UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
SECCIÓN DE BIOQUÍMICA Y FISIOLOGÍA AGROPECUARIA
ASIGNATURA DE BIOQUÍMICA

Manual de Prácticas
de Bioquímica para
la Carrera de MVZ
COLABORADORES:

 QFB Juana Alicia Alquicira Camacho

 M en C Ma. del Carmen Barrón García
 MVZ Silvia Leticia Bonilla Orozco
 MVZ Francisco Javier Cervantes Aguilar
 Dra. Esperanza García López
 MVZ Ranulfo Reyes Gama
 M en P Jorge Luis Rico Pérez
 M en P Juan Carlos Rodríguez Huerta
 ÍNDICE
Contenido Página
Horarios de impartición de la asignatura de bioquímica para el semestre 2018-I, 1
plan 2007 MVZ FES Cuautitlán
Presentación 2
Objetivo general del programa experimental de bioquímica para MVZ 3
Reglamento general para los laboratorios 4
Reglamento interno del laboratorio de bioquímica 6
Evaluación del curso experimental de bioquímica 7
Calendarización de prácticas 8
Método científico experimental 10
Introducción al laboratorio de bioquímica 15
Material de vidrio del laboratorio de bioquímica
Preparación de soluciones 20
pH y sistemas amortiguadores
Práctica 1. Titulación volumétrica y medición del pH 24
Práctica 2. Regulación del equilibrio ácido – base 30
Métodos de separación e identificación de aminoácidos y proteínas
Práctica 3. Separación e identificación de aminoácidos por cromatografía 32
en papel
Práctica 4. Separación e identificación de proteínas lácteas por 37
electroforesis en gel de poliacrilamida – SDS (SDS-PAGE)
Medición de la actividad enzimática
Práctica 5. Cinética de la enzima ureasa 42
Métodos de cuantificación de biomoléculas
Práctica 6. Cuantificación de proteínas por el método de Bradford 48
Práctica 7. Cuantificación de los niveles de glucosa 54
Práctica 8. Cuantificación de colesterol en suero sanguíneo por el método 55
de Liebermann – Burchard
Práctica 9. Aislamiento y cuantificación del ADN 59
Apéndice 1. Soluciones, ácidos, bases e indicadores de pH 63
Apéndice 2. Funciones y uso del equipo e instrumentos empleados en el 65
laboratorio de bioquímica
Apéndice 3. Hojas de seguridad de los diferentes reactivos empleados en el 72
laboratorio de bioquímica
HORARIOS DE BIOQUÍMICA 18 I plan 2007 MVZ

L M M J V
 PRESENTACIÓN
Bioquímica es una de las asignaturas básicas que contribuyen al proceso formativo
de los estudiantes que cursan cualquier carrera del área Químico Biológica, ya que en ella,
los estudiantes, además de desarrollar habilidades y destrezas, aprenden aspectos
relacionados con la composición química, así como los procesos metabólicos y los
mecanismos moleculares que explican los procesos hereditarios tanto a nivel celular como
integral en los seres vivos. Es de esa manera, la disciplina proporciona conceptos
imprescindibles para su desarrollo profesional, al tratar de comprender el funcionamiento
de las células y organismos animales.
La asignatura de Bioquímica para la carrera de Medicina Veterinaria y Zootecnia
(MVZ) en la Facultad de Estudios Superiores (FES) Cuautitlán, está conformada por un
programa teórico-práctico, el cual incluye nueve temas de teoría y diez prácticas de
laboratorio que se desarrollan a lo largo de un periodo lectivo de dieciséis semanas.
El manual esta diseñado en seis componentes importantes a considerar para el curso
de Bioquímica, estos son:
Método Científico Experimental
Introducción al Laboratorio de Bioquímica
pH y Sistemas Amortiguadores
Métodos de Separación e Identificación de Aminoácidos y proteínas
Medición de la Actividad Enzimática
Métodos de Cuantificación de Biomoléculas

Los colaboradores del presente manual, expresamos nuestro deseo de que, mediante la
aplicación del programa de prácticas, los estudiantes adquieran un sustento teórico y
metodológico que les permita estar mejor preparados y capacitados para aplicar dichas
bases en otras asignaturas subsecuentes que las requieran. De igual manera, esperamos que
a través del desarrollo y la aplicación directa de las técnicas aquí contenidas, sean capaces
de desarrollar las habilidades y destrezas necesarias dentro de su formación técnica, lo cual
se vea acompañado de un incremento sustantivo en la capacidad de observación, de saber
plantear preguntas, de aprender a buscar y procesar información, para que con todo ello,
fomente la capacidad de re-construir el conocimiento a través de su formación científica.

