Determinación de residuos farmacéuticos en

muestras biológicas mediante cromatografía

de gases acoplada a espectroscopia de masas
(GC-MS)

EMILIO JOSÉ JIMENEZ TORCATE

INTRODUCCIÓN
La industria farmacéutica es una de las industrias de más rápido crecimiento; en la Unión
Europea, por ejemplo, hay más de 3.000 productos farmacéuticos en el mercado (Touraud y
col., 2009). La presencia confirmada de más de 160 medicamentos diferentes en las aguas que
fluyen de las plantas de tratamiento de aguas residuales (Kummerer, 2009; FattaKassinos y
col., 2011) lo que significa que también pueden provocar cambios bioquímicos y fisiológicos en
el suelo así como en los organismos acuáticos y terrestres en contacto con las aguas
contaminadas (Ding y He, 2010). Actualmente en los EE.UU. y la UE existen directrices para la
realización en el medio ambiente de evaluaciones de riesgos (ERAS) de los compuestos
farmacéuticos (EMEA, 2006).

Los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAIDs) y los reguladores lipídicos son un

grupo de fármacos de diversa composición química y diferente potencial terapéutico que
tienen un mínimo de tres características comunes: propiedades farmacológicas básicas
idénticas, mecanismo básico de acción similar, así como efectos adversos similares. En este
trabajo se analizaron ácido clofíbrico (regulador lipídico), ibuprofeno, naproxen y diclofenac
(NSAIDs).

OBJETIVO

Determinar cuantitativa y cualitativamente fármacos antiinflamatorios no esteroideos

(NSAIDs) y reguladores lipídicos en organismos acuáticos, en este caso en tejido de trucha. Se
llevará a cabo la extracción de los analitos con una sonda de ultrasonidos provista de una
punta de titanio y posterior etapa de limpieza o clean-up con dSPE C18. Finalmente se
analizarán los extractos utilizando GC-MS.

APARATOS Y MATERIALES

−Sonda de ultrasonidos Vibra Cell de Sonics −Tubos eppendorf Viales de 2 y 5 mL

(Connecticut, USA).
−Vortex Genie-2 de Scientific Industries
(Nueva York, EEUU)
−Centrífuga 5415R de Eppendorf
(Hamburgo, Alemania
−Bomba de vacío N035AN.18 de KNF-
Neuberger (Nueva Jersey, EEUU).
−Equipo de corriente de N2, nitrógeno
técnico X50S Carburos Metálicos (Barcelona,
España).
−Detector de masas 5975C VL MSD
−Sistema GC 7890A
−Pipetas y jeringas Hamilton GC-MS 3
−Disolución de 1 ppm de Ibuprofeno (IBU, nº
CAS 15687-27-1)
−Ácido clofíbrico (CFB, nº CAS 882-09-7),
−Naproxeno (NP, nº CAS 22204-53-1)
−Diclofenaco sódico (DC, nº CAS 15307-79-6).
− Disolución de 1 ppm de triclosán (TCS, nº
CAS 3380-34-5)
− Acetona Multisolvent®
−Acetato de etilo (AcOEt) para HPLC
- N-terc-butildimetilsilil-N-
metiltrifluoroacetamida (MTBSTFA) + 1% de
tertbutilmetilclorosilano. − C18 ODS SPE
Sorbente.
 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

1. PESADA DE LA MUESTRA: (REALIZADO POR EL PROFESOR)

Se pesaron 100 mg de trucha en un eppendorf .

Luego se enriquecen con 30 µL de la disolución del patrón interno, triclosan (1 ppm). Y Se

añaden 500 µL del disolvente de extracción (acetato de etilo).

2. Extracción de los analitos de la muestra: Ultrasonidos

Las muestras y el blanco se sonicaron con la sonda de ultrasonidos focalizada durante 1

minuto, a una amplitud de 40% y sin pulsos. La punta de la sonda se introduce un tercio del
volumen de la disolución.

