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UNIVERSIDAD DE CALDAS

FACULTAD DE INGENIERÍAS
PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS

Asignatura : Biotecnología
Docente : Óscar Julián Sánchez Toro
Tema : Cinética Enzimática Básica y Reactores Enzimáticos

1. Con el objetivo de medir la actividad enzimática y la velocidad inicial de reacción, 5


mL de una solución de celobiosa con una concentración de 100 μmol/mL y 44 mL
de solución buffer o amortiguadora se mezclaron en un matraz agitado. La reacción
se inició adicionando 1 mL de solución de β-glucosidasa, la cual contiene 0,1 mg de
proteína por mL. A los 1, 5, 10, 15 y 30 min se tomaron muestras de 0,1 mL de
mezcla reaccionante y se midió su contenido en glucosa. Los resultados se
muestran en la Tabla 1.
a. ¿Cuál es la actividad específica de la β-glucosidasa en unidades/mL de solución
de enzima y en unidades/mg de proteína? En este caso, se define unidad como
la cantidad de enzima que produce 1 μmol de glucosa en un minuto.
b. ¿Cuál es la velocidad inicial de la reacción?
c. ¿Cuál es la estructura química de la celobiosa? ¿Qué se entiende por solución
buffer y cuál es su importancia en la determinación de la actividad enzimática?

Tabla 1.
Tiempo, min Concentración de Glucosa, μmol/mL
1 0,05
5 0,23
10 0,38
15 0,52
30 1,03

2. Se requiere procesar 20 ton de harina de maíz (maizena) como materia prima para
la producción de jarabe de glucosa. La harina contiene 91,3% (w/w) de almidón.
Dos proveedores de glucoamilasa comercial ofrecen sendos preparados
enzimáticos para este proceso. El proveedor A suministra el preparado AMG® 300
de Novozymes a un precio de $750.000 el litro; en la ficha técnica de este
preparado se indica que su actividad enzimática es de 300 GAU/mL. Por su parte, el
proveedor B comercializa el preparado OPTIDEX® L-400 de Genencor a un precio
de $850.000 el kilogramo; la actividad enzimática de este segundo preparado es de
350 GAU/mL de acuerdo con su ficha técnica. En el laboratorio de la empresa
procesadora de harina de maíz se realizaron ensayos con cada uno de los dos
preparados, arrojando los datos de la Tabla 2; para ello, se incubaron 100 mL de
una solución de 4% de almidón de Lintner con 1 mL del preparado enzimático y se
midió la concentración de glucosa formada al minuto de reacción en condiciones
estándar para esta enzima (pH de 4,5 y temperatura de 60ºC). Se definió una
unidad de actividad glucoamilasa (U) como la cantidad de enzima que en una

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solución al 4% de almidón de Lintner forma 1 µmol de glucosa en 1 minuto bajo
condiciones estándar. Por su parte, los fabricantes de los preparados enzimáticos
emplearon la unidad GAU como medida de la actividad enzimática; una unidad GAU
es la cantidad de glucoamilasa que libera 1 g de azúcares reductores (como
glucosa) a partir de una solución de almidón soluble por hora en las condiciones
especificadas en cada ensayo. Según la literatura científica, la dosis más adecuada
para convertir el almidón de maíz en glucosa empleando glucoamilasa es de 22 U/g
de almidón; en contraste, el rango de las dosis de preparado enzimático de
glucoamilasa recomendado por los fabricantes es de 0,36 a 1 kg (de 0,29 a 0,88 L)
por tonelada de almidón a procesar (en base seca). Compare las actividades
enzimáticas específicas de cada preparado en U/mL y U/mg obtenidas en el
laboratorio con las indicadas por los proveedores. ¿Cuál preparado enzimático
recomendaría usted?

