GUIA DE PRACTICA N° 07: BIOQUÍMICA Dr.

Marco Salazar Castillo

Departamento Química Biológica y Fisiología Animal – Universidad Nacional de Trujillo

CONSUMO DE GLUCOSA EN “ANAEROBIOSIS” POR Saccharomyces cerevisiae

INTRODUCCIÓN
Los organismos vivos necesitan producir energía indispensable para cumplir sus diferentes funciones
metabólicas. Esta energía la obtienen principalmente a partir del consumo de carbohidratos como la glucosa,
que es la molécula mayormente utilizada por los sistemas biológicos. En la glucolisis, la glucosa se degrada
parcialmente hasta piruvato y almacena parte de la energía bajo la forma de ATP. Dependiendo del
organismo, tejido que lo metaboliza y de la presencia o no oxígeno, el piruvato se convierte en alcohol o
lactato o ingresa a la mitocondria.

En condiciones anaerobias, algunos organismos, en particular las levaduras, producen etanol y CO2. En
cambio, los tejidos de los mamíferos solo producen ácido láctico en condiciones anóxicas. Algunos tejidos se
distinguen metabólicamente por el hecho de realizar una activísima glucólisis, incluso en presencia de
bastante oxígeno; entre estos tejidos tenemos el cerebro y las células cancerosas.

La reacción global neta de la glucolisis en anaerobiosis es:

Glucosa + 2 ADP + 2Pi 2 Lactato + 2ATP + 2H2O.
La presente experiencia práctica de laboratorio, tiene como objetvo demostrar el consumo de glucosa en
condiciones de anaerobiosis por Saccharomyces cerevisiae (levadura de pan o vino).

II. MATERIAL Y MÉTODOS1.

MATERIALES
Material Biológico:
• Saccharomyces cerevisiae “levadura de pan o del vino” (suspensión al 1%).

Materiales y equipos de laboratorio:

• Sistema de fermentación: Matraz de 50 mL de capacidad.
• Tapón de jebe atravesado por un tubo de vidrio, manguerilla y pinza.
• Bomba al vacío.
• Gradilla y tubos de 16 x 125 mm.
• Pipetas de 1, 2, 5 y de 10 mL.
• Embudos de vidrio y papel filtro Watman N°1.
• Cocina eléctrica y pocillo de 500 mL.
• Espectrofotómetro.

Reactivos y soluciones:
• Buffer de acetato 0.1 M pH 5.
• Glucosa 0.2 M.
• Ácido sulfúrico 2/3 N.
• Tungstato de sodio 10%.
• Solución cúprica alcalina.
• Solución fosfomolíbdica.
• Agua destilada.

MÉTODOS
SISTEMA DE INCUBACIÓN
En un matraz de 50 mL, adicionar:
Buffer acetato 0.1 M pH 5 …………………………………….……………………………………………..…… 12.0 mL
Glucosa 0.2 M en buffer acetato 0.1 M pH 4.6 ………………………………………………………..…… 1.8 mL
Suspensión de levadura 1% en buffer acetato …………………………………………………………..…. 1.5 mL
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1. TIEMPO CERO (0 MINUTOS)
Tomar una alícuota de 1 mL de la muestra y colocarla en un tubo que contiene 1 mL de H2SO4 2/3 N.
Mezclar y dejar en reposo como mínimo 2 minutos, mientras se procede con el siguiente paso.

2. TIEMPO 60 MINUTOS
Después de extraído la muestra “tiempo cero”, tapar el matraz herméticamente con tapón de jebe
y extraer el aire con bomba de vacío durante 3 a 5 minutos.
Incubar la suspensión a 37°C durante 60 minutos, desde el momento en que se toma la primera
muestra (tiempo cero).
Transcurridos los 60 minutos, tomar otra alícuota de 1mL y colocarla en un tubo que contiene 1 mL
de H2SO4 2/3 N. Mezclar y dejar en reposo como mínimo 2 minutos.

A las muestras de los pasos 1 y 2, adicionar 1 mL de Tungstato de sodio (Na2WO4) al 10%. Mezclar
vigorosamente, dejar en reposo por 2 minutos, agregar 7 mL de agua destilada, mezclar por inversión y
filtrar.

DETERMINACIÓN DEL AZÚCAR RESIDUAL

El azúcar residual se determinará de los filtrados del tiempo 0 y de 60 minutos respectivamente, utilizando
el siguiente sistema:

Sistemas (tubos)
COMPONENTES (mL)
B 1 2
Agua destilada 1,0 -- --
Filtrado tiempo 0 minutos -- 1,0 --
Filtrado tempo 60 minutos -- -- 1,0
Solución cúprico alcalina 1,0 1,0 1,0
Mezclar, colocar en baño de agua hirviendo por 8 minutos.
Enfriar con agua corriente
Solución fosfomolíbdica 1,0 1,0 1,0
Agua destilada 7,0 7,0 7,0
Mezclar y dejar en reposos por 10 minutos

Realizar las lecturas colorimétricas utilizando un espectrofotómetro a 420 nm.

RESULTADOS
CÁLCULOS
Corregir las lecturas de los tubos I y II restándoles la lectura del tubo B (Blanco),

Cuantificar la glucosa residual multiplicando las lecturas corregidas por el factor de calibración, y
expresándolos resultados en mg de glucosa/100 mL de suspensión de levadura. Factor de calibración = 800
mg de glucosa/100 mL de suspensión de levadura.

