GUÍA CROMATOGRAFÍA DE GASES – PERFIL DE ÁCIDOS GRASOS

MATERIALES

 Viales de 12 mL……………………………….2
 Pipetas Pasteur de vidrio………………….…..2
 Puntas de micropipeta (10-100 μL; 100-1000 μL)
 Filtros de sulfato de sodio anhidro……………1

EQUIPOS E INSTRUMENTACIÓN
 Balanza analítica.
 Vórtex.
 Baño termostatado.
 Micropipetas (10-100 μL; 100-1000 μL)
 Cromatógrafo de gases con detector de inducción de llama (GC-FID) con
automuestrador y autoinyector.

REACTIVOS Y SOLVENTES (grado cromatográfico)

 Hexano.
 Solución de metóxido de sodio 0,5 M en metanol.
 Solución saturada de NaCl.
 Agua ultrapura (grado cromatográfico).
 Mezcla de estándares de FAMEs a cuantificar.

PROCEDIMIENTO

Para la determinación del perfil de ácidos grasos de aceites o grasas es necesario llevar a
cabo la extracción del mismo. Este procedimiento debe ser seleccionado y validado de
acuerdo a la matriz que se esté estudiando ya que el tipo de extracción puede afectar
en gran medida el perfil de ácidos grasos, en particular en alimentos que contienen una
alta proporción de ácidos grasos poliinsaturados. La grasa o aceite extraído es sometido a
una serie de reacciones (derivatización) que permite obtener los ácidos grasos en forma de
ésteres metílicos, que son una forma estable de estas moléculas para ser inyectados al
cromatógrafo.

Aunque existen varias vías para la derivatización de las grasas el más común es la
transesterificación de los triglicéridos con metanol en presencia de in catalizador básico
(usualmente metóxido de sodio), en medio anhidro para evitar la hidrólisis (con la
consecuente obtención de ácidos grasos libres demasiado volátiles), lo cual permite el
intercambio entre el glicerol y el metanol, y la obtención rápida de los ésteres metílicos de
ácidos grasos (FAMEs, por sus siglas en inglés) que son formas aptas para el análisis
cromatográfico:

Derivatización de la grasa extraída

 1. Pesar aproximadamente 20 mg de la muestra de grasa en un vial de 12 mL (vial
1) (esta cantidad equivale aproximadamente a dos gotas de pipetas Pasteur de
vidrio). Debido al alto punto de fusión de algunas grasas (p.ej., grasa láctea), en
ocasiones es necesario fundir la muestra calentándola por uno o dos minutos a
máximo 50°C (con recipiente cerrado, bajo atmósfera de nitrógeno o gas noble).
Una vez tomada la muestra necesaria para la derivatización, conservar la
cantidad de muestra restante de grasa. Las muestras deben conservarse en
estado de congelación (-20 a -40 °C) en ambiente libre de oxígeno.

2. Adicionar 1,0 mL de hexano, homogeneizar y agregar 500 μL de solución de

metóxido de sodio 0,5 M en metanol y tapar bien el vial.

3. Homogeneizar durante 30 segundos a un minuto con ayuda del Vórtex.

4. Realizar la reacción de derivatización (45°C, 30 min) colocando el vial en un

baño termostatado. Nota: es importante conservar siempre las mismas
condiciones de reacción.

5. Detener la reacción mediante la adición de 4 mL de hexano y posteriormente de

4 mL de solución saturada de NaCl.

6. Homogeneizar durante 30 segundos o un minuto con la ayuda del Vórtex.

7. Retirar la fase orgánica (fase superior) con una pipeta Pasteur y hacerla pasar
por un filtro de sulfato de sodio anhidro con el fin de eliminar la humedad. Esta
fase se recupera en un nuevo vial de 12 mL (vial 2). Nota: No se debe haber
ningún residio de fase acuosa (fase inferior).

8. Agregar al vial inicial otros 5 mL de hexano y homogeneizar nuevamente durante

30 segundos o un minuto con la ayuda del Vórtex.

9. Repetir el paso No. 7 y conservar el vial 2 bien tapado, bajo congelación. En

momento se tiene una solución de 2 mg de grasa/mL (si se pesaron 20 mg en el
paso 1).

10. Tomar 250 μL de la muestra derivatizada obtenida en el vial 2 y agregar 750 μL

de hexano, si se va a utilizar un vial de 2 mL para el análisis cromatográfico. Si
se va a utilizar un inserto dentro del vial (que es lo más adecuado para
economizar viales y reactivos), tener en cuenta el volumen del inserto
(aproximadamente 200 μL), tomar 50 μL de la muestra derivatizada obtenida en
el vial 2 y agregar 150 μL de hexano.

11. Pasar las muestras para el análisis cromatográfico.

Condiciones de análisis cromatográfico

El análisis de los ésteres metílicos de los ácidos grasos de cada de las muestras
derivatizadas y diluidas se realizará utilizando cromatografía en fase gaseosa (GC),
para lo cual se usará un cromatógrafo de gases Agilent 7890ª (Agilent, USA),
equipado con un auto muestreador y autoinyector Agilent 7683B, un detector FID y
un software de captura de datos Chemstation versión B.04.01. La columna a utilizar
será una BPX-70 30m*0.25m*0.25μm (SGE, Australia).

El programa de temperatura comenzará a 60°C por 1 min, incrementando hasta

190°C a 20°C/min y se mantendrá a 190°C durante 12,5 min, para un tiempo total
de análisis de 43 min. El gas de arrastre será helio a un flujo de 2,0mL/min.

El volumen de inyección será de 1,0 µL y se utilizará un split de 1:20. La composición

cualitativa de ácidos grasos se determinará por comparación de los tiempos de
retención de los picos obtenidos con los de patrones de ésteres metílicos de ácidos
grasos (FAMEs) C4-C32 y de ALC; la cuantificación de los mismos se realizará por
el método de estándar interno con curvas de calibración construidas previamente
para cada uno de los ácidos grasos analizados.