G.P. Bioqimica y Nutrición 2019-I - 20190219173200-1 PDF

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA
ACREDITADA POR SINEACE

RE-ACREDITADA INTERNACIONALMENTE
GUÍA DE PRÁCTICA
BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN
CICLO: 03
PLAN DE ESTUDIOS: 2014-2
SEMESTRE ACADEMICO: 2019-I
Código MEH-OT-01
Versión V.2
BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN Documento de Aprobación
Fecha de Aprobación 09-07-2018
GUÍA DE PRÁCTICA Nº Página 2 de 74
PRÓLOGO
La presente Guía de Práctica del Curso de Bioquímica y Nutrición 2018 es una actualización de la Guía de
Práctica 2008 elaborada por distinguido maestro Dr. Carlos Ramírez Velazco et al.
De este último se han conservado gran parte de los marcos teóricos, sobre todo de los primeras prácticas.
En el desarrollo de cada práctica en el laboratorio un profesor desarrollará el marco teórico explicando el
fundamento bioquímico de cada método y las aplicaciones que estos conocimientos en la Medicina Humana.
El método didáctico será participativo procurando que los alumnos desarrollen sus capacidades de
interpretación y mejora del pensamiento abstracto.
Durante las horas de práctica los alumnos expondrán en seminarios la investigación que han realizado en la
bibliografía, todos los alumnos deberán asistir debidamente preparados en el tema
La evaluación será continua tanto durante el marco teórico, desarrollo del procedimiento y durante los
seminarios.
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NORMAS PARA EL USO Y TRABAJO EN EL LABORATORIO

1. Realizar las prácticas de laboratorio con el debido interés y responsabilidad.
2. Presentarse vestido correctamente con su correspondiente guardapolvo y distintivo de la Universidad.
3. Poner maletines y mochilas en el estante, llevar a las mesas solo lapiceros y cuadernos.
4. Está terminantemente prohibido beber o comer dentro del laboratorio.
5. Leer cuidadosamente la guía de práctica y tener en cuenta las indicaciones de los profesores de práctica
sobre el uso del material y equipos de laboratorio, así como el orden, limpieza y seguridad que debe
mantenerse.
6. Por cada práctica de laboratorio cada mesa de trabajo presentará un único informe, el cual consta de las
siguientes partes:
- Carátula.
- Objetivos.
- Marco Teórico.
- Desarrollo Experimental.
- Discusión de los resultados.
- Conclusiones.
- Cuestionario.
- Bibliografía
Dicho informe se presentará en la siguiente práctica en el horario y grupo respectivo.
7. El inicio de la práctica es en la hora exacta programada. Se tendrá una tolerancia de 10 minutos, luego de
ese lapso de tiempo no se podrá ingresar al laboratorio, por lo tanto se le considerará como una inasistencia y
no tendrá derecho a nota de informe de prácticas.
8. Las inasistencias en las prácticas no son recuperables en ninguno de los grupos, calificándose al alumno
con nota cinco (05). Aquel alumno que acumule 30% de inasistencias no tiene derecho a nota práctica.
9. Cada alumno será integrante de una mesa de trabajo, a la cual pertenecerá a lo largo del semestre
académico.
10. Por mesa de trabajo, será nombrado un responsable que se hará cargo del material y equipos recibidos así
como de la presentación de los informes.
11. En caso de daño, deterioro o pérdida del material y/o equipos, el responsable de mesa informará del hecho
al profesor de prácticas, TODO GRUPO ES RESPONSABLE DEL DAÑO CAUSADO, y deberá repararlo a la
brevedad posible, no más de una (01) semana después del incidente.
12. Al final de la práctica, se procederá a limpiar el material usado, con el fin de entregarlo en las mismas
condiciones en las que fueron recibidos, caso contrario se le descontará un punto en la nota de informe a todo
el grupo.
13. Una vez limpio el material, el responsable de mesa lo devolverá a la persona encargada del laboratorio.
14. El laboratorio deberá quedar completamente limpio, las mesas secas y limpias, debiendo arrojar todos los
desechos al tacho de basura.
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PRÁCTICA DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN
LOGRO GENERAL: Identificar y cuantificar distintos metabolitos mediante pruebas de laboratorio. Y así
entender el rol bioquímico que dichos metabolitos cumplen en concentraciones normales y alteradas.
ESQUEMA PRÁCTICAS:
UNIDAD DIDÁCTICA
CAPACIDADES
O CAPÍTULO
PRIMERA Identificar, describir y explicar técnicas espectrofotométricas en
Bioquímica.
SEGUNDA Identificar, describir y explicar el proceso de tamponamiento

(amortiguamiento).
TERCERA Evaluación de la masa proteica visceral. Determinación de proteínas

y albúmina en suero.
CUARTA Determinación de la Glicemia e Investigación de Glucosuria.

Test de Tolerancia a la Glucosa y Glucosa Post-Prandial.
QUINTA Dosar Amilasa Sérica y Urinaria.
SEXTA Dosaje de bicarbonato sérico. Investigación de cuerpos cetónicos.
SÉTIMA Determinación de colesterol en suero, determinación de HDL, LDL,

VLDL en suero.
OCTAVA Determinación de triacilgliceroles en suero.
NOVENA Determinación de creatinina urinaria. Dosaje de Urea.
DECIMA Cuantificar bilirrubina sérica. Investigar al urobilinógeno en orina.
DÉCIMA PRIMERA Determinación de transaminasas (TGO y TGP) en suero.
DÉCIMA SEGUNDA Realizar el Balance Nitrogenado y Balance Calórico. Explicar la

importancia de la evaluación nutricional en el diagnóstico clínico.
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PRÁCTICA N°01: ESPECTROFOTOMETRÍA

LOGRO A MEDIR:
Identificar la importancia de establecer concentraciones de metabolitos en fluidos corporales.
MARCO TEÓRICO:
Se denomina Análisis Colorimétrico conjunto de métodos de análisis cuantitativos que se fundamentan en la
medición de la intensidad de la luz transmitida a través de una solución coloreada, ya sea que se trate de
sustancias naturalmente coloreadas ò que se han hecho de tal calidad mediante reacciones químicas
adecuadas.
Cuando una haz de luz (luz incidente, Io) atraviesa una solución, una parte de la radiación queda absorbida por
las moléculas del soluto coloreado, sufriendo una reducción de su intensidad (Luz transmitida, It), proporcional
a la capacidad de absorción de dichas moléculas.
Io It
Luz incidente Luz transmitida
Casi todas las sustancias en solución tienen la capacidad de absorber en forma selectiva determinadas
radiaciones luminosas unas más que otras dejándolas pasar. La longitud de onda en la que las moléculas de
dicha sustancia absorbe con mayor intensidad la luz, se denomina “longitud de máxima absorción” o “lambda
máximo”.
Si consideramos que cada molécula absorbe una determinada cantidad de luz, la intensidad de la luz
transmitida por una solución disminuirá en relación con el aumento del número de moléculas que se interpongan
entre la fuente luminosa y el observador. Este número varía de acuerdo con la concentración del soluto y el
espesor del recipiente que contiene la solución, estos factores están considerados en la “Ley de Lambert y
Beer”, que rige los principios de la colorimetrìa y cuyas formas de expresión son:
Log (Io/It) = E. I. c = A = D.O.
Donde:
Io = Intensidad de la luz incidente.
It = Intensidad de la luz transmitida.
E = Coeficiente de extinción molar, valor constante dependiendo de la naturaleza de la
sustancia y de la longitud de onda
I = Espesor del recipiente en cm.
C = Concentración de la solución.
A = D.O.=Absorbancia (A) aumenta conforme disminuye la Transmitancia (T) y la relación entre ambas es logarítmica.
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CALCULO DE LA CONCENTRACIÓN DE UNA SOLUCIÓN PROBLEMA:

Para calcular la concentración de una solución problema con el empleo de un fotocolorímetro, existen dos
formas:
- Método de la curva estándar o curva de calibración.
- Factor de calibración.
a) CURVA STANDARD.- Este método consiste en utilizar varios estándares de concentraciones
conocidas y progresivas para luego construir un gráfico en un sistema de coordenadas en el que se
colocan las lecturas en las ordenadas (Eje Y) y las concentraciones en las abscisas (Eje X). En la
recta obtenida (Función lineal), se puede extrapolar la absorbancia o densidad óptica de la muestra
problema, hallando la concentración de la misma en el eje de las abscisas.
b) FACTOR DE CALIBRACIÓN.- (Fc), El factor de calibración es un término que se relaciona con la

concentración de una sustancia con su absorbancia, es decir la intensidad que absorbe una sustancia
de concentración conocida (Standard o Patrón).
Así tenemos:
Fc = [ Standard ] / A
Donde:
Fc = factor de calibración.
A = absorbancia del tubo estándar.
[ Standard ] = concentración del estándar.
Con el factor de calibración se puede fácilmente determinar la concentración de una muestra
desconocida o problema (MP), conociendo su absorbancia.
Si la muestra problema y el estándar son procesados de la misma manera (diluciones) se podrá usar
directamente la siguiente fórmula:
[ MP ] = Amp. Fc
Si la muestra problema sufre diluciones previas se encontrará el factor de dilución (Fd) que es matemáticamente
la inversa de la dilución (dil) y esta a su vez es:
Dil = Vol mp / Vol t
Donde:
Vol mp = Volumen de la muestra problema tomada para hacer la dilución.
Vol t = Volumen total.
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Para este segundo caso cuando se quiere saber la concentración de una muestra problema se procederá
usando la siguiente fórmula:
[ MP ] = A mp . Fc . Fd
Donde:
A mp = Absorbancia de la muestra problema.
Fc = Factor de calibración.
Fd = Factor de dilución.
[ MP ] = Concentración de la muestra.
MATERIAL DIDÁCTICO:
 Disolución de Bicromato de Potasio 40 mg%.
 Agua destilada.
 Espectrofotómetro.
 Tubos de ensayo.
DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
1. Preparar la siguiente batería de tubos:

Tubo I Tubo II Tubo III Tubo IV
Bicromato de potasio 1 ml 2 ml 3 ml 4 ml
Agua destilada 9 ml 8 ml 7 ml 6 ml
Concentración (mg %)
Solución stock: Bicromato de Potasio 40 mg%.

Calcular la concentración en mg% de bicromato de K en cada uno de los tubos.
Leer las absorbancias de los cuatro tubos a 530 nm de longitud de onda (‫ )ג‬en el espectrofotómetro.
2. Con los datos obtenidos construir en un papel milimetrado la gráfica de absorbancia vs concentración
de Bicromato de Potasio .
3. Una vez obtenida la curva de calibración, medir la absorbancia de la muestra problema que el profesor
le hará entrega.
4. Obtener el factor de calibración (Fc) promedio con las soluciones estándar utilizadas para construir las
curvas de calibración ajustadas.
5. Calcular la concentración de la muestra problema por los siguientes métodos:
- Gráficamente extrapolando su absorbancia en la curva de calibración.
- Analíticamente, multiplicando su absorbancia por el factor de calibración del estándar.
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INSTRUMENTO DE EVALUACIÓN:
1.- Explique el mecanismo de funcionamiento de un espectrofotómetro.
2.- ¿Qué diferencias existen entre un fotocolorímetro y un espectrofotómetro?
3.- Grafique el espectro de luz, tanto en el rango visible como no visible con sus respectivas longitudes de
ondas.
4.- ¿Qué relación matemática existe entre Absorbancia y Transmitancia?
5.- Construya una curva de calibración con los siguientes valores:
Standard 1 Standard 2 Standard 3 Standard 4 Standard 5

Concentración 5 mg/dl 10 mg/dl 20 mg/dl 30 mg/dl 40 mg/dl
Absorbancia 0.025 0.050 0.100 0.150 0.200
Con la curva obtenida hallar la concentración de las siguientes muestras, sabiendo que sus absorbancias
fueron:
Muestra A........................0.015
Muestra B........................0.125
Muestra C........................0.350
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PRÁCTICA N°02: LOS AMINOÁCIDOS Y LAS PROTEINAS COMO ELECTROLITOS: SU CAPACIDAD

AMORTIGUADORA EN EL ORGANISMO HUMANO
LOGRO A MEDIR:
Identificar y desarrollar el efecto tampón de los amortiguadores (ácidos débiles).
MARCO TEÓRICO:
Una propiedad importante de los aminoácidos, consecuencia del hecho de que todos ellos tienen grupos
carboxilo (-COOH) y grupos amino (-NH2) es su conducta como electrolitos. Es costumbre considerar los grupos
COOH como de naturaleza ácida y los grupos NH2 como de carácter básico.
Hemos estudiado en las clases teóricas el comportamiento de los aminoácidos como iones dipolares y
la conducta de ellos durante su titulación con ácido y álcalis de modo que se comportan como verdaderas
sustancias tampones, amortiguadores ò buffers, para el sostenimiento del pH del medio interno dentro de
estrechos límites (7.35 a 7.45). Explicamos también el comportamiento amortiguador del ión dipolar glicina al
añadirle iones H+ o al añadirle OH- impidiendo las variaciones bruscas del pH sanguíneo. La representación
de un aminoácido tal como la glicina por la fórmula NH2CH2COOH sugiere que se trata de una sustancia en la
que el grupo amino actúa como una base conjugada y el grupo COOH como un ácido. Se ha observado, sin
embargo, que esta formulación no es la correcta del estado iónico de un aminoácido en solución acuosa. La
verdadera representación es aquella que dimos del ión dipolar (A) y que es la siguiente (Estructura A)
Y que es la forma en la cual se encuentran en el torrente circulatorio, es decir, al pH fisiológico (7,4) los grupos
carboxilo existen como la base conjugada, esto es, como ión carboxilato R-COO-; y al mismo pH, la mayoría
de los grupos amínicos están predominantemente en la forma protónica R-NH3+
La estructura (A) iónica es la prevalente en la sangre y en la mayoría de los tejidos. La estructura (B)
no puede existir a ningún pH. La conveniencia nos enseña sin embargo que la estructura (B) se use por razones
didácticas y para explicar la mayoría de las ecuaciones que entrañan reacciones distintas a las de los equilibrios
protónicos. La contribución más importante a la conducta de una proteína como electrolito procede de los
grupos ionizables existentes en las cadenas laterales de los aminoácidos. La curva de titulación de una proteína
ò aminoácido con ácido ò álcali vendrá determinada en gran medida por el número de cada uno de estos grupos
ionizables de las cadenas laterales de sus unidades de aminoácidos. Por estas razones las soluciones de
proteínas tienen una poderosa capacidad tampón.
Esta propiedad amortiguadora es de importancia decisiva en los sistemas biológicos y ha sido estudiada con
especial cuidado con relación a los amortiguadores de la sangre humana cuyo pH es controlado dentro de
estrechos límites, tal como les expliqué en la clase teórica. Les dije que los valores de pH sanguíneo varían
dentro de lo normal entre 7.35 a 7.45, cuando la sangre alcanza valores por debajo de 7.35 se produce acidosis;
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y cuando los valores de pH se elevan por encima de 7.45 se produce alcalosis. La sangre contiene otros dos
sistemas tampones que son:
1) El Sistema bicarbonato/Ácido carbónico (pK: 6,1)
2) El sistema fosfato monosódico/disódico (pK: 6,8)
La proteína más importante de la sangre del ser humano es la Hemoglobina que tiene gran capacidad
tampón en la proximidad del pH 7.4, lo cual se debe a su elevado contenido de histidina (grupo imidazol)
Aproximadamente el 60% de la capacidad tampón de la sangre total se debe a la Hb, y un 20% es atribuible a
las proteínas del plasma (seroalbúminas y globulinas).
Recordemos que según lo propuesto por Bronsted: un ácido es una sustancia que al ionizarse genera iones
Hidrógeno, H+, una base es toda sustancia capaz de aceptar estos iones hidrógeno. Como los ácidos ceden
protones y las bases los captan, a cada ácido le corresponde, como es lógico, una base conjugada. Es decir,
si un ácido cede un protón, el ión, así formado, puede captarlo de nuevo comportándose como base. Por lo
tanto, los procesos de cesión ò captura de protones transcurren de forma reversible:
Cesión de protones
AH A-- + H+
Ácido captación de protones Base
El ácido y la base conjugada forman un par ácido/base.

