detección de paso de banda de 610/20 nm para el PI. Para el análisis
multivariante, configure y ajuste el citómetro de flujo CytoFLEX con un láser azul
(488 nm) y filtros de detección de paso de banda de 610/20 nm para el PI y de 525/40
nm para el FITC y un láser rojo (638 nm) y un filtro de detección de paso de banda de
660/10 nm para el Alexa Fluor™ 647.
2. Establezca el caudal a un valor bajo para garantizar la exactitud.
3. Añada un gráfico con PI frente al tiempo para controlar la estabilidad del caudal. De
ser necesario, seleccione y elimine cualquier perturbación en el flujo para un análisis
posterior.
4. Añada un gráfico de puntos área de PI frente a altura de PI para seleccionar los
eventos de singlete. Los eventos de singlete se presentan en un patrón diagonal. Los
dobletes tendrán valores de anchura mayores, ya que tardan más en atravesar la línea
del láser.
5. Ajuste las ganancias en el canal de PI hasta que el MFI de pico de G1 sea de 2 x 106.
Esto garantizará que el pico del G2/M permanezca en escala y que haya una buena
resolución entre G2/M y los picos de G1.
6. Añada el tubo y registre la adquisición.
7. Cuando se hayan registrado todas las muestras, guarde los archivos FCS y ábrelos o
importalos al software de análisis.

● Reflexión de aprendizaje.
1. ¿Qué equipo se va a usar y qué fluoróforos?

El equipo utilizado será el Citómetro de flujo CytoFLEX equipado con un láser azul y rojo y
Software de análisis Kaluza versión 2.1 o superior (Beckman Coulter).
El principal fluorocromo utilizado en hongos es el “Blanco de Calcoflúor”. Es un
fluorocromo que cuando es excitado con longitud de onda baja emite una fluorescencia de
color azulada.

2. ¿Qué factores se consideraron para elegir el método?

El principal factor que nos llevó a elegir este método fue que permite la identificación de
marcadores, siendo uno de nuestros principales objetivos el identificar e inhibir marcadores
como CDKN2A/p16INK4A que inducen la detención del ciclo celular y su acumulación es
un marcador de senescencia.

3. ¿Cuál es el fundamento de la Citometría de flujo, cuáles son sus ventajas y

desventajas?

La citometría de flujo es una tecnología que permite analizar y cuantificar de manera

simultánea múltiples características celulares a medida que son transportadas en un fluido e
incidadas por un haz de luz. El citómetro de flujo mide el tamaño y la granularidad de la
célula, así como la fluorescencia relativa de la misma, también permite identificar,
caracterizar y separar poblaciones celulares. Gracias a ella se pueden conocer las proteínas
que se expresan (marcadores), haciendo posible la identificación de diferentes tipos celulares.
A medida que el citómetro posea más detectores, mayor será su capacidad para identificar
poblaciones celulares (Hoffman, 2008).

Otra de las ventajas es que se pueden eliminar las células muertas y los residuos, siendo
fundamental para eliminar los falsos positivos y obtener resultados de la más alta calidad.

Los resultados obtenidos pueden ser representados mediante diferentes estilos, desde una
gráfica de puntos hasta una figura tridimensional; reflejando los resultados con precisión y
sin generar confusiones.

4. ¿Cómo se fijan las células, es benéfico o hay sesgo?

Durante la fijación, todo el material potencialmente infeccioso se desactiva, la actividad

celular se detiene y se evitan procesos como la autolisis, la descomposición y la putrefacción.
Sin embargo, se conserva en la mayor medida posible la estructura y el estado de la muestra.
 ● Aportaciones:
1. Título: López Pintor Melissa.
2. Introducción: López Pintor Melissa.
3. Objetivo: López Pintor Melissa.
4. Método: Moreno Macías Arturo Josué.
5. Imágenes: López Pintor Melissa, Ana Karen Arias Romero.
6. Reflexión de aprendizaje: Arias Romero Ana Karen, Moreno Macías Arturo
Josué.
7. Referencias: Todos los integrantes.

● Referencias:

(2019). “What is galactomyces and why does skin love it?”. Style Story.
https://stylestory.com.au/what-is-galactomyces-and-why-does-skin-love-it/

Lee, M. et al. (2014). “The Effects of Essence-Formed Cosmetic Ingredients Containing the
Galactomyces Ferment Filtrate on Skin Improvements in Keratinization, Pores, Sebum
Excretion, Brightness and Acne”. Asian Journal of Beauty and Cosmetology. http://e-
ajbc.org/journal/view.php?number=697

Cooper, JKW. et al. (2019) “Galactomyces Ferment Filtrate Suppresses Reactive Oxygen
Species Generation and Promotes Cellular Redox Balance in Human Melanocytes via Nrf2-
ARE Pathway”. J Clin Cosmet Dermatol 3(1): dx.doi. org/10.16966/2576-2826.138

BARRERA-RAMÍREZ, LOURDES MARÍA, et al. (2004). CITOMETRÍA DE FLUJO:

VÍNCULO ENTRE LA INVESTIGACIÓN BÁSICA Y LA APLICACIÓN CLÍNICA.
Revista del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias, 17(1), 42-55.
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Pérez-Lara, J. et al. (2018). Fundamentos de Citometría de flujo: Su aplicación diagnóstica en

la investigación biomédica y clínica. Portafolio Científico.
https://www.medigraphic.com/pdfs/veracruzana/muv-2018/muv182d.pdf
Thermo Fisher Scientific Inc. (s. f.). BestProtocols: Cell Preparation for Flow Cytometry

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Hashimoto-Hachiya, A. et al. (2019). Antioxidants cinnamaldehyde and Galactomyces

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https://www.beckman.es/reagents/coulter-flow-cytometry/cell-health-research-assays/

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