Determinación de

Formaldehído en Aguas por

HPLC-UV-VIS (EPA 8315A)

Jose Almario
 APLICACIÓN
Este método proporciona
procedimientos para la determinación
de compuestos de carbonilo libres en
diversas matrices por derivatización
con 2,4-dinitrofenilhidrazina
(DNPH). El método utiliza
cromatografía líquida de alta
resolución ALCANCE
(HPLC) con detección
ultravioleta para identificar y
El método EPAlos
cuantificar 8315A para la
analitos.
determinación de formaldehído es
aplicable para aguas superficiales y
residuales en el rango de 0,3-3,0 mg
CH 2 O /L . Para aguas con
concentraciones mayores debe
realizarse dilución previa de las
muestras.
INTERFERENCIA

● Las interferencias de los métodos pueden ser causadas por

solventes contaminados, reactivos, cristalería y otros equipos de
procesamiento de muestras que pueden generar artefactos
discretos y/o líneas de base de cromatogramas elevados. Todos
los materiales deben demostrar rutinariamente la ausencia de
interferencias en las condiciones de análisis mediante el análisis
de blancos de reactivos de laboratorio.

● La cristalería debe ser limpiada escrupulosamente. La

cristalería debe enjuagarse tan pronto como sea posible después
del uso con el último disolvente utilizado. Esto debe ser
seguido por un avado con detergente con agua caliente,
enjuagues con agua del grifo y agua reactiva sin reactivos
orgánicos. Después de lavar, la vajilla se debe drenar, secar y
calentar en un horno de laboratorio a 130 ° C durante dos o tres
horas antes de volver a usarla. Los enjuagues con disolvente
con acetonitrilo pueden sustituir al calentamiento del horno.
Después de secar y enfriar,
la cristalería debe almacenarse en un ambiente limpio para
evitar la acumulación de polvo u otros contaminantes.
● El uso de reactivos y disolventes de alta pureza ayuda a
minimizar la interferencia. Puede requerirse la
purificación de solventes por destilación en todos los
sistemas de vidrio.

● Deben usarse guantes de polietileno al manipular

cartuchos de gel de sílice para reducir la posibilidad de
contaminación.

● Las interferencias de la matriz pueden ser causadas por

contaminantes extraídos de la muestra. La extensión de
las interferencias de la matriz será específica de la fuente
y de la matriz. Si se producen interferencias en muestras
posteriores, puede ser necesario modificar la fase móvil o
realizar una limpieza adicional.
TOMA, PRESERVACIÓN Y
ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS

Tomar un mínimo de 500 mL de muestra en

envase plástico (polietileno o equivalente) o de
vidrio. Las muestras deben refrigerarse a 4°±2°C.
Las muestras acuosas deben derivarse y extraerse
dentro de los 3 días posteriores a la recolección de
la muestra. Los extractos de muestras derivadas
deben analizarse dentro de los 3 días posteriores a
la preparación. Pueden utilizarse muestras
compuestas o simples.
EQUIPOS Y MATERIALES
● Cromatógrafo Líquido de Alta Resolución
● Columna: 250 mm x 4,6mm de diámetro interno, tamaño de
partícula de 5 μm, C18 (zorbax o
equivalente)
● Detector de absorbancia – 360 nm
● pH metro
● Filtros de membrana de poliéster de 0.22 μm
● Embudo de separación de 250 mL , con llave de PTFE
● Aparato Kuderna-Danés (se puede emplear otros aparatos de
concentración si el laboratorio
puede demostrar un rendimiento equivalente)
● Balanza analítica con precisión de 0,0001 g
● Transfer-pipetas de 10-100 μL
● Transfer-pipetas 100-1000 μL
● Viales de 30 mL
● Balones volumétricos de 10 mL
● Beaker de 50 mL
REACTIVOS
● Agua reactiva libre de compuestos orgánicos: agua en la que no se observa un agente
interferente en el límite de detección del método para los compuestos de interés.
● Cloruro de metileno, grado HPLC o equivalente.
● Acetonitrilo, grado d HPLC o equivalente
● Soluciones de hidróxido de sodio, NaOH, 1.0 N y 5 N.
● Solución de sulfito de sodio, Na 2 SO 3 , 0.1 M.
● Sulfato de sodio (Na 2 SO 4 ) anhidro
● Ácido acético glacial
● Acetato de sodio
● Ácido clorhídrico, HCl, 0.1 N.
● Solución estándar de formaldehído de 1000 mg/L: Preparar a partir de formaldehído
comercial
al 37-38 %p/p una solución de 1000 mg/L de la siguiente manera: Medir 265 μL de la
solución
comercial y aforar a 100 mL con agua reactiva libre de compuestos orgánicos.
● Solución estándar de formaldehído de 100 mg/L: Adicionar 10 mL de la solución estándar de
formaldehído de 1000 mg/L en un matraz aforado de 100 mL y aforar con agua reactiva sin
compuestos orgánicos.