Las soluciones que contienen ácidos débiles y sus sales se llaman soluciones tampón, buffer ò amortiguadores.
Su finalidad es impedir ò amortiguar las bruscas variaciones del pH.
El pH de una solución amortiguadora puede calcularse utilizando la ecuación de Henderson-Hasselbach:
SAL
pH = pK + log ------------
ÁCIDO
A partir de esta ecuación se deduce que el pH de una disolución tampón depende de la naturaleza del ácido
que la integra y de la proporción entre la sal y el ácido (logaritmo de la relación entre ambos) y no de las
concentraciones absolutas de cada uno de estos componentes. La eficacia amortiguadora es máxima cuando
el cociente de la relación sal/ácido es próximo a la unidad.
El objetivo de la presente práctica es demostrar la capacidad tampón de un sistema amortiguador empleando
un ácido débil y la sal del ácido débil y estudiar la curva de titulación ò valoración de un ácido débil HA, como
el ácido acético (0.1N) y una base fuerte NaOH 0.1N y las variaciones del pH con respecto a diferentes
proporciones relativas entre la sal y el ácido de una solución tampón. (el pKa del ácido acético es 4.76) antes
de agregar la base, el pH se debe solamente a la presencia del ácido. Pero tan pronto como se añade algo de
la base (NaOH 0.1N), está reacciona con una cantidad equivalente del ácido y forma una cantidad equivalente
de sal y agua. El ácido débil más su sal disuelta constituyen una solución tampón (par amortiguador), cuyo pH
puede calcularse mediante el uso de la ecuación de H-H: pH = pK – log sal/ácido.
Se determinará el pH con el potenciómetro y se evaluarán los cambios en el pH con la adición de volúmenes
definidos de una base conocida (NaOH 0.1N).
Graficaremos en un sistema de coordenadas cartesianas los valores de pH vs los ml de base agregados y
obtendremos así la curva de titulación para el ácido.
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Se empleará el equipo potenciómetro para determinar el pH, instrumento que determina el pH en función de la
fuerza electromotriz (p de Nernst) de una celda formada por un electrodo de referencia, la solución problema y
un electrodo de vidrio muy sensible a los hidrogeniones.
 Potenciómetro.
 Beakers de 50 ml de vidrio (11 para cada mesa de trabajo).
 Baguetas de vidrio (3 por cada mesa).
 Pipetas de 10 ml graduadas 1/10 (3 por cada mesa).
 Agua destilada.
 Solución de CH3-COOH 0.1N.
 Solución de NaOH 0.1N.
 Papel milimetrado ò cuadriculado.
DESARROLLO DE LA PRÁCTICA:
Mezclar los volúmenes de CH3-COOH 0.1N y de NaOH 0.1N con agua destilada señalados en la tabla siguiente,
mezclar bien y luego medir el pH en cada uno de los 11 beakers con el potenciómetro:
Beaker Nº Ácido acético 0.1 N (ml) NaOH0.1N (ml) Agua destilada (ml) pH
1 10 0 10
2 10 1 9
3 10 2 8
4 10 3 7
5 10 4 6
6 10 5 5
7 10 6 4
8 10 7 3
9 10 8 2
10 10 9 1
11 10 10 0
En cada mesa los alumnos construirán su gráfica de valoración colocando en las coordenadas los
valores de pH en orden creciente y en el eje de las abscisas los volúmenes de NaOH 0.1N añadidos en cada
beaker.
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1.- Graficar la curva de valoración del ácido acético 0.1N vs. NaOH 0.1N.
2.- Identificar el punto de semi-valoración y máxima capacidad tampón.
3.- Explique que es un par tampón, como funciona y por qué las proteínas sanguíneas son
Amortiguadores.
4.- Describa las principales sustancias amortiguadoras del organismo humano.
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PRÁCTICA N°03: EVALUACIÓN NUTRICIONAL, BIOQUÍMICA Y ANTROPOMÉTRICA.

LOGRO A MEDIR:
Realizar una evaluación nutricional bioquímica y antropométrica completa y sus aplicaciones en el diagnóstico
médico clínico.
MARCO TEÓRICO:
La Evaluación Nutricional es parte de la evaluación integral del estado de salud de un individuo. Es un requisito
indispensable siempre que se desea mejorar, promover o mantener un buen rendimiento físico, un buen estado
de salud y nutrición, además de dar una idea más exacta del nivel de rendimiento que se tiene y que se puede
alcanzar.
El objetivo general de la práctica es determinar el estado nutricional mediante un diagnóstico que permita
conocer el nivel nutricional actual y anterior, y los posibles factores socio alimentario, económico y de
composición corporal, que puedan afectar la participación y rendimiento de una persona.
Otros objetivos de realizar esta evaluación son:
Detectar déficit de nutrientes específicos, riesgo de desnutrición o sobrepeso.
Brindar educación nutricional
Seleccionar personas de acuerdo a la composición corporal, orientar el trabajo físico y/o reubicar al niño
en una actividad física determinada
ESTADO NUTRICIONAL: Es la condición de salud resultante en el tiempo, del balance entre lo consumido y
lo requerido. Está determinado por la calidad y cantidad de los nutrientes consumidos y por la utilización de
estos en el organismo.
EVALUACIÓN NUTRICIONAL: Conjunto de datos antropométricos, dietarios, bioquímicos y clínicos, que

correlacionados entre sí, permiten dar un diagnóstico nutricional y por tanto orientar el tratamiento o manejo
nutricional. Una evaluación completa debe incluir:
1. Evaluación antropométrica: Estudio de la forma y composición corporal.

Determina y compara los diferentes componentes (hueso, músculo, grasa y residuo)
Analiza según patrones ideales o establecidos (edad, sexo, deporte, nivel de rendimiento)
Indispensable para intervenir en procesos de crecimiento, actividad física y estado nutricional.
- Parámetros incluidos:
Talla actual, talla/edad,
Peso actual, peso usual, peso esperado, peso/talla (Ref. NCHS, Metropolitan life)
Circunferencias (Volumen muscular)
Diámetros (estructura ósea)
Pliegues (% grasa)
2. Evaluación bioquímica: Permite conocer los niveles sanguíneos de los parámetros bioquímicos, indicadores
del estado nutricional.
Confirma datos clínicos y dietarios
Susceptible a variaciones en la interpretación según edad, sexo, factores hereditarios o consumo
inmediato de alimentos.
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Cuadro hemático (hemoglobina, hematocrito, leucocitos y linfocitos)
Proteínas totales y diferenciales (albúmina / globulinas)
Trasferrína y Ferritina
Glicemia y Perfil de lípidos
3. Evaluación Clínica: Basada en la evaluación médica.

Observa y analiza signos y síntomas clínicos que puedan indicar deficiencias nutricionales:
Sueño, fatiga, aspecto físico, piel, cabello, uñas, labios.
Apetito / hambre
Cambios de peso
Frecuencia cardiaca
Cicatrización
Lesiones frecuentes
Tiempo de recuperación de las lesiones
Comportamiento del deportista
4. Evaluación dietaria: Analiza cualitativa y cuantitativamente el consumo dietario actual, comparándolo con
la recomendación para la edad, sexo y gasto energético.
Permite orientar, prescribir, calcular y diseñar un plan alimentario adecuado, ajustado a las necesidades
nutricionales y calóricas, condición socioeconómica y hábitos del deportista.
Encuesta nutricional:
- Historia socio alimentaria
- Anamnesis alimentaria
- Conductas alimentarias
- Frecuencia de consumo de alimentos
- Antecedentes personales y familiares
Evaluación cualitativa
- Número de porciones diarias por grupos de alimentos
Evaluación cuantitativa
- Cantidad de Kcal. y nutrientes (g promedio) consumidos, promedio / día.
Determinación de la recomendación calórica y de nutrientes
- Comparar con el consumo para determinar excesos o déficit y diseñar fórmula dietaría prescrita.
- Espectrofotómetro o fotocolorímetro.
- Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados.
- Tubos o cubetas espectrofotométricas.
- Baño de agua a 37ºC.
- Reloj o timer.
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EXPERIMENTO A. DETERMOINACIÓN DE LAS PROTEÍNAS TOTALES
SIGNIFICACION CLINICA
Las proteínas son compuestos orgánicos macromoleculares, ampliamente distribuidos en el organismo,
esenciales para la vida. Actúan como elementos estructurales y de transporte y aparecen bajo la forma de
enzimas, hormonas, anticuerpos, factores de coagulación, etc.
En el plasma, las proteínas contribuyen a mantener el volumen del fluido circulante, transportan sustancias
relativamente insolubles y actúan en la inactivación de compuestos tóxicos y en la defensa contra agentes
invasores.
La determinación de proteínas totales es útil para el monitoreo de cambios ocasionados por diversos estados
de enfermedad. En condiciones patológicas como pérdidas renales, desnutrición, infecciones prolongadas, etc.,
suelen presentarse hipoproteinemias, mientras que en otras como mieloma múltiple, endocarditis bacteriana y
hemoconcentración de diversos orígenes, (ej.: deshidratación) se observan hiperproteinemias.
FUNDAMENTOS DEL METODO

Los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el ión cúprico en medio alcalino, para dar un complejo
color violeta con máximo de absorción a 540 nm, cuya intensidad es proporcional a la concentración de
proteínas totales en la muestra.
REACTIVO PROVISTO
A. Reactivo A: complejo EDTA/Cu 13 mmol/l en hidróxido de sodio 875 mmol/l y alquil aril poliéter (AAP).
REACTIVO NO PROVISTO: Calibrador A plus / Proti 2 Suero Patrón de Wiener lab.
INSTRUCCIONES PARA SU USO

Reactivo A: listo para usar.
PRECAUCIONES
El Reactivo Provisto es para uso diagnóstico "in vitro".
El Reactivo A es corrosivo. H315 + H320: Provoca irritación cutánea y ocular. P262: Evitar el contacto con los
ojos, la piel o la ropa. P305 + P351 + P338: EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Enjuagar
cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Seguir
enjuagando. P302 + P352: EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL: Lavar con agua y jabón abundantes.
P280: Llevar guantes/prendas/gafas/máscara de protección.
Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de análisis clínicos.
Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa local vigente.
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO

Reactivo Provisto: es estable a temperatura ambiente hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.
MUESTRA
Suero
a) Recolección: debe obtenerse suero libre de hemólisis.
b) Aditivos: no se requieren.
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c) Sustancias interferentes conocidas: no se observa interferencia por bilirrubina hasta 100 mg/l, ni hemólisis
ligera y en ningún caso se presenta turbiedad por quilomicrones.
Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: si no se procesa inmediatamente el suero puede
conservarse hasta 3 días en refrigerador (2-10ºC) o una semana en congelador
CONDICIONES DE REACCION
- Longitud de onda: 540 nm en espectrofotómetro o en fotocolorímetro con filtro verde (520-560 nm).
- Temperatura de reacción: 37ºC
- Tiempo de reacción: 15 minutos
- Volumen de muestra: 20 ul
- Volumen de Reactivo A: 2,0 ml (Ver PERFORMANCE)
- Volumen final de reacción: 2,02 ml
ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL

El color de la reacción es estable durante 12 horas por lo que la absorbancia debe ser leída dentro de ese lapso.
CALCULO DE LOS RESULTADOS

Empleando el Suero Patrón tal como se indica en PROCEDIMIENTO, los cálculos se realizan como sigue:
*Concentración de proteínas totales en el Calibrador A plus o en el Suero Patrón

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Curva de calibración
Para constatar que el fotocolorímetro tenga una respuesta lineal en la longitud de onda fijada para la reacción,
puede prepararse una curva de calibración con cantidades crecientes de Suero Patrón (ej.: 20 y 40 ul) con un
volumen de Reactivo A de 2,0 ml en todos los casos. Si el valor obtenido para el segundo tubo se aparta en
más de un 5% del calculado de acuerdo a la lectura del primero debe emplearse para los cálculos la curva de
calibración.
VALORES DE REFERENCIA
Se determinó el contenido de proteínas totales en suero de personas sanas, de ambos sexos, con alimentación
mixta normal y edades entre 17 y 40 años.
Se obtuvieron los siguientes rangos:
Proteínas totales: 6,1 a 7,9 g/dl
Relación A/G: 1,2 a 2,2
Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

Ver Sustancias interferentes en MUESTRA.
Puede usarse plasma como muestra, pero el resultado de la proteinemia estará incrementado en 0,2 g/dl debido
a la presencia de fibrinógeno, que no está considerado dentro de la definición de Proteínas Totales.
Linealidad: la reacción es lineal hasta 17 g/dl.

Si el instrumento usado en la lectura tuviese baja sensibilidad fotocolorimétrica, puede emplearse 20 ul de
muestra con 1,5 ml de Reactivo A. En este caso la linealidad alcanza a 12 g/dl de proteínas totales.
PARAMETROS PARA ANALIZADORES AUTOMATICOS

Para las instrucciones de programación consulte el manual del usuario del analizador en uso.
Para la calibración, se puede utilizar Calibrador A plus de Wiener lab.
EXPERIMENTO B. DETERMINACIÓN DE LA ALBÚMINA SÉRICA
Las proteínas son compuestos orgánicos macromoleculares, ampliamente distribuidos en el organismo. La
albúmina es el principal contribuyente de las proteínas totales plasmáticas.
Entre sus múltiples funciones se pueden mencionar: - transporte de una amplia variedad de sustancias como
hormonas esteroides, ácidos grasos, bilirrubina, catecolaminas, que en forma libre son insolubles en medio
acuoso; - mantenimiento de la presión coloidosmótica, que estaría relacionado con su bajo peso molecular y su
gran carga neta.
Los aumentos anormales de albúmina son ocasionales y se relacionan casi siempre con la deshidratación que
provoca la reducción en el contenido del agua plasmática.
La hipoalbuminemia ocurre en condiciones patológicas tales como pérdida excesiva de proteínas en el
síndrome nefrótico, desnutrición, infecciones prolongadas, quemaduras severas.
Otras causas son disminución en la síntesis por una dieta deficiente, enfermedad hepática o malabsorción.
Código MEH-OT-01
Versión V.2

La albúmina reacciona específicamente (sin separación previa) con la forma aniónica de la 3,3',5,5'-tetrabromo
cresolsulfonftaleína (BCF). El aumento de absorbancia a 625 nm respecto del Blanco de reactivo, es
proporcional a la cantidad de albúmina presente en la muestra.
REACTIVOS PROVISTOS
A. Reactivo A: solución de BCF 0,3 mmol/l, buffer acetato
0,1 mol/l y polioxietilén lauril éter 0,9 g/l.
REACTIVOS NO PROVISTOS
Calibrador A plus / Proti 2 Suero Patrón de Wiener lab.
Reactivo Provisto: listo para usar.
PRECAUCIONES
El reactivo es para uso diagnóstico "in vitro".
Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de química clínica.
Reactivo Provisto: es estable a temperatura ambiente hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.
MUESTRA
Suero
a) Recolección: debe obtenerse suero libre de hemólisis.
b) Aditivos: no se requieren.
c) Sustancias interferentes conocidas: no se observan interferencias por bilirrubina hasta 200 mg/l,
triglicéridos hasta 9 g/l y hemoglobina hasta 700 mg/dl.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: si no se procesa inmediatamente el suero puede
conservarse 3 días en refrigerador (2-10ºC) o una semana en congelador (-4ºC).
- Longitud de onda: 625 nm en espectrofotómetro o en fotocolorímetro con filtro rojo (620-650 nm)
- Temperatura de reacción: 15-28oC
- Volumen de Reactivo A: 2,5 ml
Código MEH-OT-01
Versión V.2
Se determinó el contenido de albúmina en suero de personas sanas, de ambos sexos, con alimentación mixta
normal y edades entre 17 y 40 años.
Se obtuvieron los siguientes rangos:
Albúmina: 3,5 a 4,8 g/dl
Relación A/G: 1,2 a 2,2

Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.
- Linealidad: la reacción es lineal hasta 7 g/dl.
1.- ¿Qué diferencias hay entre desnutrición y malnutrición?
2.- Describa todos los tipos de proteínas plasmáticas y cuáles son sus funciones.
3.- ¿Cuáles son los tipos de desnutrición que existen y como se valoran?
4.- ¿Qué es la transferrina, prealbúmina y proteína transportadora de Retinol y cuál es su rol en la valoración
del estado nutricional?
5.- ¿Qué es el Índice de Masa Corporal, como se halla y cuál es su interpretación?
Código MEH-OT-01
Versión V.2
PRÁCTICA N°04 DETERMINACIÓN DE LA GLICEMIA, INVESTIGACIÓN DE LA GLICOSURIA, TEST DE

