PRÁCTICA Nº 6

REACCIÓN DE TRANSAMINACIÓN EN HÍGADO

I. INTRODUCCIÓN

El organismo animal utiliza el nitrógeno proveniente de las proteínas ingeridas o de

la degradación de sus propias proteínas tisulares, en la síntesis de nuevos
aminoácidos y por ende de nuevas proteínas. Así mismo, muchos aminoácidos son
específicamente utilizados en la formación de sustancias fundamentales del
organismo: enzimas, hormonas, etc., y algunos de estos aminoácidos no necesitan
ser ingeridos con la alimentación, sino que pueden ser sintetizados a partir de otras
sustancias.

En el metabolismo general de los aminoácidos se conocen dos mecanismos para la

utilización del nitrógeno de un aminoácido en la formación de otros aminoácidos.
Uno de ellos conocido como “Proceso de desaminación” incluye la separación del
grupo amino de la cadena carbonada, por enzimas específicas, bajo la forma e NH 3
que sería utilizado por otras sustancias para la formación de nuevas proteínas y sus
productos de excreción.

El segundo mecanismo es también desencadenado por enzimas específicas, que

conducen a la transaminación, reacción que consiste en la transferencia de un
grupo amino de un aminoácido hacia un cetoácido con formación de un nuevo
cetoácido, en esta reacción participan las enzimas denominadas transaminasas, que
requieren como cofactor al fosfato de piridoxal.

Las transaminasas más activas en tejido de mamíferos son la glutámico oxalacética

que produce alfa cetoglutarato y alanina.

En las células existen muchos tipos de transaminasas que utilizan el α-cetoglutarato

como aceptor del grupo amino, pero se diferencian entre ellas por la especificidad
respecto al aminoácido utilizado. Las reacciones catalizadas por tales enzimas son
fácilmente reversibles.

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 Reacción de transaminación

Aminoácido(1) + α-cetoácido (1) <==> α-cetoácido (2) + aminoácido

(2)

Todas las transaminasas utilizan el mismo grupo prostético, el piridoxal fosfato

(una forma coenzimática de la vitamina B6), que es transportador temporal del
grupo amino. El piridoxal fosfato se enlaza covalentemente con el grupo amino ε de
un residuo de lisina, en ausencia de sustrato (el aminoácido). Cuando llega el
aminoácido, su grupo amino α es sustituido por el grupo amino ε de la lisina. La
nueva base de Schiff, que se ha creado, queda soldada al sitio activo de la enzima
mediante la formación de uniones múltiples no covalentes. La enzima pierde un
protón del carbono α, formando un intermediario quinonoide, cuya reprotonación
determina la producción de una cenitina que presenta una doble unión entre el
carbono α y el nitrógeno del sustrato enlazado. Una reacción sucesiva de hidrólisis
determina la separación de un α-cetoácido y la formación de piridoxamina fosfato.

II. OBJETIVOS

a. Reconocer los procesos de transaminación y desaminación oxidativa.

b. Evaluar la actividad de la enzima transaminasa glutámica pirúvica (GPT) o
alanina aminotransferasa (ALT) obtenida de hígado.
c. Determinar la actividad enzimática de la L- aminoácido oxidasa de hígado de
res.

III. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS

Materiales y equipos

 Hielo picado
 Centrífuga refrigerada
 Baño termostatizado a 37°C
 Espectrofotómetro
 Micropipeta