M en C BEATRIZ ROSAS GUTIÉRREZ

M en P JORGE LUIS RICO PÉREZ

2
OBJETIVO GENERAL DEL PROGRAMA EXPERIMENTAL DE
BIOQUÍMICA PARA MVZ

Al final del curso el alumno reconocerá y reafirmara los aspectos

teóricos relacionados con la composición química y las reacciones
metabólicas a través del manejo de métodos y técnicas de
laboratorio.

Se familiarizará con técnicas y metodologías de separación,

identificación y cuantificación de biomoléculas estudiadas en
Bioquímica desarrollándose así, habilidades y destrezas específicas.

3
5
 REGLAMENTO INTERNO DEL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
1. Para el trabajo en el laboratorio, cada grupo se organizará en equipos. El número de
integrantes por cada equipo será determinado por sus profesores.

2. La tolerancia para el inicio de la sesión de laboratorio será hasta de 10 minutos a partir

de la hora señalada. Si rebasan el tiempo de tolerancia, se les permitirá la entrada a la
práctica con la finalidad de que puedan adquirir los conocimientos necesarios pero
tomando en cuenta que tendrán falta en dicha sesión.

3. Iniciada la práctica, las mochilas o bolsas serán retiradas de las mesas de trabajo, solo
se podrá usar una libreta para hacer las anotaciones pertinentes.

4. Cada equipo deberá contar con un plumón indeleble, masking tape y toallas absorbentes
para rotular o etiquetar el material de vidrio que se les proporcionará en cada práctica,
cuando sea necesario. De manera individual, deberán traer guantes desechables de latex,
vinilo o contra ácidos, cubrebocas y en el caso de que la práctica lo amerite, gafas
protectoras.

5. En el caso de no entregar el material íntegro, esto será registrado en el mismo vale de

material en el apartado “ADEUDO”, y contarán con 10 días para su reposición, de lo
contrario sus datos serán entregados a las autoridades administrativas inmediatas para
dar notificación del hecho. No se retendrán credenciales de la UNAM.

6. No se deberá manejar el material y/o equipo, hasta que el profesor haya explicado su
correcto uso.

7. En el caso de los reactivos y/o soluciones, estas deberán manejarse con cuidado y, de
preferencia, mantenerse en un lugar fijo. De acuerdo a lo que indique la hoja de
seguridad de dichos reactivos. Al terminar de usarse, se deberá tapar el recipiente en el
que estén contenidas aquellas.

8. No deberá pipetear con la boca. Para ello se hará uso de las propipetas.

9. Se deberá usar una pipeta diferente para cada solución a medir, con el fin de no
contaminarlas con otras sustancias.

10. Se deberá comunicar al profesor cualquier tipo de accidente que ocurra durante la
práctica.

11. Al encender parrillas, se deberá hacer en un área despejada, principalmente lejos de

materiales inflamables. Si se produjera algún incendio, se tomará el extintor y rociará su
contenido primero al área inmediata al fuego y posteriormente a la base del mismo.

12. Esta estrictamente prohibido traer consigo mascotas.

6
 EVALUACIÓN DEL CURSO EXPERIMENTAL DE BIOQUÍMICA

El total de la calificación del laboratorio, equivale al 25% del curso de Bioquímica. En caso
de no obtener un promedio aprobatorio en el laboratorio, el alumno podrá presentar
exámenes finales A y B. Los criterios para realizar la evaluación son los siguientes:
Evaluación previa 33%
Evaluación del proceso 33%
Informe escritos de prácticas 33%
50%