TOLERANCIA ORAL A LA GLUCOSA.
LOGRO A MEDIR:
Evaluar y establecer condiciones bioquímicas ante las variaciones de glicemia.
MARCO TEÓRICO:
El mantenimiento de la glicemia, o concentración plasmática de glucosa, en los organismos superiores es
fundamental para el funcionamiento de todos los órganos, al ser la glucosa un metabolito energético principal.
La principal función bioquímica de la glucosa es la de proporcionar energía para los procesos de la vida. El
adenosín trifosfato ("ATP") es la fuente de energía universal para las reacciones biológicas. La oxidación de la
glucosa por las vías glucolítica y del ácido cítrico es la fuente principal de energía para la biosíntesis
del ATP.
El sistema para regular los niveles de glucosa sanguínea funciona para lograr dos fines. El primero es para
almacenar glucosa en exceso en relación a las necesidades corporales inmediatas en un reservorio compacto
(glucógeno) y el segundo es para movilizar la glucosa almacenada de manera que mantenga el nivel de glucosa
sanguínea. La regulación de la glucosa sanguínea es esencial para mantener al cerebro, cuya fuente energética
primaria es la glucosa, abastecido por una cantidad constante de la misma. La función de la insulina es desviar
la glucosa extracelular a los sitios de almacenamiento intracelular en la forma de macromoléculas (como el
glucógeno, lípidos y proteínas). Es así que la glucosa es almacenada en tiempos de abundancia para los
momentos de necesidad.
En respuesta a la baja glucosa en sangre, como en períodos de ayuno, una serie de agentes hiperglucemiantes
actúa en las vías metabólicas intermediarias para formar glucosa a partir de las macromoléculas almacenadas.
De esta forma las proteínas y el glucógeno son metabolizados para formar glucosa-6-fosfato (gluconeogénesis),
la cual es hidrolizada a glucosa en el hígado y liberada a la sangre para mantener los niveles de glucosa
sanguínea.
Los agentes hiperglucemiantes más importantes son el glucagón, la epinefrina, el cortisol, la tiroxina, la
hormona de crecimiento y ciertas hormonas intestinales. El comportamiento de cada uno de estos agentes es
diferente en la regulación de la glucosa sanguínea; mientras que la insulina favorece el metabolismo anabólico
(síntesis de macromoléculas), estas hormonas, en parte, inducen el metabolismo catabólico para romper
grandes moléculas.
Debido a que la glicemia sérica se torna anormal solo cuando hay un grave trastorno de esta interacción, al
verificar la glicemia es útil para evaluar la función e integridad del sistema.
La hipoglucemia es un trastorno caracterizado por una concentración de glucosa en ayunas, menor al límite
inferior normal para el grupo de edad y esto sucede en: enfermedad hepática, desnutrición, postgastrectomía,
tolerancia deficiente a la glucosa, administración excesiva de insulina, hipoglucemia funcional o espontánea,
ingestión de alcohol en ayunas.
La determinación de la glicemia en ayunas evalúa de modo aproximado la capacidad del organismo para
regular la glicemia y nos puede informar sobre la clase de anormalidad, si la hubiera. Para hacerla no se tomarán
alimentos ni bebida excepto agua, cuando menos 8 horas antes de tomar la muestra..
Código MEH-OT-01
Versión V.2
La coordinación de los procesos metabólicos implicados en este cometido se lleva a cabo por la relación
insulina/glucagón. La ingestión de glucosa o sustancias que la produzcan (almidón, fructosa, galactosa,
proteínas, pero no grasas) va seguida, en las personas sanas, por un aumento de la glucosa en sangre. Este
aumento origina la puesta en marcha del mecanismo regulador: aumento de la utilización de glucosa (por
Glucólisis, entre otras), aceleración de la Glucogenogénesis y disminución de la Glucogenólisis; todo ello
ocurre principalmente mediante la secreción de insulina, una hormona pancreática de tipo polipeptídica. En el
caso de que la producción de insulina esté disminuida, la glucosa no puede ser utilizada por las células, lo cual
ocasiona niveles elevados de glucosa en sangre (hiperglicemia); así ocurre en las personas que sufren
diabetes del tipo denominado "dependiente de insulina" o "tipo I".
REACTIVOS
S. Standard: solución de glucosa 100 mg/dl (1 g/l).

A. Reactivo A: viales conteniendo glucosa oxidasa (GOD), peroxidasa (POD) y 4-aminofenazona (4-AF).
B. Reactivo B: buffer fosfatos pH 7,0 conteniendo 4-hidroxi-benzoato.
Concentraciones finales
GOD (microbiana).................................................≥ 10 kU/l
POD (rábano)..........................................................≥ 1 kU/l
4-AF.....................................................................0,5 mmol/l
Fosfatos.................................................100 mmol/l, pH 7,0
4-Hidroxibenzoato................................................12 mmol/l
MATERIAL REQUERIDO
Espectrofotómetro o fotocolorímetro.
- Micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.
- Tubos o cubetas espectrofotométricas de caras paralelas.
- Reloj o timer.
Experimento A: DETERMINACIÓN DIRECTA DE LA GLICEMIA (concentración de glucosa en suero)
OBJETIVOS
1) Destacar la importancia de la glucosa en el metabolismo humano y su relación con diversas patologías.

2) Determinar la concentración de glucosa en estado basal y posprandial en
una muestra biológica mediante el método enzimático colorimétrico.
FUNDAMENTO DEL MÉTODO: COLORIMÉTRICO ENZIMÁTICO

La enzima glucoxidasa cataliza la oxidación de glucosa a gluconato y peróxido de hidrógeno. La concentración
de glucosa es proporcional al H2O2, este puede medirse apareándolo con un indicador de peroxidasa.
Código MEH-OT-01
Versión V.2
La determinación de glucosa se efectúa mediante el método de Trinder según las siguientes reacciones:
Abreviaturas: GOD. Glucosa oxidasa; POD: Peroxidasa; 4-AF: 4 aminofenzona
Superior a 124 mg/dL detectada en más de una ocasión en ayunas, además se considera también un valor
mayor a 200 mg/dl en cualquier momento son indicativos de posible Diabetes.
PREPARACIÓN
MUESTRA CLÍNICA
Suero o plasma venoso.
_ La muestra debe recolectarse en ayuno excepto por el agua, durante ocho
horas cuando menos antes de la prueba.
_ La muestra debe recolectarse en tubo colector de tapón rojo para suero el
cual no contiene anticoagulante, o de color lila el cual contiene EDTA
anticoagulante para obtener plasma.
_ La muestra debe centrifugarse a 3500 rpm durante 5 min para separar el
suero y plasma.(9)
_ La glucosa en suero o plasma es estable al menos 3 días a 2-8ºC
NOTA:
Los anticoagulantes de uso corriente como la EDTA, oxalato, heparina o
fluoruro no afectan los resultados.
La hemólisis hasta 0,3 g/dL de hemoglobina no interfiere.(14)
La muestra es inaceptable si:
a) Si el suero se obtiene turbio.
b) Si la identificación es inadecuada.
c) Si el tubo de recolección no es el adecuado.
d) Cuando se haya excedido el tiempo máximo de análisis permisible. (9)
No se han observado interferencias por hemoglobina (4 g/L); bilirrubina (20mg/L); creatinina (100mg/L), galactosa
(1g/L)
Standard: listo para usar.

Reactivo de Trabajo: reconstituir el contenido de un vial de Reactivo A con una parte de Reactivo B. Transferir
al frasco de Reactivo B, enjuagando varias veces el vial con el mismo. Mezclar hasta disolución completa.
Homogeneizar y fechar.
PRECAUCIONES
No pipetear con la boca
Código MEH-OT-01
Versión V.2
Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".


Reactivos Provistos: son estables en refrigerador (2-10ºC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.
No mantener a temperaturas elevadas durante lapsos prolongados.
Reactivo de Trabajo: en refrigerador (2-10ºC) es estable 60 días a partir de la fecha de su preparación.
INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS

REACTIVOS
Durante el uso, el Reactivo de Trabajo puede desarrollar un ligero color rosado que no afecta su funcionamiento
siempre que se procese un Blanco con cada lote de determinaciones y un Standard por lo menos una vez por
semana. Desechar cuando las lecturas del Blanco sean superiores a 0,160 D.O.
- Temperatura de reacción: 37oC
- Volumen de Reactivo de Trabajo: 1 ml
Los volúmenes de Muestra y de Reactivo pueden variarse proporcionalmente (Ej.: 20 ul Muestra + 2 ml Reactivo
de Trabajo).

El color de reacción final es estable 30 minutos, por lo que la absorbancia debe ser leída dentro de este lapso.
Código MEH-OT-01
Versión V.2
CÁLCULO DE LOS RESULTADOS
Se analizaron con Glicemia enzimática AA, 120 muestras de individuos en ayunas, de ambos sexos, con
edades comprendidas entre 20 y 45 años, provenientes de la ciudad de Rosario (Argentina), sin síntomas de
diabetes o cualquier otra enfermedad aparente. Se encontró que el 95% de los resultados cubrieron el siguiente
rango:
Suero o plasma: 70 a 100 mg/dl
En la literatura (Tietz, N.W.) se menciona el siguiente rango de referencia:
Suero o plasma
Adultos: 70 - 100 mg/dl
Niños: 60 - 100 mg/dl
Neonatos: 1 día: 40 - 60 mg/dl
mayor a 1 día: 50 - 80 mg/dl
LINEALIDAD DEL MÉTODO

El método es lineal hasta valores de 500 mg/dL.
Si la concentración de glucosa es superior, diluir la muestra a 1:2 con solución salina 0.9% y multiplicar el
resultado por 2
Experimento B: INVESTIGACIÓN CUALITATIVA DE GLUCOSA EN ORINA
FUNDAMENTO
En estado normal no existen cantidades detectables de glucosa en orina, por lo menos con los métodos
habitualmente utilizados en el laboratorio. La glucosuria (presencia de glucosa en orina) se presenta en la
diabetes mellitus pero cuando se supera el umbral renal de glucosa que ocurre cuando la glicemia es mayor de
180 mg/dl.
Para la detección cualitativa de glucosa en orina se basa en la acción de la glucosa, que reduce las sales de
cobre en medio alcalino por ebullición. Para ello utilizaremos el reactivo de Benedict el cual contiene: sulfato de
cobre, citrato de sodio y carbonato de sodio.
MATERIALES Y REACTIVOS
 Tubos de ensayo de 20 ml.
 Pipetas.
 Mechero de Bunsen.
 Reactivo de Benedict.
 Pinzas porta tubos.
Código MEH-OT-01
Versión V.2
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Tubos: I II
Orina normal (gotas) VIII ---
Orina DM (gotas) --- VIII
Reactivo de Benedict (ml) 5 5
Calentar directamente a la llama de un mechero durante 2 minutos y se deja enfriar. Si la orina contiene glucosa,
se observa un precipitado color verde, amarillo ò rojo ladrillo dependiendo de la cantidad en que se halle
presente. De ser negativa la reacción permanecerá de color azul.
Experimento C: TEST DE TOLERANCIA ORAL A LA GLUCOSA

TEST DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA Y GLUCOSA POST PRANDIAL
Definición de DM:
La diabetes mellitus es un grupo de enfermedades metabólicas caracterizadas por la presencia de hiperglicemia
resultante de un defecto en la secreción de insulina, en la acción insulínica, o en ambas.
Diagnóstico
Es muy importante el diagnóstico temprano de la enfermedad debido a que niveles elevados de glucosa, aún
cercanos al límite superior normal, producen daños en la microvasculatura de retina y riñón
Código MEH-OT-01
Versión V.2
GPA: glucosa plasmática en ayunas

POTG: prueba oral de tolerancia a la glucosa
Existen otras entidades fisiopatológicas relacionadas con hiperglicemia que no llegan a cumplir los criterios
de diabetes pero que son muy importantes ya que deben ser vigiladas ya que estos pacientes presentan riesgo
elevado de evolucionar a diabetes. Estas son la tolerancia disminuida a la glucosa y la glucosa en ayunas
anormal.
Tolerancia disminuida a la glucosa es aquel caso cuando después de una prueba de tolerancia con 75
g de glucosa se obtienen a las dos horas valores mayores a 140 y menores a 200 mg/dl.
La glucosa anormal en ayunas es aquel caso en que los valores en ayunas son mayores a
100 mg /dl pero menores a 126 mg/dl.
FUNDAMENTO TEÓRICO
Las pruebas de tolerancia a la glucosa oral fueron utilizadas por mucho tiempo para diagnóstico de
Diabetes Mellitus o intolerancia disminuida, pero ya no se utilizan de rutina, pero si pueden servir tanto para la
Diabetes como para la intolerancia. Importante es recalcar que los niveles importantes en ambos casos son los
obtenidos a las dos horas, y que la cantidad de glucosa a ingerir debe ser de 75 gramos. El disolver 75 gramos
en por lo menos 300 ml de agua hace la solución más agradable al paladar y por lo tanto tendrán más aceptación
por parte del paciente.
En caso de la prueba de tolerancia de 75 gramos en adultos, en niños se debe utilizar una cantidad de
glucosa correspondiente al peso del niño (1,75 g de glucosa por Kg. de peso). Es de suma importancia recordar
que antes de iniciar cualquier prueba de tolerancia a la glucosa oral, se debe pedir una muestra de orina al
paciente, para hacerle un análisis cualitativo glucosa. Esto debido a que si el paciente presenta glucosuria, no
se debe realizar la prueba de tolerancia, ya que la glucosuria indica en la gran mayoría de los casos, niveles
sanguíneos de glucosa elevados y la ingesta de altas concentraciones de glucosa le podría provocar al paciente
un shock hiperglicémico.
Existen otras pruebas de tolerancia que son aceptadas tanto por la Organización Mundial de la Salud como
por la American Diabetes Association, estas son las relacionadas con la Diabetes Mellitus Gestacional.
Código MEH-OT-01
Versión V.2
MATERIALES Y REACTIVOS
 Tubos de ensayo de 5 ml.
 Micropipetas automáticas de 10 uL.
 Espectrofotómetro.
 Solución patrón de glucosa (100 mg/dl).
 Reactivo de color de glucosa, que contiene: Glucosa oxidasa, peroxidasa, 4-aminofenazona, tampón
fosfato pH: 7.0
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:
Se determinará la glicemia en muestras obtenidas a una persona en forma basal, a los 30 min, 60 min y 120
min. Luego de tomar la muestra sanguínea basal se le da de tomar al paciente 75 gr. de glucosa disuelto en
300 mL de agua con unas gotas de limón. Las muestras de sangre extraídas de la persona serán centrifugadas
y se separarán los sueros. Para la determinación de las glicemias se utilizará el método de la glucosa oxidasa
– peroxidasa (GOD-POD).
Tubos: Blanco Standard Muestra Muestra Muestra Muestra

(0’) (30’) (60’) (120’)
Suero (uL) --- --- 10 10 10 10
Estándar de glucosa (uL) --- 10 --- --- --- ---
Reactivo de glucosa (ml) 1 1 1 1 1 1
Incubar los tres tubos en Baño María de 37ºC por 5 minutos. Mezclar bien. Leer las absorbancias para cada
una de los tubos en el espectrofotómetro a 505 nm.
CÁLCULOS
Encontrar la concentración de glucosa en cada una de las muestras utilizando el método del factor de calibración
ELABORACIÓN DE LA CURVA
Elaborar la curva colocando en la abscisa los tiempos y en la ordenada las concentraciones en mg/dl en papel
milimetrado y luego con la ayuda del profesor interpretarla usando el siguiente algoritmo:
Código MEH-OT-01
Versión V.2
Código MEH-OT-01
Versión V.2
1. ¿Qué es la diabetes mellitus y como se diagnostica desde el punto de vista del laboratorio?
2. Describa los métodos que existen para el dosaje de la glicemia.
3. Explique el mecanismo de acción de los reactivos de Benedict y de Fehling.
4. ¿Qué son la hemoglobina glicosilada y cuál es su importancia en la diabetes?
5. ¿Cómo sería esta curva en el caso de una persona normal, un diabético y un intolerante a la glucosa.
6. ¡¿Qué importancia tiene la detección de micro albuminuria en una persona.
7. ¿ Qué son y en qué casos se hace un dosaje de péptido C y de insulina en un paciente diabético.
8. ¿Cuáles son las complicaciones agudas y crónicas de la diabetes?
Código MEH-OT-01
Versión V.2
PRÁCTICA N°05: DOSAJE DE LA AMILASA SÉRICA Y URINARIA.