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  Pipetas
 Tubos de prueba

Reactivos
 Extracto enzimático de hígado
 Solución de KCl 0.154 M
 Solución de Buffer fosfato 0.2 M pH 7,4
 Cetoglutárico 0,2 M: 2,92 g de ácido alfa glutárico diluir con NaOH ajustando a
pH 7,4 y diluir con agua destilada a 100 mL.
 L-Alanina 0,2 M: 1,78 g de L- Alanina disolver con agua destilada para 100
mL.
 Alanina 0,01 M (como estándar)
 Ácido pirúvico 0,2 M: 2,2 g de piruvato de sodio, disolver con agua destilada,
completar a 100 mL.
 Ácido glutámico 0,2 M: Tomar 2,94 g de ácido glutámico disolver en caliente
con agua, ajustar a pH 7,4 con NaOH. Completar a 100 mL con agua destilada.
 Glutamato de sodio 0.01 M (como estándar)
 Amortiguador fosfato (0.1 M, pH 7.4)
 Arsenito de sodio 0,1M: Pesar 1,29 g de arsenito de sodio y disolver con agua
destilada para un volumen de 100 mL.
 ATC 10 %
 2-4 dinitrofenilhidrazina al 0.1 %
 Solución NaOH 2N
 Homogenizado del hígado al 20% en buffer pH 7,4
 Alcohol etílico
 Metanol
 Cloroformo
 Amoníaco al 17%
 Mezcla 1-butanol, NH4OH, etanol (70:20:10) como solvente para
cromatografía de cetoácidos
 Ninhidrina al 0,2% en etanol
Actividades:
1. Preparación de soluciones
De las soluciones que se describen previamente, hacer los cálculos correspondientes
(chequear los mismos con el docente) y preparar las soluciones a usar.

2. Preparación de homogeneizado/ homogenato de hígado.

Preparación de con el hígado.
1.- Opción 1: Sacrificar la rata y extraer el hígado, prepara un homogenizado con buffer
fosfato 0.2 M, pH 7. Adecuado.
2.- Opción 2: En condiciones adecuadas traer Hígado de res ( 20 G)
a. En vaso de Bohemia apoyado en hielo cortar el hígado en trozos grandes empleando
tijeras quirúrgicas y enjuagar varias veces con KCl para remover los restos de sangre.
b. Cortar el hígado en cubos pequeños (aprox 2 mm).
c. Transferir el tejido cortado al tubo del homogeinizador en aproximadamente 5
volúmenes de buffer fosfato/volumen de tejido y homogeneizar.
d. Centrifuguar a 2500 rpm durante tres minutos a 4º C o filtrar a través de una gasa
doble.

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 e. Guardar el sobrenadante en un tubo sumergido en baño de hielo y rotulado como
extracto de hígado (EH).
f. Pasar la mitad del extracto a otro tubo rotulado como extracto de hígado
calentado (EHC) y colocar en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos.

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Experimento N°1: Reacción de Transaminación

Fundamento.- La transaminasa glutámico pirúvica (GPT) cataliza la transferencia

del grupo amino del ácido glutámico al ácido pirúvico, dando lugar a la formación
del ácido cetoglutárico y del aminoácido alanina.

Demostración de la transaminación
Proceder como se indica en los siguientes cuadros:

Desarrollo de actividad transaminasa para la cromatografía de aminoácidos

a. Preparar dos tubos rotulados 1 y 2, de la siguiente forma:
Cuadro 1
Volumen (µL)
Reactivos 1 2
Arsenito de sodio 0,1 M 200 200
Piruvato de sodio 0,2 M 150 150
Glutamato de sodio 0,2 M 150 150
Extracto de hígado (EH) 500
Extracto de hígado calentado (EHC) ----- 500
Volumen final de reacción = 1000 µL
b. Incubar los tubos a 37º C durante 30 MINUTOS para que
transcurra la reacción.
c. Luego agregar 4 mL de etanol a cada tubo para detener la
reacción.
d. Centrifuguar a 2500 rpm durante 3 minutos a temperatura ambiente.
e. Conservar el sobrenadante para la identificación cromatográfica de los
productos.
4. Cromatografía de aminoácidos
a. Cortar un rectángulo de 5 x 10 cm de cromatofolio
b. Sembrar en el extremo inferior el sobrenadante de los tubos 1 y 2 y los
patrones de ácido glutámico (0.01 M) y alanina (0.01 M), identificándolas con
un lápiz de grafo en el borde inferior del papel.
c. Colocar el papel sembrado en la cámara cromatográfica conteniendo la fase
móvil (Fenol- agua (80:20)) y dejar correr el frente hasta una altura de 5 cm
como mínimo.
d. Extraer y secar la cromatoplaca al aire.
e. Para el revelado rociar el papel con ninhidrina* en la campana de gases y
colocar en estufa hasta la aparición de las manchas.

a. Preparar dos tubos rotulados 1 y 2, de la siguiente forma:

Cuadro 2

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 Reactivos 1 2

α- Cetoglutarato 0,2 M 0,6 mL -

Alanina 0,2 M 0,6mL -

Piruvato 0,2 M - 0,6mL

Glutamato 0,2 M - 0,6mL

Arsenito 0,1 M 0,4mL 0,4mL

Homogenizado 1 ml 1mL

Incubar a 37 ºC por 20 minutos.