Tabla 2.
Preparado Concentración de Contenido de proteína en Densidad del
enzimático glucosa, el preparado, preparado,
mol/L mg/mL g/L
AMG 300® 0,25 0,40 1140
OPTIDEX L-400® 0,31 0,30 1160

3. Una reacción enzimática presenta la cinética relacionada en la Tabla 3.


a. Determine KM y Vmáx
b. ¿Cuál es el valor de la velocidad de la reacción enzimática si la concentración
inicial de sustrato es igual a la constante de Michaelis?
c. ¿Cuánto tiempo demandará la transformación del sustrato en un 35% si la
concentración inicial del mismo es de 3 mmol/L?

4. En la Tabla 4 se relacionan las velocidades iniciales de una reacción catalizada por


una enzima a diferentes concentraciones iniciales de sustrato.
a. Determine Vmáx y KM por el método de Lineweaver-Burk
b. Determine estos parámetros cinéticos por el método de Eadie-Hofstee
c. Determine estos mismos parámetros por el método de Langmuir
d. Calcule los coeficientes de regresión y de determinación en cada caso, así como
las desviaciones estándar para cada método. Saque sus propias conclusiones.

5. Una enzima con un KM = 0,001 M se incubó con un sustrato a una


concentración inicial del mismo de 3.10-5 M. A los 2 min reaccionó el 5% del
sustrato.
a. ¿Qué tiempo requiere la transformación del 15% del sustrato?
b. Hallar los perfiles de sustrato y producto con respecto al tiempo para esta
reacción enzimática, si se supone que por cada mol de sustrato
transformada se forma 0,75 mol de producto.
c. ¿Qué cantidad de sustrato será transformado a los 10, 30 y 60 min?

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d. Mostrar las gráficas de grado de transformación y de rendimiento en función
del tiempo de reacción.

Tabla 3. Tabla 4.
S0, mmol/L V0, mmol/(L.min) S0, mmol/L V0, mol/(L.min) × 106
0,20 0,034 4,100 177
0,29 0,051 0,950 173
0,50 0,067 0,520 125
1,00 0,100 0,103 106
2,50 0,133 0,049 80
1,06×10-2 67
5,1×10-3 43

6. De una serie de ensayos en diferentes lotes o “corridas” experimentales con


una concentración constante de enzima, se obtuvieron los datos de velocidad
de la reacción enzimática como función de la concentración inicial de sustrato
que se ilustran en la Tabla 5.
a. Evalúe los parámetros cinéticos del modelo de Michaelis-Menten empleando
los métodos de Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee, Langmuir y por regresión
no lineal. En la determinación de los parámetros no tome en cuenta los
puntos que se desvían sistemáticamente del modelo de Michaelis-Menten y
explique la razón de esta desviación.
b. Compare las predicciones de cada método graficando las curvas de V0 vs.
S0, además de los datos experimentales y analice las ventajas y desventajas
de cada método. Mostrar las curvas en una sola gráfica e indicar los datos
experimentales sin unirlos con ninguna curva.
c. Repita la parte (a) usando todos los datos. Compare los valores de los
parámetros obtenidos por cada método. Analice los resultados obtenidos.

7. Un carbohidrato se descompone en presencia de una hidrolasa. Los


parámetros de la cinética de Michaelis-Menten que se determinaron fueron los
siguientes: KM = 200 mol/m3 y Vmáx = 100 mol/(m3.min).
a. Genere la curva que muestre el cambio de la concentración de sustrato con
el tiempo en un reactor por lotes si la concentración inicial del carbohidrato
es de 300 mol/m3. Muestre también, mediante una curva, cómo varía el
grado de hidrólisis con respecto al tiempo en el mismo reactor.
b. Se llevaron a cabo varios ensayos en un quimioestato (reactor continuo de
tanque agitado). Si la concentración del sustrato en la alimentación es de
300 mol/m3 y el caudal es de 100 cm3/min, ¿cuál es la concentración de
sustrato en el efluente si se supone estado estacionario? El volumen del
reactor es de 300 cm3. Asuma que la concentración de la enzima en el
reactor es constante, de tal manera que se puedan utilizar los mismos
parámetros cinéticos. ¿Cuál es el grado de hidrólisis en este caso?