LOGRO A MEDIR:
Determinar los niveles y las funciones bioquímicas de la Amilasa.
MARCO TEÓRICO:
La amilasa, enzima del grupo de las hidrolasas, se produce principalmente en la fracción exocrina del páncreas
y en las glándulas salivales.
Su acción se dirige particularmente a escindir los enlaces alfa 1-4 glucosídicos de los polisacáridos como
almidón y glicógeno.
En pacientes con pancreatitis aguda, la amilasa sérica empieza a elevarse en las primeras 2 a 3 horas de la
enfermedad, alcanzando los valores más elevados entre las 24 y 30 horas posteriores al ataque, declinando
luego para volver a los niveles normales entre el 3º y 6º día. También se ve aumentada en este caso la excreción
urinaria de la enzima, persistiendo la hiperamilasuria 3 a 5 días, luego de que la actividad sérica ha alcanzado
los niveles normales.
También es posible encontrar valores aumentados en pacientes con ulcera gástrica o duodenal perforada,
obstrucción intestinal, obstrucción de conductos biliares, pancreatitis crónica, hipertiroidismo, carcinoma de
cabeza de páncreas, administración de opiáceos y en general cualquier caso de “abdomen agudo” o
intervención quirúrgica en regiones próximas al páncreas.
Las parotiditis bacterianas y virales, que producen bloqueo de la secreción de amilasa salival, se asocian
también con elevaciones en los niveles de amilasa sérica.
PANCREATITIS AGUDA:
Definición: Es un desorden inflamatorio del páncreas, en el cual la función pancreática normal debe ser restaurada una
vez que la causa primaria del evento agudo es superado.
Causas:
- Pancreatitis por cálculos biliares: 60% (en nuestro medio)
- Pancreatitis alcohólica: 80% (en países Anglosajones)
- Pancreatitis de causa idiopática: 30%
- Pancreatitis por tumores ampulares-coledococele-Páncreas Divisum
- Pancreatitis por condiciones metabólicas asociadas
- Hipertrigliceridemia
- Hiperparatiroidismo
- Hipercalcemia
- Hiperlipoproteinemia Tipo V; también tipos I y IV
- Pancreatitis por Toxinas (Insecticidas)
- Pancreatitis por picadura de escorpión en América del Sur y Central
- Pancreatitis por Metanol
- Pancreatitis traumática (Trauma abdominal)
- Pancreatitis Iatrogénica: ERCP, por corte esfínter de Oddi Cirugía pancreatobiliar,
transplante renal-Vasculitis- SIDA-Parasitosis
Código MEH-OT-01
Versión V.2
PANCREATITIS CRÓNICA:
Definición: Es un estado inflamatorio crónico que determina un daño irreversible de la estructura y función pancreática.
El curso clínico de la pancreatitis crónica puede consistir en ataques recurrentes agudos o una relativa progresión de
síntomas.
En 1988 la clasificación Marseilles - Roma de Pancreatitis reconoció la Pancreatitis Crónica Obstructiva subsecuente a la
pancreatitis crónica. Ésta es causada por la lesión obstructiva, es la forma más común de pancreatitis, la que se
caracteriza por cambios crónicos irreversibles.
Causas:
- Pancreatitis Alcohólica
- Pancreatitis Idiopática
- Pancreatitis Crónica Tropical
- Pancreatitis Hereditaria
- Pancreatitis por Hiperparatiroidismo
- Pancreatitis por Lesiones Traumáticas del Conducto Ductal
- Espectrofotómetro.
- Micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.
- Cubetas espectrofotométricas de caras paralelas.
- Baño de agua a la temperatura de reacción seleccionada.
- Cronómetro.
Experimento A: DETERMINACIÓN DE AMILASA EN SUERO
FUNDAMENTOS DEL MÉTODO:

α-D-maltotriósido (CNP-G3) para liberar 2-cloro-p-nitrofenol (CNP), formándose 2-cloro-nitrofenil-α-D-maltósido
(CNPG2), maltotriosa (G3) y glucosa. El CNP absorbe a 405 nm y la velocidad de aparición del color es
directamente proporcional a la actividad enzimática.
El uso de este sustrato definido, sustancia de estructura y peso molecular conocido, posibilita la expresión de
los resultados en U/l y no requiere enzimas auxiliares.
REACTIVOS:
A. Reactivo A: viales conteniendo CNP-G3.
B. Reactivo B: buffer MES pH 6; 100 mmol/l.
CNP-G3............................................................. 2,25 mmol/l
Acetato de calcio.................................................... 6 mmol/l
Cloruro de sodio................................................... 70 mmol/l
MES.................................................................... 100 mmol/l
Tiocianato de potasio......................................... 900 mmol/l
Código MEH-OT-01
Versión V.2

Reactivo B: listo para usar.
Reactivo A; preparación: reconstituir cada vial con el volumen de Reactivo B indicado en el rótulo. Tapar y
agitar hasta disolución completa.
PRECAUCIONES
El Reactivo B contiene tiocianato de potasio. H315 + H320: Provoca irritación cutánea y ocular. P262: Evitar el
contacto con los ojos, la piel o la ropa. P305 + P351 + P338: EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS:
Enjuagar cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil.
Seguir enjuagando. P302 +P352: EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL: Lavar con agua y jabón
abundantes.
Para reducir posibles contaminaciones del reactivo con amilasa salival, no debe pipetearse con la boca el
Reactivo B ni el Reactivo A reconstituido.

Reactivos Provistos: estables en refrigerador (2-10ºC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.
Reactivo A reconstituido: estable 15 días a temperatura ambiente y 60 días refrigerado (2-10ºC).
INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS

Cuando el espectrofotómetro ha sido llevado a cero con agua destilada, las lecturas de absorbancia del
Reactivo A reconstituido superior a 0,500 D.O. (a 405 nm) son indicio de deterioro del mismo.
INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS

REACTIVOS
Cuando el espectrofotómetro ha sido llevado a cero con agua destilada, las lecturas de absorbancia del
Reactivo A reconstituido superior a 0,500 D.O. (a 405 nm) son indicio de deterioro del mismo.
MUESTRA
Suero, plasma u orina
a) Recolección: si se utiliza suero, obtener de la manera usual. Separar el suero del coágulo lo más
rápidamente posible. En caso de usar plasma éste debe ser heparinizado.
Si se emplea orina, la determinación puede efectuarse en una muestra de orina ocasional.
b) Aditivos: en caso de usar plasma, debe utilizarse heparina para su obtención. Si se usa orina ver d).
c) Sustancias interferentes conocidas: hemólisis, anticoagulantes (citrato, oxalato y EDTA). En el caso de
orina no debe agregarse ácido clorhídrico como conservador.
No se observan interferencias por bilirrubina hasta 200 mg/l, hemoglobina hasta 0,5 g/dl y triglicéridos hasta 13
g/l. Referirse a la bibliografía de Young para los efectos de las drogas en el presente método.
Código MEH-OT-01
Versión V.2
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: en suero la amilasa es estable durante una semana a

temperatura ambiente (si se evita la contaminación bacteriana) o varios meses refrigerada.
En orina, si la muestra no se procesa en el día, es conveniente ajustar el pH aproximadamente a 7 (con hidróxido
de sodio) dado que el pH ácido inactiva la enzima irreversiblemente.
A pH 7 puede conservarse refrigerada por lo menos 10 días sin pérdida de actividad, si no existe contaminación
bacteriana.
- Longitud de onda: 405 nm
- Temperatura de reacción: 25, 30 ó 37oC
PROCEDIMIENTO
A) 25-30ºC
En una cubeta mantenida a la temperatura seleccionada, colocar:
Reactivo A reconstituido 2 ml
Preincubar 3-4 minutos. Luego agregar:
Muestra 100 ul
Mezclar inmediatamente y leer absorbancia luego de 1 y 2 minutos. Determinar la diferencia entre la segunda
y la primera lectura. Utilizar este valor para los cálculos.
Se pueden disminuir proporcionalmente los volúmenes usando 1 ml de Reactivo A reconstituido y 50 ul de
muestra.
B) 37oC
Como la actividad a esta temperatura es mayor, emplear 50 ul de Muestra. Seguir el procedimiento según A).
Se pueden disminuir los volúmenes usando 1 ml de Reactivo A reconstituido y 20 ul de Muestra.

Amilasa (U/l) = ΔA/min x factor*
Código MEH-OT-01
Versión V.2
Donde:
VT: volumen total
VM: volumen de muestra
b: paso óptico
εCNP: coeficiente de absortividad milimolar del CNP
10-3: factor de conversión (absortividad milimolar a micromolar)
Temperatura 25ºC 30º C* 37º C
Suero hasta 84 U/l 100 U/l 125 U/l
Orina ocasional hasta** 455 U/l 540 U/l 680 U/
* Calculados
** Estos valores de referencia se obtuvieron de una población sana (n = 40), de ambos sexos, con edades
comprendidas entre 17 y 40 años, con una dieta mixta normal, sin síntomas de enfermedad aparente.

No pipetear con la boca.
Constituye una causa de resultado erróneo la contaminación del Reactivo con saliva, dada la elevada actividad
amilásica de la misma. En tal caso, descartar el Reactivo.
Evitar el contacto con elementos de goma (tapones, contratapas) que deterioran el Reactivo A.
1.- ¿Explique cómo se produce la activación de las enzimas producidas por el páncreas exocrino?
2.- ¿En una pancreatitis qué importancia tiene el dosaje de las enzimas: lipasa, tripsina, elastasa y fosfolipasa
A2 ?
3.- Explique ¿cómo se produce la digestión completa del almidón en nuestro tubo digestivo?
4.- ¿Cuál es el cuadro clínico de una pancreatitis aguda?
5.- ¿Qué otros exámenes auxiliares se pueden realizar para confirmar el diagnóstico de pancreatitis?
Código MEH-OT-01
Versión V.2
PRÁCTICA N°06 DETERMINACIÓN DEL BICARBONATO SÉRICO Y CUERPOS CETÓNICOS EN ORINA.

CETOACIDOSIS DIABÉTICA.
LOGRO A MEDIR:
Aprender a interpretar los niveles de bicarbonato sérico y presencia de cuerpos cetónicos en la orina
en la Cetoacidosis diabética
MARCO TEÓRICO:
La Diabetes Mellitus se caracteriza por hiperglicemia y otros desarreglos que se deben a una inadecuada acción
de la Insulina sobre los tejidos corporales, ya sea porque exista un reducido nivel circulante de Insulina o una
resistencia de los tejidos blanco a sus acciones .La Diabetes se divide en dos categorías –
a) Diabetes Tipo I o Diabetes Insulino dependiente ó Diabetes juvenil (llamada así porque se inicia en la
juventud) y la Diabetes tipo II o no Insulino dependiente (diabetes de inicio en la edad madura). Puede haber
tipos intermedios que se superponen.
(A)LA DIABETES TIPO I afecta al 10 % de los pacientes diabéticos y la dependencia de la Insulina significa
que no solamente que la insulina es necesaria para el óptimo control de la glucosa sanguínea, que también
podría ser cierto para la forma tipo II, sino que “sin Insulina exógena el paciente es más proclive a desarrollar
CETOACIDOSIS diabética.
(1) Se sabe que esto refleja una completa o casi ausencia de insulina en estos pacientes, en contraste con
la falta parcial de insulina o la resistencia a la insulina característica de los pacientes del tipo II.
(2) Otra característica clave de los pacientes con Diabetes tipo I es su presencia en niños y adultos jóvenes
y su presencia en las personas más bien delgadas que obesas.
(B) LA DIABETES TIPO II comúnmente afecta a las personas de edad madura, y con sobrepeso.
(1) Como algo de insulina es producida en estos pacientes, no se produce cetoacidosis
(2) Sin embargo puede ser necesario el tratamiento con insulina para prevenir la severa hiperglicemia.
Debemos saber desde ahora que se puede producir Diabetes secundaria ó alterarse la tolerancia a la glucosa
de modo secundario a ciertas enfermedades que afectan la producción ó la acción de la Insulina, tales como
la pancreatitis crónica, el Síndrome de Cushing, la acromegalia, la alteración de los receptores de insulina y
otras.
El síntoma más común que produce la hiperglicemia es la poliuria (Aumento del volumen urinario) y la
polidipsia (incremento en la ingesta de agua), lo cual se debe a la diuresis osmótica inducida por la glucosa. El
incremento en la ingesta de agua es una respuesta a deshidratación y sed...Se produce disminución de peso
corporal, debido a la pérdida de glucosa por la orina y a los efectos catabólicos de la disminución de la acción
de la insulina, a pesar de la mayor ingesta de alimentos (Polifagia).La debilidad generalizada refleja las
alteraciones metabólicas .Las infecciones de la piel, vulva y tracto urinario son frecuentes sobre todo en los
casos no controlados debido a que la hiperglicemia disminuye la resistencia a las infecciones. Las alteraciones
en la retina son precoces.
CET0ACIDOSIS DIABETICA:
Se produce en los diabéticos insulinodependientes cuyo nivel de insulina circulante es insuficiente para permitir
una utilización de la glucosa por los tejidos periféricos y para inhibir la producción de glucosa y el catabolismo
tisular. El incremento del Glucagon y el aumento de las hormonas que aumentan en respuesta al stress (como
la adrenalina, noradrenalina, cortisol y hormona del crecimiento) contribuyen a los desarreglos metabólicos. La
insuficiente cantidad de insulina reduce la utilización periférica de glucosa y junto con el exceso de glucagón
incrementan la producción hepática de glucosa a través de la estimulación de la gluconeogénesis y la
Código MEH-OT-01
Versión V.2
glucogenolisis y la inhibición de la glicólisis. La degradación de las proteínas en los tejidos periféricos suministra
un flujo de aminoácidos hacia el hígado como substrato para la gluconeogénesis. El resultado es la
hiperglicemia .La diuresis osmótica resulta de la elevación de la glucosa (y cuerpos cetónicos) y genera
hipovolemia, deshidratación y pérdida de sodio, fosfato de potasio y otras substancias por la orina. La depleción
del volumen estimula la liberación de catecolaminas lo cual se opone a la acción de la insulina en el hígado y
contribuye a la LIPÓLISIS.
CETOGÉNESIS:
La lipólisis acentuada que resulta de la falta de insulina y del exceso de catecolaminas moviliza los ácidos
grasos libres desde sus depósitos en el tejido adiposo y en lugar de reesterificarse con el glicerol para formar
triacilgliceroles, el hígado desvía sus rutas metabólicas hacia la producción de cuerpos cetónicos. El glucagón
incrementa el nivel de la carnitina, que capacita a los ácidos grasos a entrar en la mitocondria, donde ellos
sufren beta oxidación hacia cuerpos cetónicos. Además el glucagón disminuye el contenido hepático de malonil
CoA, que es un inhibidor de la oxidación de ácidos grasos.
ACIDOSIS: El incremento de la producción hepática de cuerpos cetónicos (acetoacetato y beta hidroxibutírico)

excede la capacidad corporal de metabolizarlos ó excretarlos. Sus H+ son tamponados por el bicarbonato,
conduciendo a una caída del bicarbonato sérico y del pH sanguíneo. Se encontrará entonces: hiperglicemia,
hipercetonemia, acidosis metabólica, disminución del bicarbonato, disminución del pH sanguíneo y presencia
en la orina de glucosa (glucosuria) y cuerpos cetónicos ó cetonuria.
OBJETIVO DE LA PRÁCTICA.-
Aprender a interpretar los niveles de bicarbonato sérico, pH sanguíneo y presencia de cuerpos cetónicos en la
orina en presencia de Cetoacidosis Diabética.
Reactivos y materiales:
HCl 0.01 N
NaOH 0.01 N
Fenoltaleína 20 mg% solución alcohólica
Alcohol corriente ó caprílico.
Muestras problemas de bicarbonato para titularlas...
Pipetas de 5 ml graduadas al décimo
Pipetas de 1 ml graduadas al centésimo
Beakers de vidrio de 100 ó 50 ml
Baguetas de vidrio
Baño María de 37°C
Reloj de intervalos
EXPERIMENTO A::
DOSAJE DE BICARBONATO SÉRICO
Método:
En un beaker de vidrio colocar:
Código MEH-OT-01
Versión V.2
5 ml de HCl 0.01 N
1 ml de suero
2 gotas de alcohol
Agitar y luego reposo 2 min.
Añadir 3 gotas del indicador fenoltaleína.
Colocar a 37° C en Baño Maria por 10 minutos.
Titular con NaOH 0.01N, hasta obtener un color rosado pálido.
Anotar la cantidad de NaOH gastado.
Cálculos:
(5 - X ml gastados de NaOH en la titulación) x 10 = mMol/ Litro de HCO3-
Considerar que:
a) 1ml de NaOH 0.01 N equivale 0.01 mEq HCO3 --
b) Vol. de muestra usada en la titulación: 1 ml
c) Expresar los valores de HCO3-- en mMol/Litro
Valores Referenciales (Normales): 22 á 34 mMol/Litro
EXPERIMENTO B: INVESTIGACIÓN DE CUERPO CE TÓNICOS en la ORINA
Test de Rothera.- Esta prueba depende de la la reacción entre la Acetona y el Nitroprusiato para formar un
complejo coloreado púrpura rojizo. Indica la presencia de acetoacetato y/o acetona.
Reactivos:
Cristales de sulfato de amonio
Solución de Nitroprusiato al 10% en solución acuosa, la cual deberá ser fresca.
Amoniaco solución (Hidróxido de amonio concentrado)
Muestra problema: orina
Tubos de prueba de vidrio de 13x 100 mm aproximadamente
Pipetas Pasteur capilares ó pipetas de vidrio de 1 ml terminales
Espátulas ó bajalenguas de madera.
Baguetas de vidrio.
Procedimiento:
NO SE DEBERÁ PIPETEAR NINGÚN REACTIVO CON LA BOCA. PROHIBIDO HACERLO. Colocar
aproximadamente 2 ml de orina en un tubo de prueba y añadirle con la espátula aproximadamente 0.5 g de
sulfato de amonio en cristales. Disolver con bagueta. Añadir 2 á 3 gotas de sol. Nitroprusiato 10%. Mezclar
bien
Por la pared lateral del tubo de prueba, sin pipetear con la boca, lentamente, en zona deslizar el amoniaco con
una pipeta Pasteur o pipeta de vidrio. Deberán quedar dos capas bien definidas. Esperar unos minutos y ver
la formación de un anillo morado en la interfase en caso positivo para cuerpo cetónicos .Si no aparece este
color la prueba es negativa.
Código MEH-OT-01
Versión V.2
1.- Explique la formación de cuerpos ce tónicos y porque se producen.
2.- Explique las diferencias entre cetoacidosis diabética y coma hiperosmolar.
3.- ¿Cómo se diagnostica a un paciente que está en cetoacidosis diabética?
4.- ¿A qué llama: exceso de bases y reserva alcalina?
5.- Explique los diferentes métodos de laboratorio que existen para el dosaje tanto de bicarbonato en sangre
como de cuerpos ce tónicos en orina.
Código MEH-OT-01
Versión V.2
PRÁCTICA N°07 PERFIL LIPIDICO: COLESTEROL TOTAL Y FRACCIONADO

