INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

Escuela Nacional de Ciencias

Biológicas

Departamento de Bioquímica
Laboratorio Metodos de Analisis

práctica:
PURIFICACIÓN PARCIAL DE LISOZIMA DE CLARA DE HUEVO

INTEGRANTES:
vARGAS fREYRE Nadia mERITXELL
Jimenez Rodríguez Isis Citlalli
Domínguez Cruz Perla Midary

Fecha de entrega: 22/11/22

GRUPO: 5QM3
SECCIÓN: 2
Fundamento de la cromatografía por intercambio iónico.
La cromatografía de intercambio iónico se basa en la interacción reversible entre
una proteína cargada y una resina de cromatografía con carga opuesta. La carga
superficial neta de las proteínas varía según el pH circundante.
El pH en el que una proteína no tiene carga neta se llama punto isoeléctrico (pI).
Por encima de su punto isoeléctrico (pI), una proteína se unirá a un intercambiador
de aniones con carga positiva. Por debajo de su pI, una proteína se unirá a un
intercambiador de cationes con carga negativa.

Fundamento de la determinación de la actividad enzimática de la lisozima.

La medición de la actividad de la lisozima se realiza utilizando como sustrato una
suspensión de células de Micrococcus lysodeikticus esto debido a que la lisozima
forma parte del grupo de las hidrolasas glucosídicas y cataliza la hidrólisis del
enlace β (1-4) entre la N-acetilglucosamina y el ácido N-acetilmurámico de las
paredes celulares de las bacterias.

Condiciones bajo las cuales se realizó la determinación de la actividad

enzimática.
Se realizó a una temperatura ambiente, pH = 6.2 el cual fue proporcionado por el
regulador de fosfatos 100 mM y la actividad enzimática se midió con un tiempo de 2
minutos.

A) Tabla 1. Actividad de la lisozima en las fracciones obtenidas

ΔA450/min/mL
A450 A450 ΔA450/min/mL
Fracción tiempo cero después de 2 min

F1 0.34 0.21 0.065 2.16

F2 0.33 0.31 0.01 0.33

F3 0.35 0.27 0.04 1.33

F4 0.33 0.25 0.04 1.33

ΔA450/min/mL= 0.34-0.21= 0.065

2

ΔA450/min/mL= 0.065 * 30= 2.16

 1000

B) Tabla 2. Curva de calibración de albúmina por el método de Bradford (micrométodo)

Tubo Cantidad de proteína A595

No. (µg)
Serie A Serie B

1, 1´ 2 0.059 0.074

2, 2´ 4 0.155 0.183

3, 3´ 6 0.227 0.246

4, 4´ 8 0.285 0.280

5, 5´ 10 0.349 0.351

Ejemplo de cálculo de la concentración de proteína:

Datos:
Sol. de proteína 20 µg/ml Calculo:
20 𝑥 500
1 ml = 1000 μL 1000
= 10 μ𝐿
Al tubo 5 se agregaron 500 μL

Gráfica 1. Curva de calibración de albúmina por el método de Bradford

C) Tabla 3. Determinación del grado de purificación de la lisozima.

Fracción ΔA/min/m A595 µg/ml Dilución [Proteína] Act.esp. Purificación

L mg/ml (enz/mg) de la
lisozima

F1 2.16 0.535 31.64 1000 31.64 68.34 1

F2 0.33 0.46 27.17 1000 27.17 8.96 0.13

F3 1.33 0.141 8.19 500 4.09 5.43 0.07

F4 1.33 0.145 8.41 200 1.63 2.16 0.03

Cantidad de proteína: 0.535 - 0.0168 = 31.64

0.034

[Proteína]: cantidad de proteína * dilución

1000

[Proteína]: 31.64 * 1000 = 31.64

1000

Actividad específica: Actividad de la enzima =

[Proteína]

Actividad específica: 2.16 = 68.34

31.64

Purificación de la lisozima= F2, F3, F4 o F5

F1

Purificación de la lisozima: 8.96 = 0.13

68.34
D) Cálculo de % de retención del intercambiador,

Actividad F1- Actividad F2 * 100=

Actividad F1

2.16 - 0.33 * 100= 84.72

2.16
Cálculo % de recuperación de la actividad de lisozima

Actividad F4 *100=
Actividad F1

1.33*100= 61.57%
2.16

E) Discusión de resultados
El procedimiento de esta práctica se divide en tres experiencias la primera corresponde a la
purificación de la lisozima la cual se llevó a cabo por medio de centrifugaciones esto para
solubilizar las diferentes proteínas presentes en la clara de huevo, del analito de interés que
es la lisozima obteniéndose de estas centrifugaciones 4 fracciones en donde a las primeras
3 se les agregó el regulador A el cual funciona como la fase móvil de la cromatografía el
cual que contiene glicina/NaOH 0.1M, pH=10 dicho regulador provocaba una protonación
en la proteína lo que significa que presenta una carga positiva dado que el pH es menor que
el punto isoeléctrico por lo que se unirá a una resina con carga negativa que en este caso
es la Carboximetil-celulosa (CM-celulosa) la cual funciona como la fase estacionaria
quedando retenida la lisozima.
Una vez unida la proteína a la resina, estas se pueden eluir de dos formas distintas:
1) variando el pH del medio hasta alcanzar el pI
2) mediante un gradiente iónico añadiendo el contraión correspondiente (Na
en el caso de intercambio catiónico o Cl- para el intercambio aniónico)
Por lo que en esta práctica se utilizó la segunda opción ya que en la fracción número 4 se
modificó la fase móvil por el Regulador B el cual contiene glicina/NaOH 0.1M pH 10 con la
diferencia de contener 0.6M de NaCl este último compuesto es muy importante debido a
que el sodio funcionara como ion movil ya que desplaza a la lisozima y se une a la fase
estacionaria quedando libre la lisozima.
Posteriormente se midió la actividad de la lisozima en las fracciones obtenidas,
determinando la actividad específica de cada fracción y se calculo la concentracion de
proteinas esto por medio de la ecuacion de la curva tipo realizada por el método de
bradford, en los valores obtenidos se observa una disminución en las fracciones esto debido
a la pérdida de proteína por lo que la mayor actividad enzimática se presenta en la fracción
1 debido a que la lisozima se encuentra completa y por lo tanto hay mayor actividad seguida
por la fracción 4 que es donde la lisozima se encuentra purificada a diferencia de las
fracciones 2 y 3 en las cuales se realizaron las decantaciones y hubo pérdida, esta relación
se mantiene en la determinación de la actividad específica en la cual se esperaría que los
valores incrementaron con respecto a la purificación sin embargo se observa una
disminución.
Finalmente con los valores obtenidos de la actividad enzimática se calcularon los % de
retención del intercambiador y el % de recuperación de la actividad de la lisozima.

F) Empleando fórmulas incluyendo la del intercambiador iónico utilizado, elabore un esquema

de cómo se produjo la purificación de la lisozima, considerando el empleo de las soluciones
reguladoras A y B.