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Tabla 5.
S0, mmol/L V0, mmol/(L.min)
1 0,20
2 0,22
3 0,30
5 0,45
7 0,41
10 0,50
15 0,40
25 0,33

8. La fumarasa cataliza la producción de ácido málico a partir de ácido fumárico.


Diferentes datos experimentales muestran que la reacción transcurre hasta el
producto en un 94%. Se implementó un proceso por lotes en un reactor de
tanque agitado. La concentración inicial de ácido fumárico fue de 0,8 M. Si la
constante de Michaelis es de 0,025 M y la velocidad máxima es de 0,3
mol/(L.h), hallar:
a. El tiempo necesario para que se transforme el 78% del sustrato.
b. La concentración de ácido málico y el grado de transformación a las 4 h de
reacción.

9. En un reactor de tanque agitado continuo de 0,5 m 3 que opera en estado


estacionario, se lleva a cabo la hidrólisis de celobiosa bajo la acción de la
enzima β-glucosidasa. El tanque está construido de tal forma que la enzima no
abandona el reactor durante su operación. La velocidad de la reacción
enzimática se puede describir de acuerdo al modelo de Michaelis-Menten. El
reactor debe garantizar una conversión del sustrato del 88%. Si el reactor se
alimenta con una solución que contiene 25% (p/v) de sustrato, calcular:
a. El caudal de alimentación necesario para la conversión indicada y la
concentración de producto en el efluente.
b. El caudal de alimentación y la concentración del producto en el efluente
para la conversión indicada si la velocidad de la reacción enzimática se
describiera por una ecuación de primer orden con respecto al sustrato con
una constante de velocidad k.
c. ¿Cuál cinética es más favorable para el proceso comparando los literales a
y b?
d. La concentración de producto en el efluente si la reacción transcurriera en
un 87% hasta el producto considerando una cinética de Michaelis-Menten.
Datos necesarios: Vmáx = 23 g/(L.h), KM = 2 g/L, k = 1,2 h-1.

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10. La velocidad de una reacción enzimática para la síntesis de un compuesto
biológicamente activo se puede describir de acuerdo a la siguiente ley de
segundo orden:

v = k S2

Si la constante de velocidad de la reacción tiene un valor de 0,03 L/(mmol.min)


y si la concentración inicial del sustrato es de 5 mmol/L, hallar el grado de
transformación que se alcanza en un biorreactor enzimático que trabaja por
lotes a los 30 min de reacción. Construir la curva que muestre la dependencia
de la concentración de sustrato en función del tiempo.

11. La hidrólisis de celulosa empleando un complejo celulolítico da lugar a la


liberación de glucosa. Se asume que la cinética global de este proceso se
puede describir por la siguiente expresión:

v = k 5 S3

La constante cinética k tiene un valor de 0,1 g2/5×L-2/5×min-1. Durante un


proceso por lotes se agregó el complejo celulolítico a una solución al 10% (p/v)
de celulosa. Si la reacción transcurre en un 87%, calcular:
a. La concentración de glucosa a los 120 minutos.
b. La conversión de sustrato a la hora de reacción si se disminuye en un 75%
el valor de la constante cinética.

12. La cinética de hidrólisis del polímero xilano con la enzima β-xilosidasa se


puede describir con un modelo basado en la siguiente ecuación:

Vmáx S
v=
S
KM + S +
Ki

El producto de la reacción enzimática es la xilosa, un azúcar de cinco


carbonos. Según las diferentes mediciones realizadas durante este proceso de
degradación enzimática, por cada 100 g de xilano hidrolizado se forman 111g
de xilosa. Si se desea obtener un grado de hidrólisis del 85% a partir de una
solución que contiene 15% (p/v) de xilano, y si se dispone de un reactor
enzimático de 3.000 L que puede trabajar tanto en régimen por lotes como en
forma continua en una planta de producción que opera 330 días al año,
calcular:
a. El tiempo requerido de la reacción enzimática en un proceso por lotes y la
cantidad de producto obtenido durante un año; la duración de un lote es un