LOGRO A MEDIR:
Describir las concentraciones de las fracciones lipídicas en sangre y sus alteraciones.
MARCO TEÓRICO:
El nivel sérico de colesterol ha sido objeto en los últimos años de numerosas investigaciones tanto en individuos
sanos como enfermos.
Desde un punto de vista médico la determinación de colesterol en forma aislada tiene utilidad diagnóstica
limitada. Sin embargo, su concentración varía de manera más o menos predecible en un gran número de
condiciones clínicas. Se ha visto que el colesterol es uno de los factores contribuyentes a la formación de
ateromas dado que las complicaciones arterioscleróticas prevalecen en individuos hipercolesterolémicos.
Diversos estudios epidemiológicos han permitido observar además, que el riesgo de contraer enfermedad
cardiaca coronaria (ECC) para los individuos (varones de más de 40 años) con colesterolemia menor ò igual a
200 mg% es 3 veces menor que entre individuos con más de 230 mg% y 6 veces menor que entre individuos
con más de 260 mg%.
Sin embargo, actualmente se sabe que es necesario conocer además la distribución de las lipoproteínas
encargadas del transporte: HDL (lipoproteínas de alta densidad), considerada como el “factor protector” y LDL
(lipoproteínas de baja densidad), consideradas como el verdadero “factor de riesgo”. Las funciones biológicas
inherentes a los distintos grupos de lipoproteínas, las variaciones en su composición y los resultados de los
diversos estudios epidemiológicos, indican que los valores aislados de colesterol HDL y colesterol LDL no
pueden tomarse como índices predictivos de riesgo, sino que es necesario conformar un perfil lipídico con los
valores de colesterol total, colesterol LDL y colesterol HDL.
- Tubos o cubetas espectrofotométricas de caras paralelas.
- Reloj o timer.
Experimento A: DETERMINACIÓN DE COLESTEROL EN SUERO
Fundamentos del Método:
El colesterol es oxidado enzimáticamente por colesterol oxidasa (CHOD), previa hidrólisis enzimática de los
ésteres mediante una lipasa de origen fungal. El agua oxigenada generada en la oxidación, produce la
copulaciòn oxidativa del fenol con la 4-aminofenazona (4-AF) mediante una reacción catalizada por la
peroxidasa. El producto es una quinonimina roja con absorbancia máxima a 505 nm.
Código MEH-OT-01
Versión V.2
REACTIVOS:
Standard: solución de colesterol 200 mg%
A Reactivo A: viales con colesterol esterasa (CHE), colesterol oxidasa (CHOD), peroxidasa (POD) y 4-
aminofenazona (4-AF).
B. Reactivo B: solución de buffer Good pH 6,8, conteniendo fenol y colato de sodio.
CHE........................................................................≥100 U/l
CHOD....................................................................≥ 100 U/l
POD.....................................................................≥ 1000 U/l
4-AF.....................................................................0,2 mmol/l
Good........................................................ 50 mmol/l; pH 6,8
Fenol....................................................................15 mmol/l
Colato de sodio...................................................0,2 mmol/l

Reactivo de Trabajo: reconstituir el contenido de un vial de Reactivo A con una parte de Reactivo B. Transferir
al frasco de Reactivo B, enjuagando varias veces el vial con el mismo. Mezclar hasta disolución completa.
Homogeneizar y fechar.
PRECAUCIONES
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DEALMACENAMIENTO

Reactivo de Trabajo: en refrigerador (2-10ºC) es estable 60 días a partir del momento de su preparación.

Lecturas del Blanco superiores a 0,160 D.O. son indicio de deterioro de los reactivos. En tal caso desechar.
MUESTRA
Código MEH-OT-01
Versión V.2
Suero o plasma
a) Recolección: se debe obtener de la manera usual.
b) Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma, se recomienda únicamente el uso de heparina
como anticoagulante para su obtención.
c) Sustancias interferentes conocidas:
Excepto la heparina, los anticoagulantes comunes interfieren en la determinación.
- Los sueros con hemólisis visible o intensa producen valores falsamente aumentados por lo que no deben ser
usados.
- No se observan interferencias por bilirrubina hasta 80 mg/l, ácido ascórbico hasta 75 mg/l, ácido úrico hasta
200 mg/l, ni hemólisis ligera.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el colesterol en suero es estable por lo menos 1 semana
en refrigerador y 2 meses en congelador, sin agregado de conservantes.
- Temperatura de reacción: 37ºC
- Volumen de Reactivo de Trabajo: 1 ml
Los volúmenes de Muestra y Reactivo pueden variarse proporcionalmente (Ej.: 20 ul de Muestra + 2 ml de Reactivo de
Trabajo o 50 ul + 5 ml).
Código MEH-OT-01
Versión V.2
El panel de expertos del National Cholesterol Education Pro-gram (NCEP) provee los siguientes valores de
colesterol:
Deseable: < 2,00 g/l
Moderadamente alto: 2,00 - 2,39 g/l
Elevado: ≥ 2,40 g/l
No obstante, se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios intervalos o valores de referencia.
El panel de expertos del National Cholesterol Education Pro-gram (NCEP) provee los siguientes valores de
colesterol:
Deseable: < 2,00 g/l
Moderadamente alto: 2,00 - 2,39 g/l
Elevado: ≥ 2,40 g/l
Experimento B: DETERMINACIÓN DE COLESTEROL HDL EN SUERO

Fundamentos del Método
El presente es un método birreactivo homogéneo para la determinación de HDL-colesterol. En la primera
etapa de la reacción se solubiliza y consume el colesterol libre asociado a proteínas distintas de HDL, en una
reacción que involucra a colesterol oxidasa (CHO) y catalasa (CAT), dando lugar a un producto no coloreado.
En una segunda etapa, un agente específico (azida) bloquea la acción de CAT y un detergente solubiliza
específicamente las HDL. El HDL-colesterol es así liberado para reaccionar con colesterol esterasa (CHE),
CHO, 4-AAP (4-amino antipirina) y N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3-toluidina disódica (TOOS), dando un
producto coloreado que se lee a 540-600 nm.
Código MEH-OT-01
Versión V.2

Reactivos A y B: listos para usar.
Calibrador: reconstituir con el volumen de agua destilada indicado en el rótulo. Tapar el vial y dejar en reposo
durante 5 minutos. Ayudar a la disolución rotando el vial suavemente, evitando la formación de espuma. No
agitar.
PRECAUCIONES
- Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".
- No pipetear con la boca.
-El Calibrador ha sido examinado para HBsAg, HCV y anticuerpos contra HIV 1/2, encontrándose no reactivo.
No obstante, debe procesarse como si se tratara de material infectivo.
- Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de química clínica.
- Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa local vigente.

Los Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10ºC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.
No Congelar. Una vez abiertos los reactivos son estables durante 3 semanas en refrigerador (2-10ºC).
Una vez reconstituido, el Calibrador es estable 1 semana en refrigerador (2-10ºC) o 1 mes congelado (-20ºC),
evitando descongelar y volver a congelar.
MUESTRA
Suero o plasma
a) Recolección: obtener la muestra de la manera usual.
b) Aditivos: heparina o EDTA cuando se utilice plasma como muestra.
c) Sustancias interferentes conocidas: no se observan interferencias por ácido ascórbico hasta 24 mg/dl,
hemoglobina hasta 1000 mg/dl, bilirrubina hasta 80 mg/dl, ni triglicéridos hasta 3000 mg/dl (ver
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO).
Código MEH-OT-01
Versión V.2
c) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: centrifugar y separar el suero del coágulo dentro de las
3 horas posteriores a la extracción. De no procesar las muestras inmediatamente, las mismas pueden ser
conservadas durante 1 semana en refrigerador (2-10ºC).
MATERIAL REQUERIDO (no provisto)

- Material volumétrico para medir los volúmenes indicados
- Analizador automático
CALIBRACION
El Calibrador debe procesarse de la misma manera que las muestras. Las concentraciones del Calibrador se
encuentran alrededor de los niveles de decisión médica y son variables lote a lote (ver título en el rótulo).
Ingresar el valor de concentración del calibrador cada vez que se cambie de lote.
Los valores esperados de HDL-colesterol son los siguientes:
Varones: 30 - 70 mg/dl
Mujeres: 30 - 85 mg/dl
El panel de expertos del National Cholesterol Education Program (NCEP) provee los siguientes valores de HDL-
colesterol: 40 - 60 mg/dl
Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. No obstante, valores
mayores de 40 mg/dl se consideran recomendables y los que se encuentren por encima de 60 mg/dl se han
considerado como protectores. Por el contrario, valores de HDL-colesterol por debajo de 40 mg/dl se
consideran como índice significativo de riesgo de enfermedad cardíaca coronaria.

No deben emplearse anticoagulantes que contengan citrato.
No exponer los reactivos a la luz.
Conservar los reactivos de acuerdo a las instrucciones.
En caso de muestras con concentraciones de triglicéridos mayores a 3000 mg/dl, diluir las mismas con solución
fisiológica.
Código MEH-OT-01
Versión V.2
Linealidad: la reacción es lineal hasta 150 mg/dl. Para valores superiores, diluir la muestra con solución
fisiológica y multiplicar el resultado por el factor de dilución empleado.
Experimento C: DETERMINACIÓN DE COLESTEROL LDL EN SUERO

El presente método es un ensayo homogéneo sin precipitación, en dos pasos. En el primero, se agrega un
tensoactivo (Reactivo A) que solubiliza las partículas lipoproteìcas no-LDL. El colesterol liberado es consumido
por la colesterol esterasa y la colesterol oxidasa en una reacción sin desarrollo de color. Un segundo
tensoactivos (Reactivo B) solubiliza las partículas de LDL formándose, por la presencia de enzimas y un
Reactivo cromogénico, un color proporcional a la cantidad de LDL colesterol presente en la muestra.
REACTIVOS PROVISTOS
A. Reactivo A: solución conteniendo colesterol esterasa 1000 U/l, colesterol oxidasa 1200 U/l, peroxidasa 1250
U/l, Ascorbato oxidasa 3000 U/l, 4-aminoantipirina 1 g/l y tensoactivos 7 g/l en buffer MES 50 mM.
B. Reactivo B: solución conteniendo N,N-bis-(4-sulfobutil)-m-toluidina disódica (DSBmT) 0,4 g/l y tensoactivo
10 g/l en buffer MES 50 mM.
Calibrador: suero humano liofilizado conteniendo lipoproteínas de diversos tipos incluyendo LDL. La
concentración es variable lote a lote (ver título en el rótulo).

Reactivos A y B: listos para usar.
Calibrador: reconstituir con el volumen de agua destilada indicado
en el rótulo. Cerrar el vial y dejar 5 minutos. Luego disolver el contenido del vial por agitación suave evitando
la formación de espuma.
PRECAUCIONES
- Los Reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".
- No pipetear con la boca.
- El Calibrador ha sido examinado para HBsAg, HCV y anticuerpo contra HIV 1/2, encontrándose no Reactivo.
No obstante debe procesarse como si se tratara de material infectivo.
- Utilizar los Reactivos guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de química clínica.
- Todos los Reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a la normativa local vigente.

Los Reactivos Provistos son estables en refrigerador (2-10ºC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.
No congelar.
Una vez abierto los Reactivos son estables durante 4 semanas en refrigerador (2-10ºC).
Calibrador: estable en refrigerador (2-10ºC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja. Una vez
reconstituido es estable 2 semanas en refrigerador (2-10ºC). Puede fraccionarse en alícuotas debiendo ser
conservado a -80ºC.
MUESTRA
Suero o plasma
a) Recolección: obtener la muestra de la manera usual.
b) Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma usar EDTA o heparina como anticoagulantes.
Código MEH-OT-01
Versión V.2
c) Sustancias interferentes conocidas: no se encuentran interferencias por ácido ascórbico hasta 50 mg/dl,
hemoglobina hasta 500 mg/dl, bilirrubina hasta 20 mg/dl y γ-globulina hasta 50 g/l. En caso de muestras con
concentraciones superiores de interferentes, deberán diluirse con solución fisiológica antes de proceder a su
ensayo, multiplicando el resultado obtenido por la dilución efectuada.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: centrifugar y separar el suero del coágulo dentro de las
3 horas posteriores a la extracción. De no procesar las muestras inmediatamente, las mismas pueden ser
conservadas durante 5 días en refrigerador (2-10oC).
CALIBRACION
El Calibrador debe procesarse junto con las muestras y en la misma forma que éstas. Las concentraciones del
Calibrador se encuentran alrededor de los niveles de decisión médica y son variables lote a lote (ver título en
el rótulo). Ingresar el valor de concentración del calibrador cada vez que se cambie de lote.

LDL colesterol (mmol/l) = LDL colesterol (mg/dl) x 0,02586
El panel de expertos del National Cholesterol Education Program (NCEP) provee los siguientes valores de LDL colesterol
en relación al riesgo de contraer enfermedad cardíaca coronaria (ECC):
- Riesgo bajo o nulo (sujetos normales): valores de LDL colesterol menores de 129 mg/dl.
- Riesgo moderado a elevado (individuos con probabilidad de contraer ECC): valores entre 130 y 189 mg/dl.
- Riesgo muy elevado (individuos sospechosos de padecer ECC): valores de LDL colesterol ≥ 190 mg/dl.
No obstante, es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.

No deben emplearse anticoagulantes que contengan citrato.
Código MEH-OT-01
Versión V.2
1.- ¿Qué es Riesgo Coronario y cómo se calcula?
2.- Explique ¿qué diferencias hay entre la arteriosclerosis y la ateroesclerosis?
3.- Describa la biosíntesis de colesterol dentro del organismo.
4.- Explique ¿qué es el colesterol VLDL y cómo se calcula?
5.- ¿Qué rol cumplen los triglicéridos y cómo se realiza su metabolismo?
Código MEH-OT-01
Versión V.2
PRÁCTICA N°08 PERFIL LIPÍDICO II: TRIGLICÉRIDOS.