Exámenes 40%
Trabajo de investigación 10%
Examen previo o cuestionario: El profesor realizará una actividad para poder verificar
que los estudiantes tengan claros los conocimientos teóricos, los cuales les posibilite
comprender las actividades experimentales.
Evaluación durante la práctica: Durante la sesión experimental se evaluará a los
estudiantes la manera en como es que se acerca a la adquisición del conocimiento.
Informe escrito de las prácticas: Estos se entregarán a la semana siguiente de haber
realizado la práctica. Los puntos que debe incluir serán los que indica el manual en el
apartado “Método Científico Experimental”. Deberán ser entregados con puntualidad.
Exámenes: Estos son programados en la misma semana para todos los grupos de
Bioquímica, sin embargo, cada profesor elaborará su examen y lo aplicará en su horario.
Trabajo de investigación: Consiste en la investigación de un tema que puede ser sugerido
por el profesor o bien, ser propuesto por los alumnos. Esta se desarrollará a lo largo del
semestre por equipo y será periódicamente revisado por los profesores, tanto de teoría como
de laboratorio. Cabe señalar que esta investigación deberá tener un enfoque bioquímico,
así como el de otras asignaturas que se cursen en el bloque. El trabajo concluido deberá ser
entregado por escrito en la forma y tiempo que el profesor indique.

7
 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
SECCIÓN BIOQUÍMICA Y FISIOLOGÍA AGROPECUARIA

CÓDIGO: FPE-CB-DEX-01-02
CALENDARIZACIÓN
N° Revisión: 00

ASIGNATURA Bioquímica
GRUPO(S) Todos los Grupos SEMESTRE 20-I CARRERA MVZ
SEMANA

FECHA NÚMERO Y/O NOMBRE DE LA PRÁCTICA, CUMPLIÓ

OBSERVACIONES
(SEMANAL) PROYECTO Y/O ACTIVIDAD SI NO
Presentación del programa experimental
5-9 Presentación de Objetivos Generales del Prog. Experimental. Lectura
1 Agosto de consideraciones para optimizar el trabajo en las sesiones
prácticas. (Reglamento)
Inscripción y Formación de equipos
12 - 16
2 Método Científico Experimental
Agosto Asignación de temas (Trabajo escrito)
19 - 23 Material de vidrio de Bioquímica
3 Preparación de soluciones
Agosto
26 - 30
4 Práctica 1: Titulación volumétrica y medición del pH
Agosto
2-6 Práctica 2: Regulación del equilibrio ácido-base
5 ( discusión de casos)
Septiembre
9 - 14 1er. Examen de laboratorio y revisión de avances de la investigación
6 para el trabajo escrito
Septiembre
16 - 20 Práctica 3. Separación e identificación de aminoácidos por Festivo Lunes 16 no afecta
7 cromatografía en papel práctica
Septiembre
23 – 27 Práctica 4. Separación e identificación de proteínas lácteas por
8 electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE)
Septiembre
30 Sep – 4
9 Práctica 5. Cinética de la enzima ureasa
Octubre
7 - 11 2º Examen de laboratorio y revisión de avances de la investigación
10 para el trabajo escrito
Octubre
14 - 18
11 Práctica 6. Cuantificación de proteínas por el método de Bradford
Octubre
21 - 25 Se realizará Práctica 8 en los
12 Práctica 7. Práctica de Carbohidratos(Revisión Bibliográfica) grupos del viernes (1103 y 1107)
Octubre
Práctica 8. Cuantificación de niveles de colesterol en suero
13 28 Oct – 1 Nov sanguíneo por el método de Liebermann-Burchard Práctica reprogramada

14 4 – 8 Nov Práctica 9. Aislamiento y cuantificación del ADN

15 11 – 15 Nov 3er Examen de laboratorio y entrega del trabajo escrito
Festivo Lunes 18 no afecta
16 18 – 22 Nov Entrega de calificaciones (Publicación)
grupo

FECHA CUMPLIÓ
SEM

EXAMEN OBSERVACIONES
(SEMANAL) SI NO
6 9-14 Sep 1er Examen de laboratorio
10 7 - 11 Oct 2º Examen de laboratorio
15 11 – 15 Nov 3er Examen de laboratorio
16 18 – 22 Nov Entrega de calificaciones (publicación)
Elaborado por: Silvia Leticia Bonilla Orozco
 NOMBRE DE LA PRÁCTICA Número y nombre de unidad
No. de temática en el programa de la
práctica asignatura
1 Titulación volumétrica y medición del pH 1 Equilibrio ácido-base

