Carrera de Ingeniería en Biotecnología

Taller Semana 5
Regresión lineal y evaluación de datos analíticos – Curva de calibración

IBIO1420 – QUÍMICA ANALÍTICA Y LABORATORIO

INTRODUCCIÓN AL MÉTODO
Determinación de proteínas séricas totales por el método de Biuret
En muchas determinaciones se cumple una relación proporcional entre la magnitud o intensidad de
color que da una reacción y la cantidad del reactivo que la provoca. Por ejemplo: si la presencia de 10
ug de proteínas en una solución genera la aparición de un color azul pálido cuando es agregada a una
mezcla reactiva, la presencia de 20 ug de proteína dará lugar a que la solución se torne azul más oscuro
y así sucesivamente.
Reacción de Biuret: El nombre de la reacción procede del compuesto coloreado formado por la
condensación de dos moléculas de urea con eliminación de amoníaco. Esta reacción está dada por
aquellas sustancias cuyas moléculas contienen dos grupos carbamino (-CO.NH) unidos directamente o
a través de un solo átomo de carbono o nitrógeno. El reactivo de Biuret contiene Cu2SO4 en solución
acuosa alcalina (gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación de un
complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno
que forma parte de los enlaces peptídicos. Esta última reacción provoca un cambio de coloración:
violeta púrpura o violeta rosado. Debe señalarse que el color depende de la naturaleza de las
proteínas; proteínas y péptidos dan un color rosado; la gelatina da un color azul
Proteínas séricas: Son proteínas globulares que permanecen en el suero tras la acidificación de la leche
a pH = 4,6 o por la acción del cuajo, no interviniendo en la formación de la cuajada, razón por la que
también se las denomina proteínas séricas. Y se detectan en el suero de que sería una vez separado
del gel por tecnologías clásicas. La determinación de proteínas séricas en sangre sirve para confirmar
desórdenes relacionados con la sangre, riñones, enfermedades hepáticas, deficiencias proteicas,
diagnóstico de tumores.
Valores normales:
 Proteínas totales 6.6 a 7.9g/dl
Valores aumentados: en enfermedades inflamatorias; enfermedades del colágeno; deshidratación;
diabetes; acidosis diabética; cirrosis; algunos linfomas; mieloma; enfermedad de Waldenstrom; Lupus
eritematoso sistémico; algunas enfermedades infecciosas; artritis reumatoidea; vómitos y/o diarrea.

Procedimiento
Materiales
 Reactivos:
 Solución estándar de albúmina 10 mg/ml
 Reactivo de Biuret (solución de sulfato de cobre 1% p/p en NaOH 14% p/v)
 Muestras de suero sanguíneo de 3 pacientes (muestra 1, muestra 2, muestra 3)
 Espectrofótometro y celdas para espectrofotómetro.
 Material de vidrio, balanza, y material de laboratorio necesario para preparar las soluciones.
Método
1. Preparar la solución estándar de albúmina de 10 mg/mL.
2. Realizar disoluciones, utilizando la siguiente igualdad, y de esta manera calcular el volumen de la
solución de albúmina que se debe ocupar:
V1 * C1 = V2 * C2
Preparar 10 mL de las distintas soluciones de concentración estándar de albúmina completando
el volumen con agua destilada.
3. Preparar los estándares de albúmina y las muestras con el reactivo de Biuret de la siguiente
manera:

 Tubo 1: 0.5ml Agua destilada + 2ml Reactivo de Biuret

 Tubo 2: 0.5ml Solución estándar 0.5 mg/ml + 2ml Reactivo de Biuret
 Tubo 3: 0.5ml Solución estándar 1.0 mg/ml + 2ml Reactivo de Biuret
 Tubo 4: 0.5ml Solución estándar 2.5 mg/ml + 2ml Reactivo de Biuret
 Tubo 5: 0.5ml Solución estándar 5.0 mg/ml + 2ml Reactivo de Biuret
 Tubo 6: 0.5ml Solución estándar 7.5 mg/ml + 2ml Reactivo de Biuret
 Tubo 7: 0.5ml Solución estándar 10.0 mg/ml + 2ml Reactivo de Biuret
 Tubo 8-12: 0.5ml muestra 1 + 2ml Reactivo de Biuret
 Tubo 13-17: 0.5ml muestra 2 + 2ml Reactivo de Biuret
 Tubo 18-22: 0.5ml muestra 3 + 2ml Reactivo de Biuret
**El paso más importante en esta etapa es el agregado del reactivo de Biuret que solo se agrega
cuando todos los tubos estén con su disolución lista ya que a partir de que se coloca comienza la
reacción, y deben comenzar todas las soluciones al mismo tiempo.
4. Mezclar y agitar los tubos durante 10 a 30 segundos en el Vórtex.
5. Dejar incubar los tubos a temperatura ambiente durante 15 minutos
6. Llenar las cubetas para espectrofotómetro con las respectivas soluciones de los tubos hasta ¾ de
su capacidad total, cuidando de limpiarlas después de haber vaciado el contenido.
7. Introducir cada cubeta en el espectrofotómetro. Encerar la absorbancia con el blanco. Medir y
anotar los datos de absorbancia de cada estándar y de cada muestra.
8. Construir una curva de calibración con los estándares (tubos del 1 al 7).

RESULTADOS:
Tabla 1: Resultados de absorbancia para blanco y soluciones patrón
Tubo Concentración de albúmina (mg/ml) Absorbancia
1 0,0 0,000
2 0,5 0,016
3 1,0 0,040
4 2,5 0,086
5 5,0 0,164
6 7,5 0,253
7 10,0 0,341

Tabla 2: Resultados de absorbancia para las muestras

Tubo Muestra Repetición Absorbancia
8 1 0,218
9 2 0,231
10 1 3 0,222
11 4 0,227
12 5 0,229
 Tabla 2: Resultados de absorbancia para las muestras (continuación)
Tubo Muestra Repetición Absorbancia
13 1 0,293
14 2 0,291
15 2 3 0,291
16 4 0,292
17 5 0,289
18 1 0,231
19 2 0,228
20 3 3 0,229
21 4 0,223
22 5 0,225

INDICACIONES DEL TALLER

1. (1 punto) Explique cómo prepararía la solución base de 10 mg/mL de albúmina (cantidades de
reactivo, materiales utilizados, procedimiento).
2. (1 punto) Explique cómo prepararía el resto de soluciones patrón de albúmina a partir de la
solución base de 10 mg/mL. Considerar la preparación de 10 mL de cada solución.
3. (2 puntos) Elaborar la curva de calibración con los datos de la Tabla 1 y sacar la regresión lineal.
4. (2 puntos) Calcular la concentración de proteínas totales para cada muestra y reportar utilizando
medidas de tendencia central y dispersión. Reportar para cada una de las 3 muestras.
5. (1 punto) Concluir sobre la precisión del método y del análisis de cada muestra.
6. (1 punto) Se realizó el análisis de las 3 muestras mediante otro método para validar y se
obtuvieron los siguientes resultados:
 Muestra 1: Concentración de proteínas totales promedio = 6,71 mg/mL.
 Muestra 2: Concentración de proteínas totales promedio = 8,57 mg/mL.
 Muestra 3: Concentración de proteínas totales promedio = 7,12 mg/mL.
Calcular el porcentaje de error asociado y concluir sobre la exactitud del análisis de cada muestra.
Considerar el valor obtenido con el otro método como valor esperado.
7. (2 puntos) Identificar posibles errores sistemáticos y aleatorios que podrían explicar los valores
de % de error y dispersión obtenidos.

REFERENCIAS:
 Cabanes J (1988): Propiedades químicas y separación de los aminoácidos.
 Henry, J. B., (2005), Diagnóstico y Tratamiento Clínicos por el Laboratorio, 633-634.
 Krupp, M., (1979), Manual de Diagnóstico Clínico y de Laboratorio, 223.
 Lozano J.A., Tudela J., (2014) “Prácticas de Bioquímica. Experimentación y Simulación”, 1ª Ed.
Editorial Síntesis, Madrid, España, 87–92.
 Ville, C. A., (1974) Proteínas. Biología. 6ª ED. Interamericana, México, 31-33.