LOGRO A MEDIR:
Explicar las rutas metabólicas de loa ácidos grasos, triacilgliceroles y sus alteraciones
MARCO TEÓRICO:
Los triglicéridos forman la mayor parte del peso seco del tejido adiposo, constituyendo por lo tanto una potente forma de
almacenamiento de energía.
El movimiento de ácidos grasos entre los distintos compartimientos del organismo, se produce con gran rapidez en
respuesta a diversos estímulos (dieta, actividad física, stress, edad, etc.). Por este motivo es de esperar que los
triglicéridos (uno de los màs importantes vehículos para el transporte de ácidos grasos) varíen también su concentración
en respuesta a estos factores fisiológicos.
Sin embargo, el equilibrio de estos mecanismos puede verse alterado, conduciendo a niveles anormales de triglicéridos
circulantes. La persistencia de esta condición, se asocia con numerosas patologías, tales como enfermedad hepática,
renal, hiperlipidemias esenciales, etc.
Un caso que resulta de particular interés es el aumento de triglicéridos en individuos obesos, en los cuales tiene
importancia pronostica, respecto a la probabilidad de desarrollar enfermedad cardíaca coronaria. Alrededor del 50% de
los lípidos de las lesiones ateromatosas que ocurren en las arterias coronarias son triglicéridos, por lo que es posible
relacionar a los triglicéridos con la patogénesis de la arteriosclerosis coronaria. Este punto de vista está sustentado por
el hecho de que un gran porcentaje de pacientes con infarto de miocardio también exhiben Hipertrigliceridemia.
Para la determinación de triglicéridos en suero se usará la determinación enzimática de glicerol a partir de glicéridos.
Los métodos enzimáticos se basan en la determinación del glicerol contenido en las moléculas de los triglicéridos, tras la
hidrólisis (química ó enzimática) para remover los ácidos grasos. La determinación enzimática del glicerol ha sido usada
durante muchos años; sin embargo, en estos métodos se empleaba la hidrólisis alcalina de los triglicéridos. El reciente
desarrollo del uso de enzimas (lipasa, usualmente combinada con una proteasa) para catalizar la hidrólisis, ha posibilitado
el empleo de métodos directos, rápidos y específicos. Los sistemas totalmente enzimáticos eliminan el uso de reactivos
caústicos, extracción con solventes, baños de altas temperaturas y mezclas de absorción para la remoción de
Fosfolípidos. Estudios recientes se han concentrado en desarrollar reactivos con lipasas, que hidrolizan completamente
los triglicéridos.
- Espectrofotómetro o fotocolorímetro.
- Tubos o cubetas espectrofotométricas.
- Baño de agua a 37oC.
- Reloj o timer.
Experimento A: DETERMINACIÓN DE TRIGLICÉRIDOS EN SUERO

Se producen reacciones químicas basadas en la determinación química de glicerol a partir de glicéridos.
La primera etapa consiste en que los triglicéridos son hidrolizados enzimáticamente por una lipoproteinlipasa
específica, produciendo glicerol y ácidos grasos.
Código MEH-OT-01
Versión V.2
Lipoprotein lipasa
Triglicéridos Glicerol + 3 àcidos grasos
En una segunda etapa el glicerol se fosforila a glicerol-1-fosfato en presencia de glicerolkinasa.
Glicerol kinasa
Glicerol + ATP Glicerol-1-P + ADP
En una tercera etapa el derivado fosforilado se oxida mediante l glicerolfosfato oxidasa (GPO), con producción
de agua oxigenada.
GPO
Glicerol-1-fosfato + O2 H2O2 + dihidroxiacetonafosfato
Finalmente el agua oxigenada así formada produce la unión oxidativa del fenol y la 4-aminofenazona, en
reacción catalizada por la peroxidasa (POD), con formación de una quinonimina roja.
POD
2 H2O2 + 4-AF + clorofenol quinonimina roja
REACTIVOS PROVISTOS:
REACTIVOS PROVISTOS
A. Reactivo A: viales conteniendo lipoprotein lipasa, glicerol kinasa (GK), glicerol fosfato oxidasa (GPO),
peroxidasa (POD), adenosina trifosfato (ATP) y 4-aminofenazona (4-AF).
B. Reactivo B: solución de buffer Good conteniendo clorofenol, pH 7,5.
S. Standard: solución de glicerol 2,26 mmol/l (equivale a 2 g/l de trioleína).
Good........................................................50 mmol/l; pH 7,5
clorofenol................................................................2 mmol/l
lipoprotein lipasa...................................................≥ 800 U/l
GK.........................................................................≥ 500 U/l
GPO....................................................................≥ 1500 U/l
POD.......................................................................≥ 900 U/l
ATP.........................................................................2 mmol/l
4-AF.....................................................................0,4 mmol/l
Código MEH-OT-01
Versión V.2

Standard: listo para usar.
Reactivo de Trabajo:
- 5/10 x 20 ml: agregar 20 ml de Reactivo B a un vial de Reactivo A. Mezclar hasta disolución completa. Homoge-
neizar y fechar.
- 4 x 50 ml: reconstituir el contenido de un vial de Reactivo A con una porción de Reactivo B y luego transferir
al frasco de Reactivo B enjuagando varias veces. Homogeneizar y fechar.
PRECAUCIONES

Reactivos Provistos: son estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.
No mantener a temperaturas elevadas durante lapsos prolongados.
Reactivo de Trabajo: es estable 30 días en refrigerador (2-10ºC).

El Reactivo de Trabajo puede presentar una coloración rosada que no afecta su funcionamiento.
Lecturas del Blanco superiores a 0,160 D.O. o lecturas del Standard anormalmente bajas, son indicios de
deterioro del Reactivo. En tal caso, desechar.
MUESTRA
Suero o plasma
a) Recolección: previo ayuno de 12 a 14 horas, obtener suero o plasma. Separar de los glóbulos rojos dentro
de las 2 horas de extracción.
b) Aditivos: en caso de emplear plasma, se recomienda el uso de Anticoagulante W o heparina para su
obtención.
c) Sustancias interferentes conocidas: los sueros con hemólisis intensa o marcadamente ictéricos producen
resultados erróneos, por lo que no deben ser usados.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: los triglicéridos en suero son estables 3 días en
refrigerador (2°C -10°C). No congelar.
INSTRUCCIONES DE PRECONSTITUCIÓN Y MEZCLADO:

- Standard: listo para usar.
- Reactivo de trabajo:
5/10 x 20 ml: agregar 20 ml de Buffer a un vial de Enzimas.
Mezclar hasta disolución completa. Homogenizar y fechar.
4 x 50 ml: reconstituir el contenido de un vial de Enzimas con una porción de Buffer y luego transferir al frasco
de Buffer enjuagando varias veces. Homogenizar y fechar.
Código MEH-OT-01
Versión V.2
- Longitud de onda: 505 nm en espectrofotómetro o 490-530 nm en fotocolorímetro con filtro verde.
- Temperatura de reacción: 37oC
- Volumen de reactivo: 1 ml

El color de reacción final es estable 60 minutos, por lo que la absorbancia debe ser leída dentro de este lapso.

Corregir las lecturas con el Blanco de reactivos y usar las lecturas corregidas para los cálculos.
CONVERSION DE UNIDADES
Triglicéridos (g/l) = 0,01 x Triglicéridos (mg/dl)
Triglicéridos (mg/dl) x 0,0113 = Triglicéridos (mmol/l)
El panel de expertos del National Cholesterol Education Program (NCEP) provee los siguientes valores de
Triglicéridos:Deseable: < 1,50 g/l
Moderadamente elevado a elevado: 1,50 - 1,99 g/l
Elevado: 2,00 - 4,99 g/l

Muy elevado: ≥ 5,00 g/l

Código MEH-OT-01
Versión V.2
Los reductores disminuyen la respuesta de color, mientras que los oxidantes colorean el Reactivo aumentando
los Blancos.
Las contaminaciones con glicerol producen resultados falsamente aumentados.
Linealidad: la reacción es lineal hasta 10 g/l de triglicéridos. Para valores superiores, repetir la determinación
con muestra diluida 1:2 con solución fisiológica. Multiplicar el resultado obtenido por la dilución efectuada
1.- Describa las características principales de los lípidos y su clasificación.
2.- Explique la importancia biológica de los triglicéridos.
3.- ¿Cómo se produce la digestión y absorción de los triglicéridos?
4.- Mencione la proporción de triglicéridos dentro de las lipoproteínas y la acción de la lipasa lipoproteìca.
5.- Enumere los diferentes métodos tanto químicos como enzimáticos para el dosaje de triglicéridos.
Código MEH-OT-01
Versión V.2
PRÁCTICA N°09 MASA PROTEICA VISCERAL Y ESQUELÉTICA.

LOGRO A MEDIR:
Explicar el compartimiento proteico visceral y proteico esquelético. Desarrollar el balance
nitrogenado.
MARCO TEÓRICO:
Para evaluar el estado nutricional de una persona utilizamos el metabolismo proteico (síntesis y degradación).
Las proteínas en el organismo se distribuyen didácticamente en dos compartimientos:
a) Compartimiento Proteico Visceral.
b) Compartimiento Proteico Somático ò esquelético.
Las proteínas del compartimiento visceral se evalúan mediante los niveles de Transferrina, Pre-
albúmina, Proteínas totales y Albúmina en suero, que por su relativamente corto tiempo de vida (albúmina es
de 20 días) rinde una estimación razonable del compartimiento proteico visceral. En esta práctica utilizaremos
la Proteína Total y la Albúmina sérica.
Las proteínas del compartimiento somático ò esquelético la evaluaremos mediante la relación entre la excreción
de la creatinina urinaria en 24 horas y la talla de la persona, relación que es un fiel índice de la masa muscular
esquelética. Así mismo mediante el Peso y la Talla se evaluará la masa corporal total.
 Espectrofotòmetro.
 Micropipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.
 Tubos de ensayo.
 Baño Maria a 37ºC.
 Reloj ò timer.
Experimento A: DETERMINACIÓN DE PROTEINAS TOTALES Y ALBÚMINA EN SUERO
Determinación de Proteínas Totales:
Los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el ión cúprico, en medio alcalino, para dar un complejo
color violeta con máximo de absorción a 540 nm, cuya intensidad es proporcional a la concentración de
proteínas totales en la muestra.
Determinación de Albúmina:
La albúmina reacciona específicamente (sin separación previa) con la forma aniónica de la Bromo Cresolsulfon
Ftaleìna (BCF), en presencia de un exceso de colorante, en medio tamponado a pH 3,8. El aumento de
absorbancia a 625 nm respecto al blanco de reactivo, es proporcional a la cantidad de albúmina presente en la
muestra.
REACTIVOS:
Reactivo EDTA/Cu: complejo EDTA/Cu 13 mmol/l en NaOH 875 mmol/l y alquil aril polièter (AAP).
Reactivo BCF: solución de Bromo Cresolsulfon Ftaleìna (en polioxietilèn lauril éter).
Suero Patrón: solución de albúmina y globulinas en estado nativo con titulo conocido de proteínas (Biuret ò
Kjeldhal) y albúmina (unión BCF).
Código MEH-OT-01
Versión V.2
PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEINAS TOTALES:

En tres tubos colocar:
Blanco Standard Muestra
Agua destilada 50 uL --- ---
Suero Patrón --- 50 uL ---
Muestra --- --- 50 uL
Reactivo EDTA/Cu 3,5 ml 3,5 ml 3,5 ml
Mezclar los tubos.
Incubar durante 15 minutos en baño Maria a 37ºC.
Leer en espectrofotòmetro a 540 nm.
PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE ALBÚMINA:

En tres tubos colocar:
Suero Patrón --- 10 uL ---
Muestra --- --- 10 uL
Reactivo BCF 3,5 ml 3,5 ml 3,5 ml
Mezclar los tubos.

Mantenerlos a temperatura ambiente durante 10 minutos.
CALCULO DE LOS RESULTADOS:
Proteinas totales (g/dl) = M x fc fc = P.T. (g/dl) / S

Albúmina (g/dl) = M x fc fc = Alb. (g/dl) / S
Albúmina (g/dl)
Relación A/G = ---------------------------------------
Prot. Tot. (g/dl) - Alb. (g/dl)
VALORES DE REFERENCIA:
PROTEÍNAS TOTALES: 6,1 a 7,9 g/dl.
ALBÚMINA: 3,5 a 4,8 g/dl.
RELACION A/G: 1,2 a 2,2
Código MEH-OT-01
Versión V.2
Experimento B: DETERMINACIÓN DE CREATININA URINARIA

La creatinina reacciona con el picrato alcalino en medio tamponado, previa desproteinizaciòn con ácido pícrico,
obteniéndose un cromógeno que se mide a 510 nm.
REACTIVOS:
Reactivo 1: ácido pícrico 41,4 mmol/l.
Reactivo 2: buffer glicina/NaOH 1 mol/l, pH final 12,4.
Standard: solución de creatinina 2 mg%
PROCEDIMIENTO:
Recolectar orina de 24 horas.
Medir la diuresis, tomar una alícuota y efectuar una dilución 1:50 de la misma.
Luego en tres tubos de ensayo preparar lo siguiente:
Standard --- 0,5 ml ---
Orina diluida (1:50) --- --- 0,5 ml
Agua 1 ml 0,5 ml 0,5 ml
Reactivo 1 2 ml 2 ml 2 ml
Reactivo 2 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
Mezclar por inversión.
Incubar 20 minutos a temperatura ambiente.
CALCULO DE LOS RESULTADOS:
M
Creatinina en orina (mg/24 horas) = ------ x 20 mg/l x 50 x V
S
Siendo:
V = volumen de la diuresis expresado en litros/24 horas.
M = Absorbancia neta del tubo muestra.
S = Absorbancia neta del tubo estándar.
VALORES DE REFERENCIA:
900 a 1 500 mg/24 horas.
VALORACIÓN DEL ESTADO NUTRICIONAL

Código MEH-OT-01
Versión V.2
PROMEDIO POBLACIONAL DESNUTRICIÓN

Relación Cr U 24h / Talla Hombres: 830 Hombres: < 660
(mg 24h/m) Mujeres: 680 Mujeres: < 430
Relación Peso / Talla Hombres: 37 Hombres: < 30
(Kg/m) Mujeres: 34 Mujeres: < 29
Proteínas totales (g/dl) 7 <6
Albúmina (g/dl) 4 < 3,5
1.- Con los datos obtenidos en los experimentos, realizar la valoración nutricional de dicha persona sabiendo
que es varón, pesa 60 Kg, su talla es 1,56 m y su volumen urinario en 24 horas fue de 1000 ml.
2.- ¿Cómo hubiera sido la valoración nutricional en el caso que la persona hubiera sido mujer?
3.- Mencione las características generales de las proteínas y su clasificación.
4.- ¿Qué son las globulinas y cuáles son sus clases?
5.- Describa los métodos de dosaje tanto químicos como enzimáticos para proteínas totales, albúmina,
globulina y creatinina.
Código MEH-OT-01
Versión V.2
PRÁCTICA N°10 METABOLISMO DE LA BILIRRUBINA.

LOGRO A MEDIR:
Conocer el metabolismo de la Bilirrubina y el Ciclo Entero-hepático-Renal del Urobilinógeno. Conocer a las variables
que generan la Ictericia.
MARCO TEÓRICO:
La bilirrubina es un pigmento amarillo, que se produce en el ser humano a partir del Núcleo HEM (que es una
Protoporfirina Tipo IX ó Tetrapirrol macro cíclico, molécula que tiene insertado un átomo de Hierro).Sobre este
núcleo HEM actúa la enzima Oxigenasa Heme de los microsomas. Esta Oxigenasa rompe el enlace alfa
meteno del anillo tetrapirrólico y se abre la molécula, convirtiéndose en el pigmento verde Biliverdina, el cual es
subsecuentemente hidrogenado y forma Bilirrubina .Esta reducción la realiza la enzima citosólica Biliverdina
reductasa que es una enzima NADPH dependiente. Por cada mol de HEME catabolizado por esta ruta se
produce un mol de bilirrubina, de CO2 y de ión férrico.
La producción diaria de bilirrubina a partir de todas sus fuentes en el hombre es de 250 a 350 mg.
Aproximadamente el 85% de la bilirrubina total producida se deriva de la molécula del HEM de la Hb liberada
a partir de los eritrocitos senescentes que son destruidos en el sistema retículo endotelial del hígado, bazo y
médula ósea. El 15% remanente se produce a partir de la destrucción de las células precursoras de los
eritrocitos en la médula ósea ( llamada “eritropoyesis inefectiva”) y también proviene del catabolismo de otras
proteínas que contienen núcleo Hem como la mioglobina, citocromos, peroxidasas y que están distribuidas a
través de todo el organismo. Después de su producción en los tejidos periféricos, la bilirrubina es transportada
al hígado asociada a la albúmina .La Bilirrubina es rápidamente captada por los hepatocitos, se transporta y
se conjuga al ácido glucurónico (UDP – Glucoronil transferasa) para producir mono y diglucuronato de
bilirrubina los cuales se excretan en la bilis.
Y después de ser excretados hacia el intestino delgado. En el tracto intestinal los glucorónidos de
bilirrubina se hidrolizan a la forma no conjugada por el pH al alcalino del intestino delgado, y por la acción
catalítica de la betaglucuronidasa del hígado, células epiteliales intestinales y las bacterias. La bilirrubina no
conjugada es posteriormente reducida por la flora bacteriana anaeróbica intestinal para formar un grupo de
tres tetrapirroles incoloros colectivamente llamados Urobilinógenos que luego se reducen y forman tres
productos: estercobilinógeno, mesobilinógeno y Urobilinógeno. Hasta el 20% de los Urobilinógenos producidos
diariamente son reabsorbidos desde el intestino hacia la circulación para ir al hígado (Circulación
enterohepática). La mayor parte del Urobilinógeno reabsorbido es captado por el hígado y es re-excretado en
la bilis y solamente un 2 a 5 % entra a la circulación general y aparece en la orina. En la parte más baja del
tracto intestinal, los tres Urobilinógenos se oxidan espontáneamente y producen los pigmentos estercobilina,
mesobilina y urobilina, y así estos pigmentos adquieren color marrón y que son los pigmentos que le dan color
a las heces. Existen enfermedades congénitas y enfermedades adquiridas que afectan a uno ó más de los
pasos involucrados en la producción, captación, depósito, metabolismo y excreción de la bilirrubina y la
hiperbilirrubinemia es frecuentemente el resultado de estos trastornos. Esta bilirrubinemia puede ser a
predominio No conjugado (Indirecta) o Conjugado (Directa) dependiendo del tipo de desorden.
La hiperbilirrubinemia causa Ictericia. Cuando la cifra de bilirrubina en la sangre excede de 1 mg %, existe
hiperbilirrubinemia .La hiperbilirrubinemia puede deberse a la producción de más bilirrubina de la que el hígado
normal puede excretar o a la insuficiencia de un hígado dañado para excretar la bilirrubina producida en
cantidades normales. Ante la ausencia de daño hepático, la obstrucción de los conductos excretorios del
hígado, previniendo la excreción de la bilirrubina, también causará hiperbilirrubinemia. En todos estos
Código MEH-OT-01
Versión V.2
trastornos, la bilirrubina se acumula en la sangre y cuando alcanza una cierta concentración (aproximadamente
de 2 a 2. 5 mg%) se difunde dentro de los tejidos los cuales adquieren color amarillo, este trastorno se denomina
ictericia. La concentración de bilirrubina en el suero es de gran valor, por eso en la presente practica la
emplearemos.
Estado Bilirrubina Sérica Urobilinógeno Bilirrubina Urobilinógeno fecal

