METODOLOGIA

Título: Sustancias bioactivas procedentes de la especies Elaeis guineensis, Elaeis oleifera e hibrido
de palma OXG como base para alimentos funcionales

1. Análisis centesimal

Humedad, Se coloca la muestra en estufa de aire circulante a 60 ºC por 8 horas hasta peso constante.
-Grasas. Se utiliza un aparato de Soxhlet, por extracción, usando solvente hexano, según Sotero y
García (2009).
-Proteínas. Sera determinado utilizando el proceso de Biuret (Fentes et al., 2012)
-Cenizas (minerales) La muestra será desgrasada y sometida a incineración en mufla a la
temperatura aproximada de 550°C, según Sotero y García (2009)

2. Análisis de ácidos grasos (López et al., 2009)

La muestra de aceite se esterifica (o derivatiza) con una solución de ácido sulfúrico concentrado en
metanol al 2%, posteriormente se extrae con hexano los metilesteres de ácidos grasos, se centrifuga
y se concentra por evaporación. Este producto se inyecta en el GC-MS. Caso no se cuente en la
librería con los esteros metílicos, estos se incorporan mediante los estándares respectivos, para el
análisis comparativo posterior.

Espectrometría de masas
Las condiciones para el análisis por CG-MS son: columna Rtx-CLpesticides Restek (30 m, 0,25 mm de
espesor) o similar. La temperatura inicial del horno de 100 ° C/02 min, seguida de una rampa de 7°
C/ min hasta 300 ° C/5 min; la temperatura máxima del horno de 300°C. Se usa una inyección
dividida, flujo de gas helio de 37.2 cm/s. Los fragmentos para los análisis se registran con los
parámetros para un escaneo de 30 a 500 m/ z

3. Análisis de esteroles vegetales (Jeong y Lachance, 2012)

Las muestras deben ser saponificadas, para lo cual se toma diez g de muestra homogeneizada, se
saponifica directamente en un matraz de fondo redondo que contiene 25 mL KOH al 50% y 100 ml
de Etanol al 95%. La mezcla se calienta a reflujo durante 1 hora con agitación moderada, utilizando
una manta calefactora y un agitador magnético. Después de 1 hora, la mezcla se enfría a
temperatura ambiente y se transfiere a un embudo de decantación con la ayuda de 30 mL de Etanol
al 95%, 50 mL de agua tibia y 50 mL de agua fría. Los insaponificables se extraen 6 veces con
porciones de 150 ml de éter de petróleo. Los extractos etéreos se lavaron con agua destilada hasta
que quede sin jabón y evaporado hasta sequedad mediante un evaporador rotatorio y bajo gas
nitrógeno, a 40° C. Se registró el peso del concentrado como insaponificables totales.

Preparación de derivados de TMS (trimetil sililesteres)

Los insaponificables se disuelven con cloruro de metileno y 100 µL de la solución, con una
concentración conocida, se coloca en un tubo de ensayo tapado. Se adiciona 200 µL del Reactivo de
éter de trimetilsilil (TMS), luego el tubo de ensayo se calienta a 60°C durante 20 min en un plancha
de calentamiento después de tapar herméticamente. El reactivo se eliminó bajo una corriente de

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gas de nitrógeno, luego se disuelve en 250 µL de cloruro de metileno y se almacena en un congelador
para análisis GC-MS
Espectrometría de masas
Se analizaran los derivados de TMS de los insaponificables por GC / MS utilizando equipado con una
columna DB-17 columna de (30 m x 0,25 mm de d.i. La temperatura de la columna se programa
desde 150 °C a 260 °C a 6 C / min, luego a 300 °C a 2.5 °C / min y mantenido durante 7 min. Flujo
del gas helio 1mL/min. El puerto de inyección Split/splitless, la línea de transferencia y las
temperaturas del colector debe ser de 260°C, 280°C y 220°C, respectivamente. . Los fragmentos
para los análisis se registran con los parámetros para un escaneo de100 a 500 m/ z

4. Análisis de Aminoacidos (Persson y Torgny 2001)

Derivatización de aminoácidos

Las soluciones de aminoácidos se evaporan a sequedad y luego son re disueltos en 40 µl de N, N-

dimetilformamida (DMF). Los aminoácidos disueltos se derivatizan a su ter-butildimetilsililo (tBDMS)
derivados utilizando 10 µl N-metil-N-ter-butildimetilsilil-trifluoroacetamida (MTBSTFA) como
agente de derivatización. A continuación, los viales se calientan a 70 ° C durante 25 min y se deja
enfriar a temperatura ambiente antes del análisis. Todos los pasos de derivatización se realizan bajo
un corriente de gas argón seco. Los derivados de aminoácidos resultantes posteriormente fueron
analizados por GC-MS. Estándares internos (ácido -aminoisobutírico e hidroxi-L-prolina) se añaden
a las muestras antes de la evaporación., como testigo.