● Estandarización del estándar de formaldehído de 1000 mg/L: Transfiera 25 mL de una

solución de sulfito de sodio 0.1 M a un vaso de precipitados y registre el pH. Añadir una alícuota
de 25 mL de la solución de formaldehído y registrar el pH. Valorar esta mezcla de nuevo al pH
original utilizando HCl 0.1 N la concentración de formaldehído se calcula utilizando la siguiente
ecuación:
concentración de CH2O en mg/L = (30.03)(N,HCl)(mL de HCl) 0.0250 L de Formaldehido

Donde:
N, HCl: Normalidad del HCl utilizado
mL: Volumen gastado de HCl en mL
30,03: Masa molecular del formaldehido (mg/mmol)

● Tampón de acetato de pH 5.0 (5M): Medir 40 mL de ácido acético 5M, 60 mL de solución de

acetato de sodio 5M, mezclar bien y ajustar el pH con NaOH o HCl según sea necesario.

● 2,4-dinitrodenilhidrazina (DNPH): Preparar una solución de 3.0 mg/L disolviendo 428.7 mg

DNPH del 70% (p/p) en 100 mL de acetonitrilo.
Extracción líquido-líquido
● Tomar un volumen apropiado de muestra (nominalmente 100 mL) y añadir 4 mL de tampón de acetato, ajustar a pH 5.0 ±
0,1 con HCl 6 M o NaOH 6M. Añadir 6 ml de reactivo de DNPH, sellar el contenedor y llevar a calentar en un agitador orbital
a 40°C por una hora. Ajustar la agitación para producir una agitación suave de la solución de reacción.

● Extraer la mezcla en serie con tres porciones de 20 mL de diclorometano utilizando un embudo de separación de 250 mL. Si
se forma una emulsión tras la extracción, eliminar toda la emulsión centrifugando a 2000 rpm durante 10 minutos.

● Separar las capas y proceder con la siguiente extracción

● Combinar las capas de diclorometano en un matraz de 250 mL y llevar al rotavaporador hasta sequedad aproximadamente.
Adicionar aproximadamente 1.0 gramo de sulfato de sodio anhidro.

● Reconstituir con acetonitrilo y aforar a 10 mL en matraz, tomar 1 mL en vial y llevar al sistema cromatográfico para su
análisis.
Preparación de curva de calibración
CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS
CONTROL DE CALIDAD ANALÍTICO

Calibración inicial: establecer las condiciones cromatográficas para producir un tiempo de retención de 3.5±0.4 min, para la
curva de calibración procese cada estándar a través de la derivatización y extracción, utilizando el mismo procedimiento de la
muestra. Se recomienda que el coeficiente de correlación lineal sea ≥ 0,995. La concentración más baja debe ser en o por
debajo del Límite de cuantificación del método.

Verificación de calibración: Verificar la calibración analizando un estándar de concentración cerca

al punto medio del rango de calibración con cada lote de muestras para confirmar que el funcionamiento del instrumento no ha
cambiado significativamente desde la calibración inicial. El resultado debe estar dentro del error ≤ 15% de los valores del
factor de calibración inicial o puntos específicos de la curva de calibración. Si la verificación del factor de calibración está
fuera de control determine la causa del error y tome acciones correctivas.

Blanco de método (BM): Consiste de agua reactiva y todos los reactivos que normalmente están en contacto con la muestra
durante todo el procedimiento analítico. Incluir como mínimo un blanco de método con cada lote de muestras. Si los niveles de
contaminación son inaceptables, determine la causa del error y tome acciones correctivas.
Blanco Fortificado de Laboratorio (BFL): Es una muestra de agua reactiva a la que una concentración conocida del
mensurando de interés ha sido adicionada. Incluir como mínimo un BFL con cada lote de muestras. Procese el BFL a través de
todo el proceso de preparación de muestra y análisis. Evalúe el porcentaje de recuperación del mensurando adicionado
comparando con la carta de control. Si el resultado del BFL está fuera de control, determine la causa del error y tome acciones
correctivas.

Matriz Fortificada de Laboratorio (MFL)/ Duplicado de Matriz Fortificada de Laboratorio (DMFL): Es una porción
adicional de muestra real a la que una cantidad conocida del mensurando de interés es adicionada antes de la preparación de la
muestra. Incluir como mínimo un MFL/DMFL con cada lote de muestras. Calcular el porcentaje de recuperación el cual debe
estar entre 70-130% y la diferencia porcentual relativa, si los resultados están fuera de los límites de control, determine la causa
del error y tome acciones correctivas.

Verificación del Límite de Cuantificación del Método (LCM): Con cada lote de muestras, analizar una muestra de agua
reactiva enriquecida en LCM y verifique que cumpla el criterio de aceptación del LCM (generalmente ± 20%).