Mg% Urinario Urinaria
NORMAL Conjugado: 0.1 a 0.4 mg 0.a 4 mg/24 hs Ausente 40 a 280 mg/ 24 h

No Conjugado 0.2 a 0.7
Ictericia Elevación .No Conjugada Aumentado Ausente Aumentado
Hemolítica
Elevaciones de
Hepatitis
ambas, con predominio
Disminuido Presente Disminuido
conjugada
Elevación de ambas a
Ictericia Obstructiva
predominio
Conjugada Ausente Presente Escaso o
ausente
Dentro de las causas de Ictericia Hemolítica tenemos:

Anemias hemolíticas, ictericia fisiológica neonatal (Inmadurez hepática para captación, conjugación y secreción
de la bilirrubina), Síndrome de Cligeer-Najar (Alteración de la conjugación de bilirrubina), Enfermedad de Gilbert,
Hiperbilirrubinemia tóxica (Agentes farmacológicos).
- Espectrofotómetro o fotocolorímetro
- Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados
- Tubos o cubetas espectrofotométricas
- Cronómetro
Experimento A: DOSAJE DE BILIRRUBINA TOTAL SÉRICA

La bilirrubina indirecta, unida a la albúmina, es liberada por un tensioactivo. La bilirrubina total (conjugada y
libre) reacciona con la sal de diclorofenildiazonio (DPD) formando un azocompuesto de color rojo en solución
ácida.
Código MEH-OT-01
Versión V.2
REACCTIVOS NECESARIOS:
A. Reactivo A: viales conteniendo sal de diclorofenildiazonio.
B. Reactivo B: solución acuosa conteniendo ácido clorhídrico 90 mmol/l y tensioactivo.
C. Reactivo C (Reactivo para Blanco de Muestra): solución acuosa conteniendo ácido clorhídrico 90 mmol/l y
tensioactivo.
ácido clorhídrico...................................................90 mmol/l
tensioactivo....................................................................4%
diclorofenildiazonio.................................................1 mmol/l
Calibrador A plus o Bilirrubina Standard de Wiener lab.

Reactivos B y C: listos para usar.
Reactivo de Trabajo: reconstituir cada frasco de Reactivo A con 10 ml de Reactivo B. Tapar y agitar hasta
disolución completa. Homogeneizar y fechar.
PRECAUCIONES
Los Reactivos B y C son corrosivos. H315 + H320: Provoca irritación cutánea y ocular. H314: Provoca
quemaduras graves en la piel y lesiones oculares graves. P262: Evitar el contacto con los ojos, la piel o la ropa.
P305 + P351 + P338: EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Enjuagar cuidadosamente con agua
durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Seguir enjuagando. P302 + P352:
EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL: Lavar con agua y jabón abundantes. P280: Llevar
guantes/prendas/gafas/máscara de protección.

Lecturas del blanco de Reactivos superiores a 0,100 D.O. a 546 nm, son indicio de deterioro de los reactivos.
Desechar. La turbidez indica deterioro de los reactivos. En tal caso, desechar.

Reactivos Provistos: estables en refrigerador (2-10ºC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.
Reactivo de Trabajo: estable 21 días en refrigerador (2-10ºC).
MUESTRA: Suero o plasma

a) Recolección: obtener de la manera habitual. Proteger de la luz natural o artificial envolviendo el tubo con
papel negro.
b) Aditivos: en caso de que la muestra sea plasma, debe usarse heparina para su obtención.
Código MEH-OT-01
Versión V.2
c) Sustancias interferentes conocidas: no se observan interferencias por hemoglobina hasta 350 mg/dl,
triglicéridos hasta 1000 mg/dl (10 g/l), ni heparina hasta 50 U/ml.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la muestra debe ser preferentemente fresca. En caso de
no efectuarse el ensayo en el momento, el suero puede conservarse hasta 48 horas en refrigerador (2-10ºC) y
la sangre entera no más de 24 horas en refrigerador (2-10ºC) o 12 horas a temperatura ambiente (menor de
25ºC).
La acción de la luz es capaz de destruir hasta un 50% de la bilirrubina presente en la muestra, por lo que debe
protegerse cuidadosamente.
- Temperatura de reacción: temperatura ambiente (< 25ºC)
- Volumen de muestra: 40 uL
Código MEH-OT-01
Versión V.2
Bilirrubina total en suero o plasma:
- Adultos: hasta 10 mg/l
- Recién nacidos:
Nacidos a término Prematuros
Sangre de cordón < 20 mg/l < 20 mg/l
hasta las 24 h 14 - 87 mg/l < 80 mg/l
hasta las 48 h 34 - 115 mg/l < 120 mg/l
del 3º al 5º día 15 - 120 mg/l < 160 mg/l
Los valores comienzan luego a disminuir para alcanzar el nivel promedio del adulto al mes del nacimiento.
En los prematuros, los niveles tardan más en alcanzar la normalidad, dependiendo del grado de inmadurez
hepática. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.
CONVERSION DE UNIDADES
Bilirrubina (mg/l) = Bilirrubina (mg/dl) x 10
Bilirrubina (mg/dl) x 17,1 = Bilirrubina (umol/l)

La acción de la luz, tanto sobre las muestras como sobre las soluciones standard, es capaz de destruir en una
hora hasta el 50% de la bilirrubina presente.
Linealidad: la reacción es lineal hasta 200 mg/l de bilirrubina. Para valores superiores, repetir la determinación
empleando muestra diluida 1:2 ó 1:4 con solución fisiológica, multiplicando el resultado obtenido por 2 ó 4 según
el caso.
PARAMETROS PARA ANALIZADORES AUTOMATICOS

Para las instrucciones de programación consulte el manual del usuario del analizador en uso.
Para la calibración debe emplearse Calibrador A plus de Wiener lab.
Código MEH-OT-01
Versión V.2
El equipo provee Reactivo para Blanco de Muestra (Reactivo C) que sólo es requerido en algunos analizadores
automáticos. En el resto de los analizadores este Reactivo no es necesario.
Para mayor información referirse al manual de adaptaciones de Reactivos Wiener lab. de su analizador.
Experimento B: DOSAJE DE BILIRRUBINA DIRECTA SÉRICA

La bilirrubina, compuesto de degradación de la hemoglobina, es captada por el hígado para su conjugación y
excreción en la bilis. Las alteraciones hepatocelulares u obstrucciones biliares pueden provocar
hiperbilirrubinemias.
La eritroblastosis fetal o anemia hemolítica del recién nacido es una patología provocada por
incompatibilidad materno-fetal en la que se produce una destrucción excesiva de glóbulos rojos. Esto resulta
en un severo aumento de la bilirrubina sérica con el consecuente riesgo de difusión del pigmento al sistema
nervioso central, por lo que la determinación de la bilirrubina en estos niños recién nacidos resulta sumamente
importante.

La bilirrubina directa reacciona con la sal de diclorofenildiazonio (DPD) formando un azocompuesto de color
rojo en solución ácida.
REACTIVOS PROVISTOS
A. Reactivo A: viales conteniendo sal de diclorofenildiazonio.
B. Reactivo B: solución acuosa conteniendo ácido sulfámico 90 mmol/l.
C. Reactivo C (Reactivo para Blanco de Muestra): solución acuosa conteniendo ácido sulfámico 90 mmol/l.
ácido sulfámico.....................................................90 mmol/l
cloruro de sodio..........................................................6,6 g/l
diclorofenildiazonio..............................................0,1 mmol/l
Calibrador A plus de Wiener lab.
Reactivos B y C: listos para usar.
Reactivo de Trabajo: reconstituir cada frasco de Reactivo A con 10 ml de Reactivo B. Tapar y agitar hasta
disolución completa. Homogeneizar y fechar.
Lecturas del blanco de Reactivos superiores a 0,100 D.O. a 546 nm, son indicio de deterioro de los reactivos.
Desechar.
La turbidez indica deterioro de los reactivos. En tal caso, desechar.

Reactivos Provistos: estables en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.
Reactivo de Trabajo: estable 21 días en refrigerador (2-10oC).
Código MEH-OT-01
Versión V.2
MUESTRA
Suero o plasma
a) Recolección: obtener de la manera habitual. Proteger de la luz natural o artificial envolviendo el tubo con
papel negro.
b) Aditivos: en caso de que la muestra sea plasma, debe usarse heparina para su obtención.
c) Sustancias interferentes conocidas: no se observan interferencias por hemoglobina hasta 180 mg/dl,
triglicéridos hasta 550 mg/dl (5,50 g/l), ni heparina hasta 20 U/ml.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la muestra debe ser preferentemente fresca. En caso de
no efectuarse el ensayo en el momento, la muestra puede conservarse hasta 48 horas en refrigerador (2-10oC)
y la sangre entera no más de 24 horas en refrigerador (2-10oC) o 12 horas a temperatura ambiente (menor de
25oC).
La acción de la luz es capaz de destruir hasta un 50% de la bilirrubina presente en la muestra, por lo que debe
protegerse cuidadosamente.
- Temperatura de reacción: temperatura ambiente (< 25oC)
Código MEH-OT-01
Versión V.2
Experimento B: INVESTIGACIÓN DE UROBILINÓGENO EN ORINA
El Urobilinógeno se forma en la fase intestinal del metabolismo de la bilirrubina y se encuentra en todas las
orinas normales en muy pequeñas cantidades, menores de 4 mg / 24 hs. Se forma en el intestino como hemos
señalado en las clases teóricas por la acción de las bacterias sobre los pigmentos biliares excretados por el
hígado. También dijimos que luego que se excreta la bilirrubina conjugada al conductillo biliar llega al duodeno;
la bilirrubina conjugada no es reabsorbida sino que: o bien se excreta como tal en la heces, o bien se
transforma en UROBILINÓGENO (y derivados asociados) por acción de las bacterias del colon. El urobilinógeno
se puede reabsorber en el intestino delgado (íleon) y en el colon y pasa a la circulación portal, llega al Hígado
y allí se re-excreta a la bilis y el resto llega al riñón y se excreta con la orina.
Cuando existe una alteración en la captación y excreción hepática de Urobilinógeno ( como en la
enfermedad hepatocelular) ó la síntesis de bilirrubina como en la hemólisis, la excreción diaria del urobilinógeno
aumentará en forma significativa Por el contrario, si no pasa bilis al intestino, como en la colestasis u obstrucción
biliar extrahepática interfieren en la fase final del catabolismo de la bilirrubina y ocasiona un descenso notable
en la producción y excreción urinaria del urobilinógeno. Entonces, la medida del urobilinógeno en la orina resulta
muy útil para diferenciar las posibles causa de hiperbilirrubinemia como ocurre en la obstrucción completa de
los conductos biliares, la urobilina estará ausente en la orina.
La excreción se incrementará en todas aquellas condiciones en que exista una excesiva destrucción de los
eritrocitos y en aquellos casos de daño parcial del parénquima hepático. En las nefritis muy avanzadas puede
estar ausente la Urobilina
Fundamento de la prueba de Ehrlich para la investigación de Urobilinógeno en orina (Método

Cualitativo).
Esta prueba se basa en la reacción entre el urobilinógeno y el reactivo de paradimetil aminobenzaldehido, para
rendir un complejo coloreado rojo cereza
Código MEH-OT-01
Versión V.2
Reactivo de Ehrlich:
Disolver 10 gm de Paradimetilaminobenzaldehido en una mixtura de 75 ml de agua y 75 ml de HCl
concentrado.
Procedimiento: A 2 ml de orina en un tubo de prueba, añadirle 0.5 ml del Reactivo de Ehrlich y mezclar bien.
Observar el color de la mixtura.
Interpretación. Cantidades normales de Urobilinógeno en la orina no producirán color. Cantidades aumentadas

(patológicas) del pigmento urobilinógeno producirán un color rojizo cereza que se observa bien mirando el
tubo desde arriba del tubo (boca del tubo) contra un fondo blanco.
En la actualidad usamos para la investigación de Urobilina en orina el método de las tiras reactivas que se
introducen directamente en la muestra de orina. Estas cintas están impregnadas en el área correspondiente de
una sal de metoxibenceno diazonio estable que produce con el urobilinógeno, casi instantáneamente un
complejo de color rojo azoico. Se considera normal que en la zona reactiva para urobilinógeno no se produzca
decoloración alguna o que los colores que parezcan sean más claros que los observados para l mg % .Esta
prueba es específica para el urobilinógeno.
1.- Explique la formación de la bilirrubina.
2.- ¿En qué casos se produce una elevación de la bilirrubina total, tanto a expensas de la bilirrubina directa
como de la indirecta?
3.- ¿Cómo se forma el Urobilinógeno y qué importancia tiene?
4.- ¿Qué es la ictericia y como se evalúa?
5.- ¿Cuáles son los métodos conocidos para el dosaje de bilirrubina?
Código MEH-OT-01
Versión V.2
PRÁCTICA N°11 TRANSAMINACIÓN

LOGRO A MEDIR:
Explicar el proceso de transaminación (actividad normal y alteración del proceso) y donde se realiza en el
organismo.
MARCO TEÓRICO:
Las transaminasas son enzimas ampliamente difundidas en el organismo, que catalizan la transferencia de un
grupo amino de un aminoácido a un cetoácido, en una de las más importantes reacciones del metabolismo
proteico. El interés clínico está centrado especialmente en dos de ellas: TGO (transaminasa glutámico
oxalacètica) y TGP (transaminasa glutámico pirúvica).
Estas enzimas tienen acción eminentemente intracelular, por lo que la actividad sérica en condiciones normales
es baja o nula. Un aumento de la actividad será evidencia de un deterioro de los tejidos en que se encuentran,
de los cuales resultan particularmente importantes corazón e hígado.
Se ha observado que luego de un infarto de miocardio se produce en suero un marcado aumento de la actividad
de la TGO, debido a la liberación al torrente sanguíneo de esta enzima, tan abundante en músculo cardíaco.
En este caso no existirá aumento en la actividad sérica de TGP ò será mínimo.
En hepatitis virales y otras formas de enfermedad hepática que involucren necrosis de tejido, abr un incremento
considerable de la actividad sérica de transaminasas, incluso antes de la aparición de síntomas clínicos como
ictericia.
En este caso, la TGP será la enzima predominante debido a su gran concentración en el tejido hepático.
Una elevada actividad de transaminasas puede detectarse también en traumas accidentales o quirúrgicos y en
distrofias musculares y miosis.
- Baño de agua a la temperatura indicada en el procedimiento a seguir.
- Cronómetro.
DESARROLLO DE LA PRACTICA:
EXPERIMENTO A: DETERMINACIÓN DE ALANINA AMINO TRANSFERASA
La alanina aminotransferasa (ALT o GPT) es una enzima unilocular (citoplasmática) cuya mayor actividad se
localiza en el tejido hepático. La destrucción o cambio de permeabilidad de las membranas celulares provoca
la liberación de ALT a la circulación sanguínea.
Los mayores aumentos de actividad ALT en suero, se producen como consecuencia de alteraciones hepáticas.
En el caso de hepatitis virales, el aumento de ALT precede a la aparición de ictericia, alcanzando un máximo
luego de la observación de dicho síntoma. Si los valores permanecen elevados luego de 6 semanas, debe
pensarse en la posibilidad de una hepatitis activa o en el comienzo de una hepatitis crónica, por lo que es de
utilidad las determinaciones seriadas de la enzima.
Código MEH-OT-01
Versión V.2
La determinación de ALT adquiere importancia diagnóstica cuando sus valores se comparan con los de otras
enzimas de similar origen tisular, permitiendo así completar el perfil
enzimático de órganos como el hígado.

Reactivo B: listo para usar.
Reactivo A; preparación: agregar 20 ml de Reactivo B a un frasco de Reactivo A. Tapar, agitar hasta disolución
completa y fechar.
PRECAUCIONES
Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro". El Reactivo B contiene azida.

Reactivo A reconstituido: estable 30 días en refrigerador (2-10ºC) o 3 días a temperatura ambiente a partir
del momento de su reconstitución.

