INGENIERA DE BIOPROCESOS-BIOTECNOLOGA

INGENIERA DE ALIMENTOS INGENIERA QUMICA

IV PRCTICA DE LABORATORIO

CUANTIFICACIN DE LA PRODUCCIN DE BIOMASA Y DEL CONSUMO DE SUSTRATO

1. OBJETIVOS 1.1 General Reconocer diferentes protocolos para la cuantificacin de biomasa y consumo de sustrato (azucares reductores), tcnicas aplicables al seguimiento de un proceso de fermentacin. 1.2 Especficos Estandarizar el protocolo de determinacin de azcares reductores por el mtodo DNS Realizar una curva de calibracin de glucosa para determinar los azcares reductores Comparar dos mtodos diferentes para reportar el contenido de biomasa en una fermentacin

2. MARCO TERICO Las tcnicas ms utilizadas para determinar la concentracin microbiana en un cultivo lquido de microorganismos unicelulares son el recuento de clulas al microscopio o de colonias en cajas de Petri. Tambin es posible la determinacin de la masa celular mediante la determinacion de peso seco. Este ltimo es uno de los mtodos ms empleados, ya que permite expresar la concentracin celular en trminos de masa seca celular por unidad de volumen. Cuando se realiza una fermentacin se busca obtener un producto bien sea biomasa o algn metabolito especifico. El mtodo para determinar dicho metabolito, vara segn el producto. El consumo de sustrato se puede realizar por diversas tcnicas como por HPLC o por el mtodo de azucares reductores mediante el uso del cido dinitrosalicilico, si se trata de azucares reductores. Los azucares que poseen extremos carbonilos fcilmente oxidables (azcares reductores) reaccionan con el cido 3,5 dinitrosaliclico, produciendo el correspondiente cido derivado del azcar y cido 3,5 amino-nitrosalislico, de color naranja rojizo. La densidad ptica del color producido es directamente proporcional a la cantidad de azcares reductores en solucin. Para la determinacin de azcares reductores por este mtodo se sigue un protocolo establecido para la preparacin del reactivo y la posterior construccin de una curva de calibracin con una solucin patrn de glucosa con concentraciones diferentes conocidas.

INGENIERA DE BIOPROCESOS-BIOTECNOLOGA

INGENIERA DE ALIMENTOS INGENIERA QUMICA

3. MATERIALES Equipos

Espectrofotmetro Bao serolgico a 92 C con soporte para tubos de ensayo Incubadora a 30 C Vortex Balanza analtica Centrifuga

3.1 Determinacin azucares reductores 3.1.1 Mezclar: Para la preparacin del reactivo DNS Agua destilada cido 3,5 dinitrosalicilico NaOH 1416 mL 10,6 g 19,8 g

Luego adicionar y disolver: Sal Rochelle (tartrato de Na-K) Fenol (fundido a 50 C) Metabisulfito de sodio 306 g 7,6 mL 8,3 g

Titular 3 ml de muestra con fenolftalena y 0,1 N HCl. Debe tomar 5-6 ml de HCL. Aadir NaOH si se requiere (2 g=0,1 ml N HCl) 3.1.2 Reactivos adicionales

Glucosa analtica Agua destilada Materiales 1 baln aforado de 100 mL con tapa 10 tubos de ensayo con tapa rosca 2 pipetas de 1 ml 2 pipetas de 5 ml 2 pipetas de 10 ml Celdas desechables para espectrofotmetro 1 gradilla para tubos de ensayo 3 vasos de precipitado de 50 ml 2 vaso de precipitado de 100 ml 1 vaso de precipitado de 500 ml 1 pinza para tubos de ensayo 1 cronmetro 2

3.1.3

INGENIERA DE BIOPROCESOS-BIOTECNOLOGA

INGENIERA DE ALIMENTOS INGENIERA QUMICA

1 pipeteador 1 micro esptula o esptula 1 vidrio de reloj o papel para pesar Bao de agua-hielo en un recipiente

3.2 Determinacin de biomasa 3.2.1 Reactivos y medios 250 ml de cultivo puro de la levadura Saccharomyces cerevisiae en caldo Sabouraud (el cultivo debe colocarse a incubar lo ms tarde que sea posible el da anterior a la prctica) y repartirlo en un Erlenmeyer de 50 mL para cada uno de los grupos (6 Erlenmeyer con 40 mL) 500 ml de solucin isotnica (NaCl 0.9%)

3.2.2 Materiales 1 tubo de centrfuga 1 membrana de 0,22 m 1 filtro estril de plstico con manguera que sirva de acople a la bomba de vaco 1 caja de Petri estril 2 Cajas de Petri con medio (YPD) 1 rastrillo 1 Erlenmeyer de 125 o 150 mL con 90 ml de agua peptonada 0,1 % (p/v) estril 4 tubos de ensayo con 4,5 ml de agua peptonada al 0,1% (p/v) estriles 1 pipeta de 10 mL estril 4 pipetas de 1 ml estriles 1 Pipeteador

3.2.3 Equipos Incubadora a 30 C Bomba de vaco Cuenta colonias

3.3 Por parte del estudiante, traer alguna bebida azucarada (10 mL es suficiente como muestra problema), tener en cuenta que si es una bebida gaseosa no debe tener gas, y si es una bebida que contiene solidos suspendidos, estos debern retirarse previamente mediante un proceso de filtracin. 4. METODOLOGIA 4.1 Determinacin azucares reductores a. Con 10 min de anterioridad prender el espectrofotmetro y ajustar la longitud de onda a 540 nm