2 Regulación del equilibrio ácido-base ( discusión de casos) 1 Equilibrio ácido-base

3 Separación e identificación de aminoácidos por cromatografía en papel 2 Aminoácidos, proteínas y

enzimas

4 Separación e identificación de proteínas lácteas por electroforesis en gel de 2 Aminoácidos, proteínas y

poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) enzimas
5 Cinética de la enzima ureasa 2 Aminoácidos, proteínas y
enzimas
6 Cuantificación de proteínas por el método de Bradford 2 Aminoácidos, proteínas y
enzimas
7 Cuantificación de los niveles de glucosa 3 – 4 Bioenergética y
oxidación biológica de los
nutrientes.
8 Cuantificación de niveles de colesterol en suero sanguíneo por el método de 5 Química y metabolismo de
Liebermann-Burchard lípidos
9 Aislamiento y cuantificación del ADN 6 Nucleótidos y ácidos
nucléicos
7 Elementos bioquímicos que
intervienen en el flujo de la
información genética.
 9
MÉTODO CIENTÍFICO EXPERIMENTAL
INTRODUCCIÓN
Conforme fue aumentando el acervo de los conocimientos del hombre, se hizo
necesario: primero, distinguir entre el conocimiento adquirido por experiencias diarias y el
conocimiento científico
Los primeros conocimientos científicos fueron el resultado de un análisis minucioso
y disciplinado de la experiencia diaria; usa lenguaje especializado, debían ser precisos, es
decir, cada pregunta debía tener una respuesta y cada fenómeno una explicación, y estar
sujetos a comprobación.
Para hacer ese análisis disciplinado y ordenado de los fenómenos naturales, es
necesario seguir ciertas reglas; las reglas deben partir de algunas bases.
Cuando dichas reglas se aplican entonces podemos decir que se está aplicando un
método. Y el método científico permite al hombre de ciencia: obtener deducciones de los
conocimientos científicos ya existentes y buscar otros nuevos que contesten a las preguntas
que surjan.
Método científico es el conjunto de reglas que señalan el procedimiento para llevar
a cabo una investigación, cuyos resultados sean aceptados como válidos por la comunidad
científica. Es necesario mencionar que existen algunos métodos de carácter cualitativo que
para este caso específico no se utilizan.
El método científico auxilia constantemente al hombre no sólo en la investigación
científica sino en sus problemas cotidianos, aunque a veces es ignorado y en otras se resiste
a reconocerlo; inclusive, existen científicos que se expresan despectivamente de él, pero
siguen sus etapas con todo rigor.
El método experimental tiene siete reglas que se deben cumplir al realizar una
investigación; son las siguientes:

1. Delimitar y definir el objeto de la investigación o problema.

2. Plantear una hipótesis de trabajo.
3. Elaborar un diseño experimental.
4. Realizar el experimento.
5. Analizar los resultados.
6. Obtener conclusiones.
7. Elaborar un informe escrito.

1. Delimitar y definir el objeto de la investigación o problema

El paso inicial de un experimento, consiste en determinar claramente los objetivos y
las preguntas que haya que responder. Una vez formulados los objetivos y las preguntas,
podremos señalar cuáles son las variables independientes, cuáles las dependientes, los
parámetros constantes y la precisión necesaria en la medición de las variables.
Para poder lograr lo anterior es necesario tomar en cuenta los siguientes factores:
 La bibliografía existente.
 La región en que interesan los resultados.
  El equipo disponible y su precisión.
 El tiempo y dinero disponibles.

2. Plantear una Hipótesis de trabajo 10

Para cubrir esta regla del método experimental debemos tener la seguridad de qué tipo
de trabajo se va a realizar:
 Si se trata de verificar una hipótesis, una ley o un modelo, no es necesario plantear
una hipótesis de trabajo.
 Si el trabajo es complemento o extensión de otro, es posible que se pueda usar la
hipótesis del trabajo original o hacer alguna pequeña modificación.
 Si el problema por investigar es nuevo, entonces si será necesario plantear una
hipótesis de trabajo.
Una nueva investigación comienza con una suposición, un presentimiento o una idea
de cómo puede ocurrir un fenómeno. Estas ideas o suposiciones deben estar
suficientemente claras en la mente del científico para permitirle adelantar un “resultado
tentativo” de cómo puede ocurrir un cierto fenómeno. Cuando se adelanta este “resultado
tentativo”, se está planteando la hipótesis de trabajo que también puede ser un modelo.
Las ideas o presentimientos en el científico deben ser lo suficientemente claras como
para permitirle plantear la hipótesis de trabajo y las preguntas a responder, también deben
ser lo suficientemente imprecisas como para permitir que, durante la investigación, la
hipótesis o modelo se acepte, se rechace o se amplie.
El estudiante solo confirmará leyes o hipótesis conocidas por métodos conocidos, no
para “redescubrir” esas leyes o hipótesis, sino como ejercicio para un futuro trabajo
científico.