Análisis y cuantificación de aminoácidos

Espectrometría de masas

El análisis por GC-MS se realiza utilizando un cromatógrafo de gases conectado a un espectro de

masa de trampa de iones. La separación de los aminoácidos se realiza en un GC con una columna
capilar tipo Chrompack CP-Sil 5 de 30 m x0.25 mm de d.i. Las muestras se introducen mediante
inyección dividida utilizando Inyector ajustado a 270 ° C. Los ajustes divididos generalmente varían
entre 30: 1 y 50: 1, dependiendo de las concentraciones de aminoácidos. El gradiente de
temperatura del horno de GC se programa a 130 °C inicial, durante 2 min seguido de una rampa en
30 ° C min − 1 hasta 290 ° C, mantener así durante otros 6 min. La interfaz GC-MS se mantiene a una
temperatura de 270 ° C y la trampa de iones a 250°C.

Los espectros de masas se recopilan mediante el impacto de electrones (EI) ionización a 70 eV. El
modo de fuente de iones (SIS) seleccionada se utiliza atrapando un rango individual de iones para
cada amino ácido analizado.

5. Análisis de carbohidratos (azucares) (Kok et al., 2007)

El análisis de carbohidratos se extrae con metanol (80:20, v/v) y luego se diluye a un volumen de 10
mL. El extracto se limpia con un cartucho C18 antes de la inyección. Se utiliza HPLC para separar y
cuantificar fructosa, glucosa, sacarosa y maltosa en muestra de palmiste. Una columna de análisis
de carbohidratos Zorbax (150 4,6 mm, 5 µm) se utilizó para la determinación cromatográfica. La

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fase móvil fue acetonitrilo/agua (75:25). La separación se realiza por elución isocrática con un caudal
de 1,4 ml/min. Los azúcares fueron detectados por el detector de índice de refracción. Los
resultados fueron expresados como mg / g de peso seco

6. Análisis de carotenos (Sotero y Garcia,2008)

Se pesa 20 g de la muestra de aceite en un balón de base plana, se coloca un magneto y se adiciona

70 mL de etanol absoluto. Se coloca los tubos de reflujo y se calienta la mezcla hasta ebullición con
corriente de nitrógeno. Luego, se adiciona 20 mL de solución de KOH al 50% y se saponifica la mezcla
por 30 minutos con agitación moderada. Antes de finalizar esta etapa se enjuaga el contenido con
50 mL de agua en 3 porciones. La solución se enfría a temperatura ambiente y luego se filtra al vacío.
Se coloca inmediatamente el contenido en una pera de separación de 250 mL y se adiciona 50 mL
de hexano p.a. para proceder a la extracción. Se agita la mezcla por 20 segundos y al separarse las
fases se coloca la capa superior (fase orgánica) en un balón de 250 mL de base redonda que debe
contener aproximadamente 0,5 g de BHT ó ácido ascórbico. Se efectúa dos veces más la ex tracción
y se juntan los extractos en el balón de 250 mL; se evapora el solvente hasta sequedad, haciendo
uso del rotavapor con baño de agua a 40 ºC, el residuo se diluye inmediatamente con metanol grado
HPLC, y se lleva a un volumen de 10 mL en una fiola. Finalmente se pasa la solución final por un filtro
de 0,2μm, llenándolos en frascos ámbar de 2 mL para colocarlos en el inyector del cromatógrafo. Se
utiliza columna C18 de fase reversa.

7. Evaluación de la actividad antioxidante (García et al., 2019)

Se toma 150 g de muestras vegetal en estudio, se realizan extractos metanólicos a diferentes

concentraciones; una parte se utilizara para la evaluación antioxidante. Para la evaluación de la
actividad antioxidante, se preparan extractos metanólicos de 5g/100ml y su evaluación, se realizara
utilizando un reactivo que provea radicales libres como es el 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH). La
capacidad antioxidante de las muestras es observada a 516 ηm por el cambio de coloración gradual
del DPPH (púrpura) a DPPH-reducido (amarillo).Se prepara una solución metanólica de DPPH a una
concentración 0.1 mM. Los extractos (1 mL) metanólicos secos, se diluyen nuevamente con metanol
para obtener las concentraciones de 0.2, 0.15, 0.1, 0.05 mg/mL. A cada concentración de los
extractos y de las fracciones se les adiciono 3 mL de la solución de DPPH (0.1 mM) y se les mezcla
separadamente. Las mezclas se dejan a temperatura ambiente y oscuridad durante 30 min y
después se les mide su absorbancia a 516 ηm en un espectrofotómetro UV/vis. La actividad
antioxidante de las muestras se determina mediante el cálculo de la concentración inhibitoria media
(IC50), que es la concentración requerida por la muestra para disminuir la absorbancia del DPPH a 50
%. La baja absorbancia de la mezcla de reacción indico alta actividad antioxidante.