INGENIERA DE BIOPROCESOS-BIOTECNOLOGA

INGENIERA DE ALIMENTOS INGENIERA QUMICA

b. Preparar una dilucin patrn de glucosa 1 g/L en un baln aforado de 100 ml c. Preparar 6 tubos de ensayo con tapa, marcarlos y colocar en cada uno de ellos una concentracin diferente de la solucin patrn de glucosa, de acuerdo a los volmenes reportador en la Tabla 1, adicionar la cantidad indicada de agua para preparar la dilucin correspondiente (homogenizar) y posteriormente agregar 3 mL de DNS, en cada paso agitar vigorosamente (ayudarse del vortex)
Tabla 1. Diluciones para la curva de calibracin de azcares reductores No. tubo B 1 2 3 4 5 Volumen de solucin patrn glucosa (mL) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Volumen de agua destilada (mL) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

d. Tapar y llevar al bao serolgico para calentar durante 10 minutos (revisar previamente que el bao tenga la temperatura adecuada ~92 C y el nivel de agua necesario). Contabilizar el tiempo por cronmetro. NOTA. Tener precaucin en la manipulacin de los tubos de ensayos en el bao a ebullicin, contar con guantes de carnaza si es necesario, utilizar las pinzas para tubos de ensayo y no exponer el rostro en el momento que se abra la compuerta del bao serolgico. e. Transcurridos 10 minutos transferir inmediatamente a un bao de agua-hielo preparado con anticipacin, para detener la reaccin rpidamente, dejar reposar por 5 minutos f. Luego de que los tubos de ensayo se encuentran fros, adicionar a cada tubo 4 ml de agua destilada, agitar vigorosamente para homogenizar el color

g. Leer la absorbancia de cada tubo de ensayo en el espectrmetro a una longitud de onda de 540 nm transfiriendo las soluciones a las celdas del espectrofotmetro (desplazarse al laboratorio de Instrumental). Registrar el valor de la absorbancia. Calibrar el equipo con la solucin que se prepar como blanco h. Para determinar la concentracion de la muestra problema, se debe tomar en un tubo diferente 0,5 ml de la muestra + 4ml del DNS y seguir el protocolo descrito en los pasos d a g (se debe tener en cuenta la dilucion que debe realizarse a la muestra y registrar este valor)

INGENIERA DE BIOPROCESOS-BIOTECNOLOGA

INGENIERA DE ALIMENTOS INGENIERA QUMICA

4.2 Determinacin de biomasa 4.2.1 Por peso seco (parte I)

a. Tomar 10 mL de un cultivo inoculado previamente con levadura Saccharomyces cerevisiae, centrifugar a 4000 rpm durante 30 min, con el fin de separar del medio de cultivo la biomasa (precipitado), mientras centrifuga pese una de las tapas de la caja de Petri (mrquela previamente) y una membrana de 0,22 m (recuerde siempre manipularla con guantes y cogerla por los bordes) b. Una vez centrifugado, descartar el sobrenadante y re suspender la biomasa en solucin isotnica (NaCl 0.9%) en un volumen de 10 mL hasta obtener una suspensin concentrada de biomasa. c. Filtrar esta solucin a travs de una membrana de 0,22 m soportada en un filtro estril y con ayuda de una bomba de vaco como se ilustra en la figura 1

Figura 1. Filtracin al vaco para determinacin de biomasa por peso seco

d. Colocar la membrana con la biomasa filtrada sobre la caja de Petri previamente marcada y llevar a secar a un horno con una temperatura de 105 C hasta peso constante (recuerde enfriar en un desecador antes de registrar el peso) 4.2.2 Por conteo en placa, a travs del mtodo de extensin en placa (parte II)

a. Pipetear 10 ml del medio de cultivo puro, adicionar esta cantidad al Erlenmeyer que contiene 90 mL de agua peptonada 0,1 % (p/v) estril correspondiente a la dilucin 10-1, agitar. b. A partir de la dilucin anterior realizar diluciones seriadas 10-2, 10-3, 10-4, adicionando 0,5 mL de cada dilucin en los tubos de ensayo que contienen 4,5 mL de agua peptonada. c. Posteriormente sembrar en superficie 0,1 mL de las diluciones 10-3 y 10-4 en cajas de Petri con agar YPD (realizar duplicado) 5

INGENIERA DE BIOPROCESOS-BIOTECNOLOGA

INGENIERA DE ALIMENTOS INGENIERA QUMICA

d. Colocar a incubar las cajas de Petri sembradas a 30 C, el lunes a primera hora realizar el conteo, con ayuda del cuenta colonias 5. RESULTADOS Y DISCUSIN Graficar la ABS en funcin de la concentracin de glucosa (g/L), la cual ser la curva de calibracin para azucares reductores, determinar la concentracin de azucares reductores de la muestra problema Reportar el peso seco de la biomasa obtenida y el nmero de clulas viables/mL Explicar por qu se debe utilizar solucin isotnica para re suspender las clulas Realizar la discusin pertinente de sus resultados

6. BIBLIOGRAFA Madigan M., Martinko J., Parker J., Brock biologa de los microorganismos, 10a Edicin. Pearson Prentice Hall.