Cuando el espectrofotómetro ha sido llevado a cero con agua destilada, lecturas de absorbancia del Reactivo
A reconstituido inferiores a 0,800 D.O. o superiores a 1,800 D.O. (a 340 nm) son indicio de deterioro del mismo.
MUESTRA
Suero o plasma
b) Aditivos: en caso de que la muestra a utilizar sea plasma, se debe usar heparina como anticoagulante.
- Las muestras con hemólisis visible o intensa producen valores falsamente aumentados por lo que no deben
ser usados.
- Las muestras de pacientes hemodializados o con hipovitaminosis u otras patologías asociadas con deficiencia
de piridoxal fosfato producen valores falsamente disminuidos.
Código MEH-OT-01
Versión V.2
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la GPT en suero es estable hasta 3 días en refrigerador
(2-10ºC), sin agregado de conservantes. No congelar.
CONDICIONES DE REACCION (Disminución de absorbancia)

Longitud de onda: 340 nm (Hg 334 ó 366).
- Temperatura de reacción: 25, 30 ó 37ºC. Ver los VALORES DE REFERENCIA correspondientes a cada
temperatura.
- Tiempo de reacción: 4 minutos.
Volúmenes de Muestra y de Reactivo A reconstituido: pueden reducirse proporcionalmente, sin que varíen los
factores de cálculo correspondientes.
CÁLCULO DE LOS RESULTADOS

GPT (U/l) = ΔA/min x factor
En cada caso deberá emplearse el factor de cálculo correspondiente de acuerdo a la temperatura de reacción
seleccionada (30-37ºC o 25ºC), como se indica en la siguiente tabla:
Código MEH-OT-01
Versión V.2
Temperatura 25oC 30oC* 37oC*
Hombres hasta 22 U/l hasta 29 U/l hasta 41 U/l
Mujeres hasta 17 U/l hasta 22 U/l hasta 31 U/l
* Calculados

Absorbancia inicial baja: cuando una vez agregado el suero la primera lectura (tiempo 0) es inferior a 0,800
D.O., estando el Reactivo A (sustrato) en condiciones, indica una muestra con muy alta actividad de GPT (que
consume el NADH aún antes de esta lectura) o con una concentración de cetoácido endógeno particularmente
elevada. En este caso, repetir la determinación con muestra diluida con solución fisiológica y multiplicar el
resultado por la dilución efectuada.
La humectación es causa de deterioro del Reactivo A.
EXPERIMENTO B: DETERMINACIÓN DE LA ASPARTATO AMINOTRANSFERASA

La aspartato aminotransferasa es una enzima bilocular (citoplasmática y mitocondrial) ampliamente difundida.
Se encuentra en mayor concentración en hígado y corazón.
Cualquier alteración de estos tejidos produce un aumento en los niveles de AST circulante.
En el infarto agudo de miocardio, se observa un aumento moderado de la enzima a las 6 u 8 horas de ocurrido
el episodio, alcanza niveles máximos alrededor de las 48 horas y retorna a la normalidad entre el 4º y el 6º día.
En pacientes con afecciones hepáticas se observan las mayores elevaciones de AST, sobre todo en los casos
de hepatitis con necrosis.
REACTIVOS PROVISTOS
A. Reactivo A: solución de buffer TRIS pH 7,8 conteniendo L-aspartato.
B. Reactivo B: solución conteniendo 2-oxoglutarato, nicotinamida adenina dinucleótido reducido (NADH),
malato deshidrogenasa (MDH) y lactato deshidrogenasa (LDH).
Código MEH-OT-01
Versión V.2
TRIS......................................................100 mmol/l; pH 7,8

L-aspartato.........................................................200 mmol/l
NADH................................................................0,18 mmol/l
MDH......................................................................≥ 400 U/l
LDH.......................................................................≥ 600 U/l
2-oxoglutarato......................................................12 mmol/l

Reactivos Provistos: listos para usar. Estos pueden usarse separados o como Reactivo único, mezclando 4
partes de Reactivo A con 1 parte de Reactivo B (ej.: 4 ml Reactivo
+ 1 ml Reactivo B).
PRECAUCIONES

Una vez abiertos, no deben permanecer fuera del refrigerador por períodos prolongados. Evitar
contaminaciones.
Reactivo único (premezclado): estable 2 meses en refrigerador (2-10ºC) a partir de la fecha de su preparación.

El Reactivo B puede presentar una coloración parda rosada que no afecta su funcionamiento.
Cuando el espectrofotómetro ha sido llevado a cero con agua destilada, lecturas de absorbancia del Reactivo
único inferiores a 0,900 D.O. o superiores a 1,800 D.O. (a 340 nm) son indicio de deterioro del mismo.
MUESTRA
Suero o plasma
b) Aditivos: en caso de que la muestra a utilizar sea plasma, se puede usar heparina o EDTA como
anticoagulantes.
-Las muestras provenientes de pacientes hemodializados o con hipovitaminosis o patologías asociadas con
deficiencia de piridoxal fosfato producen valores falsamente disminuidos.
-No se observan interferencias por bilirrubina hasta 30 mg/dl, ni triglicéridos hasta 500 mg/dl. La hemoglobina
interfiere significativamente aumentando los resultados debido a la presencia de GOT en los eritrocitos.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la GOT en suero es estable hasta 3 días en refrigerador,
sin agregado de conservantes. No congelar.
Código MEH-OT-01
Versión V.2
-Longitud de onda: 340 nm

-Temperatura de reacción: 25, 30 ó 37ºC. Ver los VALORES DE REFERENCIA correspondientes a cada
temperatura.
-Tiempo de reacción: 4 minutos
-Volumen de muestra: 100 ul
Los volúmenes de Muestra y de Reactivo pueden variarse proporcionalmente, sin que varíen los factores de
cálculo.
PROCEDIMIENTO
A) 30 ó 37ºC
I-TECNICA CON REACTIVO UNICO
En una cubeta mantenida a 30-37ºC, colocar:
Reactivo único 1,0 ml
Preincubar unos minutos. Luego agregar:
Muestra 100 ul
Mezclar inmediatamente y disparar simultáneamente el cronómetro. Esperar 90 segundos y leer la absorbancia
inicial (ver LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO) y luego a los 1, 2 y 3 minutos de la primera lectura.
Determinar la diferencia promedio de absorbancia/min (ΔA/min), restando cada lectura de la anterior y
promediando los valores. Utilizar este promedio para los cálculos.
II-TECNICA CON REACTIVOS SEPARADOS
En una cubeta mantenida a 30-37ºC, colocar:
Reactivo A 0,80 ml
Muestra 100 ul
Preincubar unos minutos. Luego agregar:
Reactivo B 0,20 ml
Mezclar inmediatamente y disparar simultáneamente el cronómetro. Esperar 90 segundos y leer la absorbancia
inicial (ver LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO) y luego a los 1, 2 y 3 minutos de la primera lectura.
Determinar la diferencia promedio de absorbancia/min (ΔA/min), restando cada lectura de la anterior y
promediando los valores. Utilizar este promedio para los cálculos.
B) 25ºC
Emplear 250 ul de Muestra siguiendo el procedimiento indicado en A).

GOT (U/l) = ΔA/min x factor
En cada caso deberá emplearse el factor de cálculo correspondiente de acuerdo a la temperatura de reacción
seleccionada:
factor(30-37ºC) = 1.746
factor(25ºC) = 794
Temperatura 25ºC* 30ºC* 37ºC
Código MEH-OT-01
Versión V.2
Hombres hasta 18 U/l hasta 25 U/l hasta 38 U/l

Mujeres hasta 15 U/l hasta 21 U/l hasta 32 U/l
* Calculados
Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia

Absorbancia inicial baja: cuando una vez agregado el suero la primera lectura (tiempo 0) es inferior a 0,900
D.O., estando el Reactivo B en condiciones, indica una muestra con muy alta actividad de GOT (que consume
el NADH aún antes de esta lectura) o con una concentración de cetoácidos endógenos particularmente elevada.
En este caso, repetir la determinación con muestra diluida con solución fisiológica y multiplicar el resultado por
la dilución efectuada.
1.- ¿Explique en qué consiste el fenómeno de transaminación y donde se realiza en el organismo?

2.- ¿Qué relación existe entre las transaminasas y las enfermedades hepáticas?
3.- ¿Cómo se encuentran las transaminasas en el infarto agudo de miocardio?
4.- Señale ¿cuáles son los métodos de análisis conocidos para dosaje de transaminasas?
5.- ¿Existe variación de transaminasas con la edad?
Código MEH-OT-01
Versión V.2
PRÁCTICA N°12: BALANCE NITROGENADO, BALANCE CALÓRICO Y TIPO DE DIETA

LOGRO A MEDIR:
Realizar el Balance Nitrogenado y Balance Calórico. Explicar la importancia de la evaluación nutricional en el
diagnóstico clínico.
MARCO TEÓRICO:
Las regulaciones homeostáticas controlan las concentraciones de los distintos aminoácidos en el
organismo y la velocidad a la que se sintetizan e hidrolizan las proteínas musculares y plasmáticas. La síntesis
y el recambio de las proteínas del cuerpo están regulados.
En personas sanas la cantidad de proteínas que se ingiere está equilibrada exactamente con las proteínas que
se utilizan para el mantenimiento del cuerpo y las que se excretan por las heces, la orina y la piel, dando lugar
a un equilibrio proteico cero. Este equilibrio refleja regulaciones homeostáticas dentro de los tejidos.
Las necesidades energéticas se definen como la ingesta de energía en la dieta necesaria para el
crecimiento o el mantenimiento de una persona de una edad, sexo, peso, altura y nivel de actividad física
definidos. En los niños y las mujeres embarazadas o en período de lactancia, las necesidades energéticas
incluyen las impuestas por la formación de tejidos o la secreción de leche a una velocidad compatible con un
buen estado de salud. En personas enfermas o lesionadas, los factores generadores de estrés incrementan o
reducen el gasto energético.
Material requerido para ejecutar cálculos y equivalencias.
Tablas de aportes calóricos del MINSA.
Tablas de actividad para el metabolismo basal y dinámico.
Escoger un alumno de la mesa para que, siguiendo las instrucciones de los investigadores, recuerde la dieta
que ha consumido en las últimos 24 h, sus actividades en las últimas 24 horas y luego proceder a encontrar
su balance nitrogenado, su balance calórico y el tipo de dieta que usó.
1) BALANCE NITROGENADO
a) Determinar la úrea y creatinina excretadas en la orina de las últimas 24 horas y en las heces de 24
horas.
b) Calcular cuánto nitrógeno se excretó en las últimas 24 horas con los datos de 1a.
c) Determinar por la técnica del recuerdo de 24 horas la ingesta de alimentos
d) Hacer una tabla para determinar en base a la información anterior la cantidad de carbohidratos,
lípidos y proteínas ingeridos en las últimas 24 horas usando la TABLA DE ALIMENTOS PERUANOS
del MINSA.
e) Calcular en base a lo anterior cuanto Nitrógeno ingirió en las últimas 24 horas
f) Determinar el balance nitrogenado usando la siguiente expresión:
Código MEH-OT-01
Versión V.2
BN= N ingerido en las últimas 24 h – (N excretado en la úrea de la orina de 24 h+ N excretado en la

creatinina +N excretado en las heces de 24 h)
Responder: balance positivo, neutro y/o negativo
2) BALANCE CALÓRICO
Siguiendo los instructivos que se le proporcionó en clase:
a) Determinar el tipo de actividades que tuvo en las últimas 24 h, su duración, y su equivalente calórico.
b) Determinar las calorías que ingreso con sus alimentos en las últimas 24 horas
c) Realizar el balance calórico:
i) Calorías que ha ingresado con los alimentos de 24 h
ii) Calorías consumidas en las últimas 24
iii) Balance calórico= Calorías que ingresaron con los alimentos –(calorías gastadas en las actividades
+ calorías gastadas en el metabolismo basal)
d) Determinar si el balance es positivo, negativo ó 0.
Determinar el tipo de dieta que usó el alumno: usando los instrumentos que se proveyeron al alumno
Presentación del trabajo.
BIBLIOGRAFÍA:
Doumas, B.T.; Watson, W.A. & Biggs, H.G. - Clin. Chim. Acta 31/1:87 (1971)
Kachmar, J.F. - “Fundamentals of Clinical Chemistry”. Tietz,Saunders, pág. 210 (1970)
Curtis, C.A.; Ashwood, E.R. - Tietz Fundamentals of Clin. Chem. 5th Ed.: 422, 2001.
Burtis - Ashwood. Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry, W.B. Saunders Co., fifth edition, United States of
America, 2001.
"Tietz textbook of Clinical Chemistry" -Burtis and Ashwood Editors, 3rd. Ed. -Saunders Co., 1999.
Tietz Fundamentals of clinical chemistry - Burtis, C., Ashwood, E. (5º Edition) WB Saunders, 2001

G.P. Bioqimica y Nutrición 2019-I - 20190219173200-1 PDF

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UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ACREDITADA POR SINEACE

NORMAS PARA EL USO Y TRABAJO EN EL LABORATORIO

PRÁCTICA DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN

SEGUNDA Identificar, describir y explicar el proceso de tamponamiento

TERCERA Evaluación de la masa proteica visceral. Determinación de proteínas

CUARTA Determinación de la Glicemia e Investigación de Glucosuria.

QUINTA Dosar Amilasa Sérica y Urinaria.

SEXTA Dosaje de bicarbonato sérico. Investigación de cuerpos cetónicos.

SÉTIMA Determinación de colesterol en suero, determinación de HDL, LDL,

OCTAVA Determinación de triacilgliceroles en suero.

NOVENA Determinación de creatinina urinaria. Dosaje de Urea.

DECIMA Cuantificar bilirrubina sérica. Investigar al urobilinógeno en orina.

DÉCIMA PRIMERA Determinación de transaminasas (TGO y TGP) en suero.

DÉCIMA SEGUNDA Realizar el Balance Nitrogenado y Balance Calórico. Explicar la

PRÁCTICA N°01: ESPECTROFOTOMETRÍA

Luz incidente Luz transmitida

CALCULO DE LA CONCENTRACIÓN DE UNA SOLUCIÓN PROBLEMA:

b) FACTOR DE CALIBRACIÓN.- (Fc), El factor de calibración es un término que se relaciona con la

Dil = Vol mp / Vol t

1. Preparar la siguiente batería de tubos:

Solución stock: Bicromato de Potasio 40 mg%.

5.- Construya una curva de calibración con los siguientes valores:

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PRÁCTICA N°02: LOS AMINOÁCIDOS Y LAS PROTEINAS COMO ELECTROLITOS: SU CAPACIDAD

El ácido y la base conjugada forman un par ácido/base.

PRÁCTICA N°03: EVALUACIÓN NUTRICIONAL, BIOQUÍMICA Y ANTROPOMÉTRICA.

EVALUACIÓN NUTRICIONAL: Conjunto de datos antropométricos, dietarios, bioquímicos y clínicos, que

1. Evaluación antropométrica: Estudio de la forma y composición corporal.

3. Evaluación Clínica: Basada en la evaluación médica.

FUNDAMENTOS DEL METODO

REACTIVO NO PROVISTO: Calibrador A plus / Proti 2 Suero Patrón de Wiener lab.

INSTRUCCIONES PARA SU USO

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO

ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL

CALCULO DE LOS RESULTADOS

*Concentración de proteínas totales en el Calibrador A plus o en el Suero Patrón

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

Linealidad: la reacción es lineal hasta 17 g/dl.

PARAMETROS PARA ANALIZADORES AUTOMATICOS

EXPERIMENTO B. DETERMINACIÓN DE LA ALBÚMINA SÉRICA

FUNDAMENTOS DEL METODO

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

PRÁCTICA N°04 DETERMINACIÓN DE LA GLICEMIA, INVESTIGACIÓN DE LA GLICOSURIA, TEST DE

S. Standard: solución de glucosa 100 mg/dl (1 g/l).

1) Destacar la importancia de la glucosa en el metabolismo humano y su relación con diversas patologías.

FUNDAMENTO DEL MÉTODO: COLORIMÉTRICO ENZIMÁTICO

Abreviaturas: GOD. Glucosa oxidasa; POD: Peroxidasa; 4-AF: 4 aminofenzona

INSTRUCCIONES PARA SU USO

Standard: listo para usar.

Los reactivos son para uso diagnóstico "in vitro".

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO

INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS

ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL

CÁLCULO DE LOS RESULTADOS

LINEALIDAD DEL MÉTODO

Experimento B: INVESTIGACIÓN CUALITATIVA DE GLUCOSA EN ORINA

Experimento C: TEST DE TOLERANCIA ORAL A LA GLUCOSA

GPA: glucosa plasmática en ayunas

Tubos: Blanco Standard Muestra Muestra Muestra Muestra

PRÁCTICA N°05: DOSAJE DE LA AMILASA SÉRICA Y URINARIA.

FUNDAMENTOS DEL MÉTODO: