Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad

enzimática de la fosfatasa acida

Objetivo:

 Determinar los parámetros cinéticos: Km y Velocidad Máxima de la Fosfatasa
Ácida para el p-nitrofenilfosfato.
 Medir cuantitativamente a través del espectrofotómetro la velocidad y actividad
enzimática.
 Analizar el efecto de la concentración de sustrato a partir de las bases teóricas
con respecto a las obtenidas experimentalmente.
 Discutir los valores obtenidos a partir del experimento con valores referenciales.

Aprendizajes obtenidos:
 Diferenciar entre un blanco colorimétrico y un blanco enzimático.
 Calcular la absorbancia corregida de un ensayo enzimático.

Protocolo:
Disponemos de los siguientes reactivos, con los cuales preparamos las distintas
soluciones en los tubos de ensayo entregados por las docentes siguiendo como
patrón la siguiente tabla:
Protocolo para la curva “velocidad v/s concentración de sustrato” de enzima
Fosfatasa ácida:
Reactivo BC* 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
p-NFF en el tubo -----
(mM)
p-NFF _______ ----- 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 0,70 1,0 2,0
(mM)
Agua dest. 2,0 1,80 1,75 1,70 1,65 1,60 1,55 1,50 1,30 1,0 -----

T. Citrato pH 4,8 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Preincubar 2 minutos a 45 ºC, todos los tubos más la enzima entubo aparte, luego..

Enzima ----- 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Incubar todos los tubos a 45 ºC por 10 minutos, luego agregar....

NaOH 0,4 M 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Retiramos los tubos del baño termorregulador , procedimos a mezclar en el vortex;
con el blanco colorímetro calibramos el espectrofotómetro a 410 nm de longitud de
onda y a 100% transmitancia , posterior a esto medimos la absorbancia de cada
tubo.

Resultados experimentales:
 Luego de leer la absorbancia de cada ensayo enzimático y del blanco
enzimático, calculamos el promedio de la absorbancia de ambos ensayos, y
después calculamos la absorbancia corregida:
Absorba Absorbancia
ncia corregida (EN – BE)
EN 1 0,124 0,050
EN 2 0,156 0,082
EN 3 0,205 0,131
EN 4 0,246 0,172
EN 5 0,106 0,032
EN 6 0,297 0,223
EN 7 0,090 0,016
EN 8 0,236 0,162
EN 9 0,241 0,167
EN 10 0,420 0,346
BE 0,074 --

 Continuo a eso, calculamos lo que vendría siendo el producto generado por

la reacción en micromoles, con la ecuación de Lambert-Beer, utilizando
como parámetros la absorbancia corregida de cada ensayo y el factor de
calibración K del p-nitrofenil fosfato (producto formado) la cual es 3,9
(micromol/tubo)-1

Absorbancia
corregida / factor Producto generado
de calibración K del (micromoles/tubo)
p-nitrofenol
EN 1 0,050/ 3,9 0,031
(micromol/tubo)-1
EN 2 0,082/ 3,9 0,040
(micromol/tubo)-1
EN 3 0,131/ 3,9 0,052
(micromol/tubo)-1
EN 4 0,172/ 3,9 0,063
(micromol/tubo)-1
EN 5 0,032/ 3,9 0,026
(micromol/tubo)-1
 EN 6 0,223/ 3,9 0,076
(micromol/tubo)-1
EN 7 0,016/ 3,9 0,023
(micromol/tubo)-1
EN 8 0,162/ 3,9 0,061
(micromol/tubo)-1
EN 9 0,167/ 3,9 0,062
(micromol/tubo)-1
EN 10 0,346/ 3,9 0,108
(micromol/tubo)-1

 Luego calculamos la velocidad de reacción de cada ensayo enzimatico,

dividiendo la concentración resultante con el tiempo que duró la reacción,
que vendrían siendo los 10 minutos de incubación.

Producto generado Velocidad de

(micromoles/tubo) / reacción
unidad de tiempo (micromoles/min)
EN 1 0,031 3,1x10ˉ³
EN 2 0,040 4 x10ˉ³
EN 3 0,052 5,2 x10ˉ³
EN 4 0,063 6,3 x10ˉ³
EN 5 0,026 2,7 x10ˉ³
EN 6 0,076 7,6 x10ˉ³
EN 7 0,023 2,3 x10ˉ³
EN 8 0,061 6,1 x10ˉ³
EN 9 0,062 6,2 x10ˉ³
EN 10 0,108 0,0108
 Por ultimo para poder graficar calculamos la concentración de p-
Nitrofenilfosfato que se encontraba en cada ensayo enzimático según la
cantidad de volumen sugerido por el protocolo, utilizando la fórmula de
dilución:
Concentración
C1 X V1 = C2 X V2 p-NFF
(micromolar)
EN 1 3 µM • 0,20ml= C2 • 4ml C2= 0,15

EN 2 3 µM • 0,25ml= C2 • 4ml 0,1875

EN 3 3 µM • 0,30ml= C2 • 4ml 0,225
EN 4 3 µM • 0,35ml= C2 • 4ml 0,2625
EN 5 3 µM • 0,40ml= C2 • 4ml 0,3
EN 6 3 µM • 0,45ml= C2 • 4ml 0,3375
EN 7 3 µM • 0,50ml= C2 • 4ml 0,375
EN 8 3 µM • 0,70ml= C2 • 4ml 0,525
 EN 9 3 µM • 1,0ml= C2 • 4ml 0,75
EN 10 3 µM • 2,0ml= C2 • 4ml 1,5

 Realizamos dos gráficos, el primero con los ejes concentración micromolar

de p- Nitrofenilfosfato v/s Velocidad de reacción,el segundo utilizando la
velocidad de reacción /1 versus la concentración de sustrato /1 y los
correspondientes inversos.
 Finalmente calculamos el valor de Km y Vmax, indicando sus unidades
correspondientes a partir del grafico.

Conclusiones:
Para finalizar, de acuerdo a la ecuación de Michaelis-Menten la concentración de
sustrato y la velocidad de reacción se relacionan con la tendencia de la curva
asintótica. Debido a la complejidad de estimar el valor de la asíntota de la
hipérbole (velocidad máxima), es a que se realizan las modificaciones algebraicas
de la ecuación, ya que ésta se corresponde con la ecuación principal de la recta.
Al utilizar los inversos de las variables concentración y velocidad (de la ecuación
de Lineweaver – Burk) es posible obtener la forma lineal de la ecuación para así
determinar los valores de las constantes.
El error experimental es uno de los factores prácticamente inevitables que influye
considerablemente en los resultados de las mediciones de la cinética enzimática,
debido a que se requiere un trabajo de gran disciplina para llevar a cabo con
exactitud tanto las mediciones al incorporar los reactivos, como también en el
tiempo de incubación de la enzima, ya que esto afecta directamente en el método
Lineweaver – Burk que es altamente sensible por su conformación en base a
inversos recíprocos.

Por lo tanto, el estudio de la actividad enzimática es relevante para darle uso en

algún futuro a los próximos avances científicos que tiene cabida en la actualidad,
así como también para comprender su rol en los procesos metabólicos y tener un
mejor acercamiento a las reacciones bioquímicas que ocurren los organismos y
finalmente permiten la vida.

Integrantes: -Tiare Belmar

-Barbara Cerpa
 -Scarlett Gutiérrez

Profesor: Alex Quaas Fermandois.

Asignatura: Bioquímica

Carrera: Tecnología médica – 2°año

Fecha de entrega: 23/06/2016