Docente: Lorena Guadalupe Fuentes Cardona

Equipo 8:
1.- Sánchez Meléndez Víctor Manuel
2.- Mejía Arellano Jose Luis
3.- García Anaya Marcos Alejandro
4.- Fabian Toledo Nizareli
5.-Mirón Sánchez Claudia Lizbeth
6.- Lozada López Nicte Ha
1. Recepción de la muestra y orden médica correspondiente.
2. Verificar la información y evaluar la muestra.
3. Conservar la muestra a 4 °C, por un tiempo máximo de 48 h.

1. Rotular un tubo de 1.5 mL con el código de la muestra y añadir

200 μL de la sangre periférica o médula ósea
2. Añadir 20 μL de solución de proteinasa K a los 200 μL, mezclar
por vórtex por 10 seg
3. Agregar 400 μL de solución de lisis, mezclar bien agitando en
vórtex para que sea uniforme.
4. Incubar la muestra a 56 °C durante 30 minutos en el
termobloque, homogenizando en el vórtex cada 15 minutos.
5. Agregar 200 μL de etanol (96-100%) y mezclar por pipeteo.
6. Transferir la mezcla preparada a la columna spin (columna de
sílica).
7. Centrifugar durante 1 minuto a 6.000 x g (~ 8,000 RPM).
8. Desechar el tubo de recolección. Poner la columna en un nuevo
tubo de recolección de 2 mL.
9. Añadir 500 μL de Buffer de lavado I.
10. Centrifugar durante 1 min a 8,000 x g (~ 10,000 rpm).
Desechar el tubo colector y colocar la columna en un tubo de
recolección nuevo.
11. Añadir 500 μL de Buffer de lavado II a la columna.
12. Centrifugar para 3 minutos a la velocidad máxima
(≥20,000 x g ó ≥14,000 RPM)
13. Desechar el tubo de recolección y transferir la columna a un
tubo rotulado de microcentrífuga de 1,5 mL.
14. Añadir entre 80 a 100 μL de buffer de elución al centro
de la membrana de la columna para eluir el ADN.
15. Incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente y
centrifugar durante 1 minuto a 8,000 x g (~ 10,000 RPM).
16. Desechar la columna de sílica.
17. Almacenar a -20°C hasta la cuantificación y uso posterior

18. La cuantificación se llevará a cabo mediante un kit de cuantificación

estandarizado.
19. Preparar la solución de trabajo en un tubo de 2mL. Considerando N el número
de muestras, colocar un volumen de 200 µl x (3+N) del buffer de cuantificación
1X según marca del fabricante, y añadir 1 µL x (3+N) del fluoróforo.
20. Para calibrar la lectura se añade 190 µL de solución de trabajo a 2
tubos de 0.5 mL y adicionar 10 µL de estándar de concentración conocida según
la marca del fabricante a cada tubo.
21. De igual forma añadir 199 µL de solución de trabajo a N tubos de 0.5 ml y
adicionar 1 µL de muestra.
22. Homogenizar suavemente e incubar por 3 min. Las lecturas de las
concentraciones se realizan en el cuantificador según la marca del fabricante.
La calidad del ADN se realiza en un gel de agarosa al 2%. A 3µl del ADN
extraído se añade 2µl de Safe Green, cargándose un volumen total de 5µL
por muestra en cada pocillo del gel. La corrida para verificar la calidad de
ADN se realiza a un voltaje de 80 voltios por 30 minutos.
Antes de comenzar, se recomienda precalentar el buffer de lisis (2% de CTAB,
0.5% de PVP, 20mM EDTA pH 8.0, 100mM Tris base pH 8.0, 2.5M de
NaCl) a 65°C.

1. Colocar la muestra en un mortero que haya sido precongelado

previamente a -80°C, agregar nitrógeno líquido y moler hasta obtener
un polvo fino.
2. Antes de que descongele la muestra, adicionar sobre ella 10 volúmenes
del buffer de lisis previamente precalentado. Homogenizar un par de
veces antes de que descongele completamente.
3. Homogenizar y transferir a un tubo nuevo, incubar a 90oC por 10
minutos, mezclar un par de veces durante el proceso. Adicionar 1/10 de
volumen de SDS al 10%, homogenizar e incubar por 5 minutos más.
Transcurrido ese tiempo se permite que la muestra se enfríe a
temperatura ambiente.
4. Adicionar 0.5 volúmenes de la mezcla previamente enfriada de fenol-
cloroformoalcohol isoamílico (25:24:1 v/v), homogenizar y centrifugar a
14,000 rpm por 15 minutos a 4oC.
 5. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y agregar 0.1 volúmenes
de acetato de sodio 3M (pH 5.2), 0.5 volúmenes de fenol-cloroformo
(5:1 v/v), homogenizar y centrifugar a 14,000rpm por 10 minutos a
temperatura ambiente.
6. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y adicionar 0.65 volúmenes
de la mezcla de Etanol-Metanol-Ácido acético glacial (9:3:1 v/v). Agitar
y centrifugar a 13,000 rpm por 5 minutos a temperatura ambiente.
Para mejorar el rendimiento se recomienda antes de centrifugar incubar
por una hora a -20oC.
7. Tirar el sobrenadante. Lavar con 1 mililitro de la mezcla de Etanol-Agua-
MetanolAcetato de sodio 3M, pH 5.2 (30:9:5:1). Agitar y centrifugar
a 13,000 rpm por 5 minutos. Descartar el sobrenadante. Si persisten
algunas sales se puede dar un lavado adicional con 1 mililitro de etanol
al 70%.
8. Secar la pastilla y disolver en agua grado biología molecular (de 20 a
100 µL dependiendo del tamaño de la pastilla formada)

La cuantificación del DNA total extraído se realiza mediante espectrometría,

aceptando la calidad del DNA cuando las relaciones A260/A280 estén dentro
del rango 1.7 - 2.0.

La verificación de la ausencia de inhibidores en el DNA puede observarse en un

gel de agarosa al 0.8% en TAE 1X para determinar la integridad del DNA en
muestras. MPM=1Kb invitrogene ®. Homogenizar las muestras de la siguiente
manera antes de cargarlas en el gel de agarosa: sobre una tira de parafilm
coloque 5µL del DNA extraído y agregue 1µL de buffer de carga.
El voltaje aplicado es una constante de 80V por 60 min. Posteriormente,
observar la imagen del gel en un transiluminador de luz ultravioleta (UV). En
caso de una buena extracción, se debe obtener una banda integra de DNA
genómico por encima de los 12,000 pb en todas las muestras.

Figura. 2. Gel de agarosa al 0.8% en TAE 1X para determinar la integridad del DNA en muestras de
café. MPM=1Kb invitrogene ®

• insnsb.gob.pe/docs-trans/resoluciones/archivopdf.php?pdf=2021/RD%20N%C2%B0%20000187-
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520Sangre%2520Perif%25C3%25A9rica%2520y%2520M%25C3%25A9dula%2520Osea.pdf&tbm=i
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• Extracción de ADN - MX. (s. f.). Recuperado 18 de junio de 2023, de
https://www.thermofisher.com/mx/es/home/life-science/dna-rna-purification-
analysis/dna-extraction.html
• Cruz, J. (2017) Protocolo de extracción de ADN y ARN, a partir de semillas y hojas.
Recuperado de
https://www.gob.mx/cms/uploads/attachment/file/728754/7._PD._Extracci_n_de_DN
A_y_RNA_a_partir_de_semillas_y_hojas_1.0_2017.pdf