La sonda a través de la cavitación acústica rompe los tejidos, de manera que lo analitos quedan
libres en el medio.

3. Limpieza del extracto: Adsorbentes.

Se centrifuga la muestra y con una pipeta pasteur se extrajo el

disolvente (parte superior ocuosa) sin arrastrar nada del sólido
depositado, se transfirió a eppendorfs limpios. Al residuo sólido
que quedó se le añadió otros 500 µL de acetato de etilo, se
agitó otros 30 segundos en el vórtex y se centrifugó igualmente
recogiendo el sobrenadante en el mismo vial donde estaba el
extracto anterior con la intención de recuperar la mayor
cantidad de analito posible.
 Al extracto acuoso obtenido se le añadieron 100-150 mg de
C18 y se agitó durante 30 segundos en el vórtex. Luego se
centrifugó durante 5 min, 10 rcf y 15°C. Recogiéndose el
sobrenadante en una jeringa con filtro 0.22 µm pasandose a
un vial de 4 mL.

Durante este proceso el C18 actuó incorporándose a los

enlaces lipídicos haciéndose que en el proceso de
centrifugado estos se depositasen en el fondo del eppendorf
disminuyendo la posibilidad de que los lípidos se puedan
acumular en el instrumento de medida y en la columna, acortando la vida útil de estos y
reduciendo además la sensibilidad de los analitos debido a la supresión iónica.

4. Evaporación, reconstitución y derivatización

Los viales con la disolución se introducen en una caja a vacío para evaporar el disolvente con
nitrógeno o bien se llevan hasta sequedad con una corriente de N2. Una vez evaporado el
disolvente, se redisuelve en 80 µL de acetona (ya que el acetato de etilo no se puede pinchar
en el CG-MS debido a que no es volátil, en cambio la acetona sí lo es), se agitan el Vortex,
luego se transfieren un vial de gases provisto de un inserto. Finalmente se añaden 20 µL del
reactivo derivatizante (MTBSTFA) completando el volumen final de 100µL, cabe destacar que
en este proceso la pipeta Hamilton debe ser lavada entre muestra y muestra, por último se
deja en el horno a 70 °C durante 30 minutos (condiciones de derivatización) verificando que los
viales estén bien cerrados. La muestra se analizará mediante GC-MS.

Evaporación Acetona+Derivatizante Derivatización

5. Preparación de Calibrados: 0, 50, 100, 200, 300 y 400 ng/mL (ppbs)

A partir de una disolución patrón de 1ppm (µg/mL) de la mezcla de los 4 fármacos se preparó
de la siguiente manera:
Se colocaron en los viales de gases previstos de un inserto y se llevaron al igual que las
muestras al horno a 70 ºC durante 30 minutos.

MEDIDA INSTRUIMENTAL

Para la medición cromatográfica se utilizó un sistema GC 7890A, provisto con un inyector

automático 7683B Series Injector, acoplado a un detector de masas 5975C VL MSD manejado
con el software ChemStation de Agilent Technologies SA

Condiciones experimentales utilizadas:

Condiciones Cromatográficas (GC) Condiciones del MS

Columna: Capilar de polidimetilsiloxano ZB –
5 (30m x 0,25mm d.i. x 0,25mm espesor)
Temperatura horno: 85°C
Modo: Splitless
Volúmen de Mx: 100 µL
Temperatura del inyector: 290 °C
Gas portador: Helio Premier (99,999% de
pureza) X50S Carburos Metálicos (Barcelona,
España) a un flujo de 2,65 mL/min.
Rampa de Temperatura:
1. La temperatura del horno se mantiene a
85°C durante 1 min
2. Se aumenta hasta 120 °C a una velocidad
de 20°C/min
3. Se incrementa a 10 °C/min hasta alcanzar
200°C.
4. Se incrementa la temperatura a una
velocidad de 20°C/min desde 200°C hasta
280°C que se mantiene durante 3 min.

Tiempo por Cromatograma: 17,74 minutos