Interpretar los resultados

DISCUSIÓN

CONCLUSIONES

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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CONSUMO DE GLUCOSA EN AEROBIOSIS POR Saccharomyces cerevisiae

“EFECTO PASTEUR”
INTRODUCCIÓN
Un gran número de levaduras pueden metabolizar los azúcares en aerobiosis y en anaerobiosis. Al permitir
la respiración un mejor rendimiento celular, entonces, se consume menos azúcar en aerobiosis que en
anaerobiosis, o dicho de otro modo, la aerobiosis implica una disminución del consumo de azúcar y una
disminución de la fermentación. Esta inhibición de la fermentación por la respiración se llama “Efecto
Pasteur”.
Esta inhibición se explica por la competición entre el piruvato descarboxilasa (fermentación) que tiene una
baja afinidad por el piruvato (KM = 3 - 4 mM) y la piruvato deshidrogenasa (respiración) que tiene una gran
afinidad (KM = 0,1 – 0,2 mM). Así pues, únicamente cuando la cantidad de piruvato sobrepasa la capacidad
de la piruvato deshidrogenasa puede entonces acumularse para permitir el funcionamiento de la piruvato
descarboxilasa y, de este modo, hacer posible la fermentación. La disminución del consumo de glucosa en
aerobiosis puede explicarse, por una regulación a nivel de etapas de la glicólisis. La importancia del Efecto
Pasteur varía según las especies de levaduras; es tanto más marcado cuanto más importante es el
metabolismo respiratorio en las cepas. El Efecto Pasteur es más notorio en Candida tropicalis. En
Saccharomyces cerevisiae, el Efecto Pasteur bien está ausente, o bien tiene una amplitud muy débil. La
presente experiencia práctica de laboratorio, tiene como finalidad la demostración del efecto de la aireación
sobre el consumo de glucosa por Saccharomyces cerevisiae (levadura de pan o vino).
MATERIAL Y MÉTODO
MATERIALES
Material Biológico:
• Saccharomyces cerevisiae levadura de pan o del vino” (suspensión al 1 0% en agua destilada).
Materiales y equipos de laboratorio:
• Sistema de incubación: Matraz o tubo de ensayo de 50 mL de capacidad.
• Manguerilla delgada para salida y entrada de aire.
• Bomba de aire.
• Gradilla (01) y tubos de 16 x 125 mm (07).
• Pipetas de 1, 2 y de 10 mL (02 por cada una).
• Propipeta (01)
• Embudos de vidrio y papel filtro Watman N°1.
• Embudos de vidrio (02) y papel filtro cortado (02)
• Cocina eléctrica y pocillo.
• Espectrofotómetro. -

Reactivos y soluciones:
• Buffer de acetato 0.1 M pH 5.
• Glucosa 0.2 M en agua destilada.
• Ácido sulfúrico 2/3 N.
• Tungstato de sodio 10%.
• Solución cúprica alcalina.
• Solución fosfomolíbdica.
• Agua destilada

MÉTODO
SISTEMA DE INCUBACIÓN
1. En una matraz o tubo de ensayo de 50 mL, adicionar:

Buffer acetato 0.1 M pH 5 …………………………………….………………………………………… 12.0 mL

Glucosa 0.2 M en agua destilada……………………..……………………………………………… 1.8 mL
Levadura 10% …………………………………………………………………………………………………… 1.5 mL

Mezclar y, en el acto, tomar una alícuota de 1 mL y colocarla en un tubo que contiene 1 mL de H 2SO4
2/3 N. Mezclar y dejar en reposo como mínimo 2 minutos, mientras se procede con el siguiente paso.
Esta alícuota corresponde a la muestra tiempo cero (0 minutos).
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2. A través de una manguerilla fina, conectar el sistema de incubación a una bomba de aire para el
suministro de una franca y correspondiente aireación. Proceder a la incubación con aireación
constante, anotando el tiempo de incubación desde el momento en que se toma la primera muestra
(muestra tiempo cero).
3. A continuación, a la muestra del paso 2 (tiempo 0’), se le adiciona 1 mL de Tungstato de sodio al 10%.
Mezclar vigorosamente, dejar en reposo por 2 minutos, agregar 7 mL de agua destilada, mezclar
inversión y filtrar.
4. Luego de transcurrido 1 hora (tiempo 60’), tomar la segunda muestra y proceder, primero, como en
el paso 2 y, luego como en el paso 4.

DETERMINACIÓN DEL AZÚCAR RESIDUAL

El azúcar residual se determinará en los filtrados de los pasos 4 y 5, utilizando el siguiente sistema.

Sistemas (tubos)
COMPONENTES (mL)
B 1 2
Agua destilada 1,0 -- --
Filtrado tiempo 0 minutos -- 1,0 --
Filtrado tempo 60 minutos -- -- 1,0
Solución cúprico alcalina 1,0 1,0 1,0
Mezclar, colocar en baño de agua hirviendo por 8 minutos.
Enfriar con agua corriente
Solución fosfomolíbdica 1,0 1,0 1,0
Agua destilada 7,0 7,0 7,0
Mezclar y dejar en reposos por 10 minutos

Realizar las lecturas colorimétricas utilizando un espectrofotómetro a 420 nm.

RESULTADOS

CÁLCULOS
Corregir las lecturas de los tubos I y II restándoles la lectura del tubo B (Blanco).

Cuantificar la glucosa residual multiplicando las lecturas corregidas por el factor de calibración, y
expresándolos resultados en mg de glucosa/100 mL de suspensión de levadura. Factor de calibración = 800
mg de glucosa/100 mL de suspensión de levadura.

Interpretar los resultados

DISCUSIÓN

CONCLUSIONES

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS