SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE

CENTRO NACIONAL DE HOTELERÍA, TURISMO Y ALIMENTOS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

DETERMINACIÓN DE Staphylococcus aureus COAGULASA POSITIVA

1. OBJETIVO

Este procedimiento tiene por objeto explicar los pasos a seguir para realizar el ensayo:
Staphylococcus aureus coagulasa positiva, en alimentos; empleando la técnica enumeración y
aislamiento en superficie.

2. ALCANCE

Este procedimiento es aplicable para el análisis de los siguientes grupos de alimentos:

 Alimento deshidratado para niños lactantes.

 Alimentos precocidos.
 Alimentos preparados (Restaurantes y comidas rápidas).
 Aromáticas.
 Biscochos, repostería y colaciones.
 Cárnicos cocidos.
 Cárnicos crudos, madurados o ahumados.
 Galletas.
 Helados.
 Leche y sus derivados.
 Mayonesa.
 Pastas alimenticias.
 Pollo, carnes crudas y adobadas.
 Productos apanados que necesiten cocción.
 Productos para consumo directo (pasabocas).
 Sabañón.

3. DEFINICIONES

ALIMENTO: Todo producto natural o artificial, elaborado o no, que ingerido aporta al organismo
humano los nutrientes y la energía necesarios para el desarrollo de los procesos biológicos. Están
incluidas las bebidas no alcohólicas, y aquellas sustancias con que se sazonan algunos comestibles
y que se conocen con el nombre genérico de especia.

ALIMENTO CONTAMINADO: Alimento que contiene agentes y/o sustancias extrañas de cualquier
naturaleza en cantidades superiores a las permitidas en las normas nacionales, o en su defecto en
normas reconocidas internacionalmente.

Página 1 de 6
ALIMENTO DE MAYOR RIESGO: Alimento que, en razón a sus características de composición
especialmente en sus contenidos de nutrientes, Aw actividad acuosa y pH, favorece el crecimiento
microbiano y por consiguiente, cualquier deficiencia en su proceso, manipulación, conservación,
transporte, distribución y comercialización, puede ocasionar trastornos a la salud del consumidor.

ALIMENTO PERECEDERO: Alimento, que en razón de su composición, características

fisicoquímicas y biológicas, pueda experimentar alteración de diversa naturaleza en un tiempo
determinado y que, por lo tanto, exige condiciones especiales de proceso, conservación,
almacenamiento, transporte y expendio.

FERMENTACIÓN: Proceso catabólico (de obtención de energía) llevado a cabo en ausencia de

oxígeno, dando como producto final compuestos orgánicos.

MATERIA PRIMA: Son sustancias naturales o artificiales, elaboradas o no, empleadas por la
industria de alimentos para su utilización directa, fraccionamiento o conversión en alimentos para
consumo humano.

Staphylococcus aureus: Es una bacteria anaerobia facultativa, grampositiva, productora de

coagulasa, catalasa, inmóvil y no esporulada. Puede producir una amplia gama de enfermedades,
que van desde infecciones cutáneas y de las mucosas, tales como foliculitis, forunculosis o
conjuntivitis, hasta enfermedades de riesgo vital, como celulitis, abscesos profundos, osteomielitis,
meningitis, sepsis, endocarditis o neumonía. Además, también puede afectar al aparato
gastrointestinal, ya sea por la acción de las células vivas de Staphylococcus aureus o por la ingesta
de la toxina estafilocócica secretada por la misma.

4. DESARROLLO DE ACTIVIDADES

4.1. FUNDAMENTO

La determinación de S. aureus en los alimentos es de gran importancia debido a que ocasiona

intoxicación alimentaría, la cual después de 2 a 4 horas haber ingerido el alimento contaminado,
comienza a manifestarse generalmente con vómitos, diarrea, malestar y debilidad general. La
contaminación del alimento por este microorganismo puede ser producida por el contacto humano ya
que el reservorio más importante de S. aureus es el hombre, sobre todo en las fosas nasales,
garganta y manos, por lo que se hace necesario realizar controles a los manipuladores de alimentos
y dar tratamiento para combatir el microorganismo y así eliminar el foco de infección.

4.2. INTERFERENCIAS

 Contaminación cruzada en el transporte, recepción y almacenamiento de las muestras.

 Alta concentración del analito.
 Inadecuada homogeneización.
 Temperatura de incubación fuera del rango de especificación para el analito.
 Dilución de nutrientes y pH inestable en los medios de cultivos.

4.3. TOMA Y PRESERVACIÓN DE MUESTRAS

Página 2 de 6
Recolectar las muestras de alimentos con la ayuda de utensilios estériles (Cucharas, tenedores,
cuchillos, pinzas, etc.), e introducir en bolsas estériles. Conservar a temperatura entre 2 y 6 °C y
transportar de inmediato al laboratorio para realizar los respectivos análisis.

4.4. EQUIPOS, MATERIALES, MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS.

4.4.1. Equipos.

 Balanza.
 Cabina de flujo laminar.
 Cuenta colonias.
 Incubadoras 35 °C.
 Nevera 2 – 6 °C.
 Vortex.

4.4.2. Materiales.

 Asa de inoculación en aro.

 Bandejas de transporte.
 Cajas Petri grandes.
 Dispensador de pipetas.
 Frascos y recipientes para descarte.
 Gradillas.
 Marcadores.
 Mechero de Bunsen.
 Micropipetas de 100 y 1000 µL.
 Pipetas graduadas estériles de 1, 5 y 10 mL.
 Tips para micropipetas, azules y amarillas.
 Toallas de papel absorbente.
 Tubos de ensayos tapa rosca 16 cm x 16 mm.

4.4.3. Medios de cultivos y reactivos.

 Agar Baird Parker.

 Agar Nutritivo.
 NaCl (Cloruro de Sodio).
 Peptona universal.
 Telurito de Potasio.
 Plasma de conejo liofilizado.

4.4.3.1. Indicaciones para la preparación del Agar Baird Parker

 Agregar 63 g del polvo en 1000 mL de agua desionizada.

 Someter el medio a calor hasta disolver completamente.
 Ajustar el pH a 7.0 +/- 0,2.
 Esterilizar en autoclave a 121º C, 15 PSI, durante 15 minutos.
 Dejar enfriar aproximadamente a 45º C y adicionar por cada 200 mL de agar base Baird
Parker; 10 mL de solución yema de huevo al 20% y 0.6 mL de Telurito de Potasio 3.5 %.

Página 3 de 6
  Agitar suavemente hasta mezclar completamente el agar con los agregados. Servir en cajas
petri grandes estériles.
 Dejar solidificar y almacenar entre 2 y 6 °C.
 Eliminar el exceso de humedad sobre la superficie de la caja, exponiendo la caja abierta en la
cabina de flujo laminar, durante unos minutos.

4.4.4. Soluciones.

 Agua peptonada 0,1 %.

 Cloruro de Sodio 0,85 %.
 Alcohol Etílico 96 %.
 Solución yema de huevo.
 Solución Telurito de Potasio.

4.4.4.1. Indicaciones para la preparación de la solución de yema de huevo al 20%.

 Lavar los huevos con abundante agua y jabón.

 Sumergir los huevos en una solución de alcohol al 70% durante 15 minutos.
 Perforar la corteza del huevo en la parte superior con ayuda de una pinza estéril.
 Dejar salir la albúmina (clara del huevo) cuidadosamente hasta quedar solo la yema.
 Añadir 20 mL de yema de huevo en una probeta estéril con capacidad de 100 mL. Completar
un volumen de 100 mL, añadiendo 80 mL de solución salina 0.85% estéril.
 Agregar en un frasco estéril y rotular adecuadamente con la fecha y nombre de la preparación.
 Agitar vigorosamente para homogeneizar completamente.

Nota: Conservar entre 2 a 8 °C y descartar 8 días después de la preparación o cuando se observe

algún signo de contaminación.

4.4.4.2. Indicaciones para la preparación de la solución Telurito de Potasio 3.5%.

 Pesar 3.5 g de Telurito de Potasio (K2TeO3), en papel parafinado.

