SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE

CENTRO NACIONAL DE HOTELERÍA, TURISMO Y ALIMENTOS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

RECUENTO DE ESPORAS Clostridium SULFITO REDUCTORAS

1. OBJETIVO

Este procedimiento tiene por objeto explicar los pasos a seguir para realizar el ensayo: Esporas
Clostridium sulfito reductoras, empleando la técnica recuento de esporas.

2. ALCANCE

Este procedimiento es aplicable para el análisis de los siguientes grupos de alimentos:

 Leche y sus derivados.

 Jugos y pulpas de frutas congeladas pasteurizadas y ultra pasteurizadas.
 Mostaza.
 Salsa.
 Concentrados y jugos de tomate.
 Condimentos.
 Mezcla en polvo.
 Bebidas hidratantes energéticas.
 Bebidas dietéticas carbonatadas.
 Alimento deshidratado para niños lactantes.
 Mermeladas.
 Jaleas.
 Cárnicos crudos cocidos, maduros o ahumados.
 Pollo.

3. DEFINICIONES

ALIMENTO: Todo producto natural o artificial, elaborado o no, que ingerido aporta al organismo
humano los nutrientes y la energía necesarios para el desarrollo de los procesos biológicos. Están
incluidas las bebidas no alcohólicas, y aquellas sustancias con que se sazonan algunos comestibles
y que se conocen con el nombre genérico de especia.

ALIMENTO CONTAMINADO: Alimento que contiene agentes y/o sustancias extrañas de cualquier
naturaleza en cantidades superiores a las permitidas en las normas nacionales, o en su defecto en
normas reconocidas internacionalmente.

ALIMENTO DE MAYOR RIESGO: Alimento que, en razón a sus características de composición

especialmente en sus contenidos de nutrientes, Aw actividad acuosa y pH, favorece el crecimiento
microbiano y por consiguiente, cualquier deficiencia en su proceso, manipulación, conservación,
transporte, distribución y comercialización, puede ocasionar trastornos a la salud del consumidor.
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ALIMENTO PERECEDERO: Alimento, que en razón de su composición, características
fisicoquímicas y biológicas, pueda experimentar alteración de diversa naturaleza en un tiempo
determinado y que, por lo tanto, exige condiciones especiales de proceso, conservación,
almacenamiento, transporte y expendio.

MATERIA PRIMA: Son sustancias naturales o artificiales, elaboradas o no, empleadas por la
industria de alimentos para su utilización directa, fraccionamiento o conversión en alimentos para
consumo humano.

4. DESARROLLO DE ACTIVIDADES

4.1. FUNDAMENTO

Esta técnica se basa en analizar volúmenes decimales de muestra en un medio de cultivo realizando
la siembra en profundidad. Se asume que cada una de las células presentes en el inóculo dará lugar
a una unidad formadora de colonia (UFC) lo que permite realizar el recuento de microorganismos
presentes en la muestra.

Este ensayo es considerado como el indicador más importante de las bacterias anaerobias
formadoras de esporas; varias especies del género Clostridium tienen la propiedad de reducir el ion
sulfito a sulfuro, que en presencia de citrato férrico u otra sal de metales pesados producen colonias
negras.

4.2. INTERFERENCIAS

 Contaminación cruzada en el transporte, recepción y almacenamiento de las muestras.

 Alta concentración del analito.
 Inadecuada homogeneización.
 Temperatura de incubación fuera del rango de especificación para el analito.
 Dilución de nutrientes y pH inestable en los medios de cultivos.

4.3. TOMA Y PRESERVACIÓN DE MUESTRAS

Recolectar las muestras de alimentos con la ayuda de utensilios estériles (Cucharas, tenedores,
cuchillos, pinzas, etc.), e introducir en bolsas estériles. Conservar a temperatura entre 2 y 6 °C y
transportar de inmediato al laboratorio para realizar los respectivos análisis.

4.4. EQUIPOS, MATERIALES, MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS.

4.4.1. Equipos.

 Balanza.
 Baño serológico.
 Cabina de flujo laminar.
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  Incubadoras 35 °C.
 Microscopio.
 Nevera 2 – 6 °C.
 Vortex.

4.4.2. Materiales.

 Bandejas de transporte.
 Dispensador de pipetas.
 Frascos y recipientes para descarte.
 Gradillas.
 Marcadores.
 Micropipetas de 100 y 1000 µL.
 Pipetas graduadas estériles de 1, 5 y 10 mL.
 Portaobjetos y cubreobjetos.
 Tips para micropipetas, azules y amarillas.
 Toallas de papel absorbente.
 Tubos de ensayos tapa rosca 16 cm x 16 mm.

4.4.3. Medios de cultivos y reactivos.

 Agar SPS, OPSP.

 Peptona universal.

4.4.4. Soluciones.

 Agua peptonada 0,1 %.

 Alcohol Etílico 96 %.

4.5. CONSIDERACIONES DE SALUD, SEGURIDAD Y MANEJO AMBIENTAL.

 Usar bata blanca, guantes, mascarilla, gorro y lentes de protección.

 Lavarse las manos antes y después de manipular.
 Desinfectar el área de trabajo antes y después de realizar una tarea.
 No comer, beber, fumar, aplicarse maquillaje o cremas en el área de trabajo.
 No almacenar alimentos y bebidas en refrigeradores donde se encuentren los medios de cultivos,
reactivos, soluciones y materiales de trabajo.
 Tener en cuenta los avisos de advertencia en lo relacionado con las lámparas UV. No ingresar al
área mientras se encuentre encendida.
 Al salir del laboratorio, verificar que las llaves del gas se encuentren cerradas.

4.6. PROCEDIMIENTO

 Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados.

 Identificar los tubos taparrosca, con la fecha, dilución y código de la muestra.
 Transferir a cada tubo taparrosca; alícuotas de 1 mL a partir de cada dilución preparada,
cambiar las pipetas entre diluciones.

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  Colocar los tubos durante 10 minutos en el baño serológico a 80 C y luego someter a shock
térmico, llevándolos rápidamente al chorro de agua fría.
 Adicionar a cada tubo 10 mL de Agar SPS, inclinar el tubo levemente para evitar la formación
de burbujas de aire y dejar solidificar.
 Adicionar una segunda capa de medio (5 mL) y dejar solidificar.
 Incubar a 35 ± 2 C durante 72 horas.
 Observar los tubos diariamente, debido a la generación de un color negro por la formación de
H2S (Sulfuro de Hidrógeno) se puede difundir en el medio, dificultando su lectura.
 Realizar los controles de calidad.

4.7. CÁLCULOS

 Realizar la lectura en los tubos que presenten entre 5 y 50 unidades formadoras de colonia
UFC (de color negro).
 Contar las colonias y multiplicar por el factor de dilución.

Ejemplo 1:

Recuento obtenido: 20 UFC

Dilución: 10-1

Resultado UFC/g o mL: 20 X 10 = 2,0x102

Ejemplo 2:

Recuento obtenido: 43 UFC

Dilución: 10-3

Resultado UFC/g o mL: 43 X 1000 = 4,3x104

Reportar como Esporas Clostridium sulfito reductoras UFC/g o ml. Si no se observan colonias en la
dilución 101, informar el resultado como <10 UFC/g o ml.

5.8. BIBLIOGRAFÍA

 Manual de técnicas de análisis para control de calidad microbiológico de alimentos para

consumo humano INVIMA Santa Fe de Bogotá, 1998.
 NTC 4834.

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