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35% mayor que el tiempo requerido de la reacción enzimática en un
proceso por lotes debido a la necesidad de preparar los reactores para el
siguiente lote.
b. El tiempo de residencia requerido para el proceso continuo en el biorreactor
y la cantidad de producto obtenido durante un año.
Datos: KM = 2 g/L, Ki = 1 L1/2/g1/2, Vmáx = 1,8 g/(L.h).

13. La invertasa cataliza la reacción de hidrólisis de la sacarosa en azúcar


invertido. La estequiometría de la reacción muestra que por cada mol de
sacarosa hidrolizada se forma 0,94 moles de glucosa, 0,94 moles de fructosa y
una mínima cantidad de productos secundarios. Sin embargo, la invertasa es
inhibida por el mismo sustrato. De esta manera, la expresión de la velocidad
para la reacción de hidrólisis enzimática de la sacarosa es:

Vmáx S
v=
 S 
S 1 +  + K M
 Ki 

En un reactor agitado por lotes se lleva a cabo la inversión de la sacarosa con


invertasa para obtener glucosa como producto principal. La concentración
inicial de sacarosa es de 10% (p/v). Si la constante de Michaelis es de
0,015 M, la constante de inhibición (Ki) es de 0,2 M y la velocidad máxima es
de 0,1 mol/(L.h), hallar:
a. La expresión que indique la dependencia de la concentración de sacarosa
en función del tiempo de hidrólisis.
b. El grado de hidrólisis (en %), la concentración de glucosa (en mol/L) y el
rendimiento (en g glucosa/g sacarosa) para un tiempo de hidrólisis de 246
min.
Demostrar gráficamente que cuando existe inhibición por sustrato, la velocidad
máxima no se alcanza. ¿A partir de qué concentración de sustrato se observa
el efecto de la inhibición? ¿Qué pasa con la velocidad de la reacción
enzimática si la constante de inhibición aumenta o disminuye?

14. Un sustrato se convierte en producto bajo la acción catalítica de una enzima.


Asumiendo que los parámetros de la cinética de Michaelis-Menten para esta
reacción enzimática son KM = 0,03 mol/L y Vmáx = 13 mol/(L.min), determinar el
volumen de un reactor continuo de tanque agitado (CSTR, por sus siglas en
inglés) que opere en estado estacionario para convertir el 95% del sustrato que
entra en la corriente de alimentación, cuyo caudal es de 10 L/h. La
concentración del sustrato en la alimentación es 10 mol/L. La enzima no
abandona el biorreactor debido a la ubicación de una membrana que retiene
las proteínas en la tubería de salida del mismo.

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15. Usted llevó a cabo una reacción enzimática en un reactor CSTR de 5 L. La
concentración de sustrato en la alimentación fue de 100 mmol/L y el caudal se
ajustó a 1 L/h. Después que se alcanzó el estado estacionario, la
concentración de sustrato en el efluente fue de 10 mmol/L. La enzima no
abandona el biorreactor debido a la ubicación de una membrana que retiene
las proteínas en la tubería de salida del mismo.
a. ¿Cuál es la velocidad de la reacción enzimática dentro del reactor?
b. Usted midió la concentración en estado estacionario del sustrato en el
efluente como una función del caudal de alimentación y encontró los
resultados que se consignan en la Tabla 6. Estime los parámetros cinéticos
del modelo de Michaelis-Menten usando el mejor método de linealización
que tenga en cuenta el peso de todos los puntos.

Tabla 6.
Caudal, L/h Concentración de Sustrato
en el Efluente, mmol/L
0,70 4,0
0,80 7,0
1,00 10,0
1,16 14,0