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 8. Análisis de fenólicos (García et al., 2019).

a) Determinación de compuestos fenólicos totales: Se realiza la medida del índice de Folin, para lo
cual se tratan 40 μl de muestra con 0,5 ml de reactivo de Folin- Ciocalteau y 2 ml de carbonato
sódico al 20% (p/v), y se llevan a 10 ml. Transcurrida media hora, se efectúa la lectura de absorbancia
a 765 ηm. Para establecer el calibrado, se utilizan patrones de ácido gálico de concentraciones entre
0 - 1.000 mg/l.

c) Antocianinas y flavonoides totales: La determinación de antocianinas y flavonoides totales se

realiza mediante espectrofotometría UV / Vis en 1mL del extracto preparado para los compuestos
fenólicos leyendo la absorbancia a 535 ηm y 374 ηm respectivamente, después de diluir las
muestras. Para realizar los cálculos se utiliza el coeficiente de extinción molar de malvidin-3-
glucósido: 29500 L / mol cm.

d) Catequina y proantocianidinas: se realiza mediante la prueba de vainillina. Se mezclan 0,5 ml del

extracto con 1,25 ml de vainillina en metanol al 1% (p / v) y con 1,25 ml de ácido sulfúrico al 25%
(v/v) en metanol. El blanco se prepara simultáneamente de la misma forma, pero sustituyendo la
solución de vainillina por metanol. Se deja reposar durante 15 minutos y luego se realiza la lectura
de absorbancia a 510 ηm.

9. Análisis de alcaloides (Shamsa et al., 2008)

Los materiales vegetales (100 g) se molieron y después se extrajo con metanol durante 24 h en una
extracción continua (soxhlet) aparato. El extracto se filtra y se evapora el metanol en un evaporador
rotatorio al vacío a una temperatura de 45 ºC a sequedad. Una parte de este residuo se disuelve en
HCl 2 N y después se filtra. Un ml de esta solución se transfiere a un embudo de separación y se lava
con 10 ml de cloroformo (3 veces). El pH de esta solución se ajusta a neutro con 0,1 N NaOH. A
continuación se añadieron 5 ml de solución de verde bromocresol (BCG) y 5 ml de tampón fosfato
a esta solución. La mezcla se agita y el complejo formado se extrae con 1, 2, 3, y 4 ml de cloroformo
por agitación vigorosa. Los extractos se recogen en un matraz aforado de 10 ml y se diluyen a
volumen con cloroformo La absorbancia del complejo en cloroformo se midió a 470 ηm. Se utiliza
como estándar atropina.

10. Análisis de saponinas (Guzman et al., 2013)

Se realizará mediante la espectrofotometría UV/vis. Para esta determinación se hace uso de la

adición del reactivo de Lieberman-Burchard (LB) para formar productos coloridos al reaccionar con
saponinas. El reactivo LB consiste en una mezcla al 16,7 % de Anhídrido acético en Ácido sulfúrico
concentrado. Inicialmente se elabora una curva de calibración Absorbancia vs. Concentración
utilizando un estándar adecuado. (generalmente de quinua).Para esta curva se prepararan
soluciones a las siguientes concentraciones: 0,00; 0,05; 0,1; 0,15; 0,20; 0,25; 0,30; 0,35 mg/ml, de
cada concentración se prepararon 2 ml, a los cuales se adicionaron 7 ml del reactivo de LB, se agito
20 s con un agitador tipo vortex y se dejó en reposo 30 min. Se determina la absorbancia de las
muestras a 528 ηm. A partir de la curva de calibración se puede cuantificar el porcentaje de
saponinas presentes en cada muestra evaluada.

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 11. Análisis de las moléculas de metabolitos secundario con alta actividad antioxidante
(García et al., 2019).

Se realizará el fraccionamiento cromatográfico de los extractos metanólicos secos en columna

cromatográfica abierta, utilizando como fase móvil metanol y fase estacionaria silica gel Nº 100 de
las especies con alta actividad antioxidante e identificación de las moléculas, mediante las técnicas
cromatografías que comprende en el siguiente orden: capa fina y agrupamiento de las fracciones
con moléculas semejantes, y nuevamente realizar la evaluaciones la actividad antioxidante de estas
fracciones, las que presenten alta actividad serán sometidas a cromatografía de gases acoplada a
espectrometría de masa, para su cuantificación e identificación.

Espectrometría de masas

Las condiciones para el análisis por CG-MS son: columna capilar Agilent 122-5532 DB 5MS de 30 m,
con un diámetro interno de 0,25 mm, o similar. La temperatura inicial del horno de 100 ° C / 03 min,
seguida de una rampa de 20 ° C/3 min hasta 300 ° C/19 min; la temperatura máxima del horno de
325 °C. Se usa una inyección dividida, flujo de gas helio de 2 ml/min. Los fragmentos para los análisis
se registran con los parámetros para un escaneo de 50 a 500 m/z

12. Análisis estadístico

Los análisis de las dos especies y el hibrido OXG, se realizaran por triplicado y estos datos sometidos
a análisis de varianza ANOVA. Se analizaron utilizando el software Statgraphics Centurion.
Diferencias significativas entre las medias se calcularon mediante la prueba F a p <0,05. En caso haya
semejanza en las medias, se aplicara el método de Tukey.

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