 Llevar a un vaso de precipitado y agregar una pequeña cantidad de agua destilada estéril,
para disolver.
 Transferir esta solución a un balón aforado de 100 mL y aforar con agua destilada estéril.
 Almacenar en un frasco estéril, e identificar adecuadamente con el nombre y fecha de la
preparación.
 Conservar entre 2 y 8 °C.

NOTA: En caso de disponer de una solución comercial de Telurito de Potasio al 3.5 %, tomar
directamente del frasco; el volumen necesario y almacenar según las indicaciones del fabricante.

4.5. CONSIDERACIONES DE SALUD, SEGURIDAD Y MANEJO AMBIENTAL.

 Usar bata blanca, guantes, mascarilla, gorro y lentes de protección.

 Lavarse las manos antes y después de manipular.
 Desinfectar el área de trabajo antes y después de realizar una tarea.
 No comer, beber, fumar, aplicarse maquillaje o cremas en el área de trabajo.

Página 4 de 6
 No almacenar alimentos y bebidas en refrigeradores donde se encuentren los medios de cultivos,
reactivos, soluciones y materiales de trabajo.
 Tener en cuenta los avisos de advertencia en lo relacionado con las lámparas UV. No ingresar al
área mientras se encuentre encendida.
 Al salir del laboratorio, verificar que las llaves del gas se encuentren cerradas.

4.6. PROCEDIMIENTO

4.6.1. Procedimiento de siembra.

 Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizados.

 Identificar las cajas de agar Baird Parker con el código de la muestra y la dilución.
 Tomar 0,1 mL a partir de cada una de las diluciones realizadas y agregar sobre la superficie
de cada una de ellas.
 Extender el inóculo sobre la superficie del agar, con la ayuda del asa de Hokey o una pipeta
estéril; hasta distribuir homogéneamente sobre la superficie.
 Invertir las cajas petri y luego incubar a 35 ± 2 °C durante 48 horas.
 Realizar la lectura teniendo en cuenta la morfología de las colonias de Staphylococcus sp.
(Colonias negras, brillantes, húmedas, 2-3 mm de diámetro, redondas con bordes reducidos
blancos, rodeadas de zonas claras que contrastan con el medio opaco, zona de precipitado de
2 a 5 mm de diámetro).
 Realizar el recuento de las cajas que se encuentren entre 20 y 200 colonias, tomar de 3 a 5
unidades formadoras de colonias (UFC) presuntivas para realizar la prueba de la coagulasa.
 Preparar los controles de calidad.

4.6.2. Prueba de la coagulasa.

 Transferir por separado cada una de las colonias presuntivas a tubos que contengan 5 mL de
caldo BHI.
 Incubar a 35 +/- 2 °C durante 18 a 24 horas.
 Transferir 0.3 mL de cada cultivo de BHI, a tubos estériles con 0,3 mL de plasma de conejo
reconstituido (Reconstituir según indicaciones del fabricante).
 Incubar a 35 +/- 2 °C y observar cada hora y durante 6 horas; la formación de un coagulo de
fibrina bien definido al inclinar los tubos. Asumir la prueba negativa si no se observa
formación de coágulo después de 24 horas de incubación.

4.6.3. Cálculos.

Realizar el cálculo de la densidad de Staphylococcus aureus coagulasa positiva, utilizando la

siguiente fórmula:

Staphylococcus aureus coagulasa positiva UFC/gramos: Recuento en 10-1 X (Colonias

positivas/Colonias examinadas).

Ejemplo:

Recuento en 10-1 = (Recuento en la caja x 100)= 20 X 100 = 2000

Colonias examinadas = 8
Colonias positivas = 5

Página 5 de 6
2000 X (5/8) = 1250 UFC/ g o mL Staphylococcus aureus coagulasa positiva.

Reportar <100 UFC de Staphylococcus aureus coagulasa positiva/ g o mL, si no se observa

crecimiento característico en las cajas o si el resultado de la prueba coagulasa es negativo.

4.7. BIBLIOGRAFíA.

 Manual de técnicas de análisis para control de calidad microbiológico de alimentos para

consumo humano INVIMA Santa Fe de Bogotá, 1998.
 FDA/bam on line 2001 Staphylococcus aureus cap. 12.

Página 6 de 6