Transcurrido el tiempo, retirar el tubo del baño maría, agregar 6 mL de alcohol etílico,
agitar y dejar en reposo por dos minutos. Luego centrifugar por 10 minutos. Usar el
sobrenadante para la cromatografía. Utilizar como solución reveladora ninhidrina 0,2%.
Sistema de Solventes:
Cloroformo: Metanol: Amoniaco al 25% (40:40:20)
n-butanol saturado con amoniaco al 3%

Experimento 2: Demostración de la acción de la L- amino ácido oxidasa

Proceder según lo indicado en el siguiente cuadro:
Componentes 1 2 3
Buffer Fosfato pH 7.4 (ml) 1 1 1
Solución de L-alanina 0.2 M(ml) 0,5 0,5 -------
Agua destilada (ml) -------- 1,0 0,5
Homogenizado de hígado (ml) 1,0 ----- 1,0

Mezclar cada uno de los tubos, e incubar durante 20 minutos a 37 ºC.

Inmediatamente cumplido este tiempo agregar a cada uno de los tubos 2,5 ml de
ATC al 10%. Filtrar y tomar en otros tubos marcados previamente, 4 ml. de cada
filtrado, proceder de la siguiente manera:

Componentes 1 2 3
Filtrado 2 2 2
Sol. 2-4 DNFH 0.1% 0.5 0.5 0.5

Mezclar y dejar en reposos por 20 min

Sol. NAOH 2 N 2 2 2
Reposar por 10 min y leer al espectrofotómetro 505 nm.

V. RESULTADOS

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Cálculos:

Discusiones

Conclusiones

Bibliografía.

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VI. CUESTIONARIO

a. ¿Cuál es la función del arsenito en la reacción de transaminación?

b. ¿Por qué la detección de las transaminasas es importante en la diagnóstico

de enfermedades?

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 c. Se realiza un ensayo sobre transaminación
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3
Pirúvico de sodio 0.1 M 0.5 ml Oxalacetato 0.1 M 0.5 ml Aspartato 0.1 M 0.5 ml
Glutamato 0.1 M 0.5 ml Alanina 0.1 M 0.5 ml Alfacetoglutarato 0.1 M 0.5 ml
Homogenizado 0.5 ml Homogenizado 0.5 ml Homogenizado 1.5 ml
Buffer 1.5 ml Buffer 1.5 ml Buffer 1.5 ml
Productos: Productos: Productos:

Complete la tabla con el nombre de los productos formados en cada tubo. ¿Los
resultados se podrían revelar con ninhidrina?

d. ¿Cuál es la coenzima de las transaminasas?

e. Calcule las concentraciones finales de los sustratos en la mezcla de reacción

f. El homogenizado de hígado se preparó empleando 9 volúmenes de buffer

fosfato 50 mM pH 7.0 por cada gramo de hígado. ¿Cuántos mililitros de buffer
se emplearon si se preparó homogenizado con 25 g de tejido?

g. ¿Durante la preparación del homogenizado es necesario mantener la cadena de

frio, por qué?

h. Si el piruvato de sodio tiene una masa molar de 110 g. Calcule los gramos
necesarios para preparar 50 ml de una solución 0.5 M

i. Si la reacción necesita 20 mM de piruvato de sodio, cuantos mililitros de una

solución 0.5 M serán necesarios para un volumen de reacción final de 3 ml.

j. Que sucedería si un alumno por error coloca en el tubo 1: 0.5 ml de piruvato 0.1
M con 1 ml de glutamato 0.1 M y los demás reactivos en el volumen correcto.
¿Cómo se afectarían los resultados?

k. En un ensayo de cromatografía en capa fina, se obtienen los sgtes. resultados.

Distancia recorrida: Alanina 4.0 cm, Glutamato 3.5 cm, solvente 6.0 cm.
Calcule los Rf de cada uno. ¿Para qué se utiliza este valor?

l. Esquema de la practica.

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