3. Elaborar un Diseño Experimental

Una vez conocida la naturaleza del problema (si es de investigación, ampliación o
confirmación), la precisión deseada, el equipo adecuado y planteada la hipótesis de trabajo,
se debe analizar si la respuesta a nuestro problema va a ser la interpretación de una gráfica,
un valor o una relación empírica; esto nos va a señalar el procedimiento experimental, es
decir, cómo medir, en qué orden, y qué precauciones tomar al hacerlo. Una vez
determinadas estas etapas, se procede a diseñar el experimento, que se hace siguiendo los
pasos que se dan a continuación:
 Determinar todos y cada uno de los componentes del equipo
 Acoplar los componentes
 Realizar un experimento de prueba
 Interpretar los resultados y comprobar la precisión, modificando, si es necesario,
el procedimiento y/o el equipo utilizado

4. Realizar el Experimento
Una vez que se ha llevado a cabo el experimento de prueba y la interpretación
tentativa de resultados, al realizar el experimento final se deben registrar las lecturas de las
mediciones, detectar cualquier anomalía que se presente durante el desarrollo del
experimento y trazar las gráficas pertinentes o calcular el o los valores que darán respuesta
al problema.
 Si el experimento se ha planeado con detalle, lo más probable es que producirá datos
valiosos, por lo que deberán ser analizados escrupulosamente para obtener los resultados
buscados.

5. Analizar los Resultados

El análisis o interpretación de resultados, ya sean valores, gráficas, tabulaciones, etc., 11
debe contestar claramente posible la o las preguntas planteadas por el problema.
En términos muy generales, el análisis puede comprender los siguientes aspectos:
1. Si el experimento busca confirmar una hipótesis, ley o modelo, los resultados deben
poner de manifiesto si hay acuerdo o no entre teoría (que así llamaremos a la
hipótesis, ley o modelo) y los resultados del experimento. Puede suceder que el
acuerdo sea parcial; si éste es el caso, también se debe presentar en qué partes lo
hay, y en cuáles no.
2. Si es un experimento que discrimine entre dos modelos, los resultados deben
permitir hacer la discriminación en forma tajante y proporcionar los motivos para
aceptar uno y rechazar otro.
3. Si lo que se busca es una relación empírica, ésta debe encontrarse al menos en
forma gráfica; lo ideal sería encontrar una expresión analítica para la gráfica, es
decir, encontrar la ecuación. A esta ecuación se le llama empírica porque se obtuvo
a través de un experimento y como expresión analítica de una gráfica.
Debe tenerse muy presente que en una gráfica, cada punto experimental tiene un margen de
error y que en caso de duda (cuando la curva no está bien determinada), debe hacerse un
mejor ajuste por medio de mínimos cuadrados. También se debe hacer notar la curva más
simple de analizar es la recta y que si no la obtuvimos al graficar nuestros puntos, debemos
intentar obtenerla efectuando un cambio de variable. Una vez hecho todo esto, nuestro paso
a seguir es elaborar las conclusiones.
6. Obtener Conclusiones
Una vez logrados los resultados del experimento, el investigador necesita hacer
conclusiones, es decir, debe aplicar su criterio científico para aceptar o rechazar una
hipótesis o una ley; también es posible que haga una conjetura acerca de un modelo, o
proponga la creación de otro nuevo, lo que conduciría a un nuevo problema.
Para poder conjeturar se aplica el siguiente criterio:
1. Rechaza una hipótesis, ley o modelo, cuando se comprueba experimentalmente que
no se cumple. Basta que exista un solo fenómeno que no pueda explicar para
desecharla.
2. Acepta como cierta (pero no como absolutamente cierta), una hipótesis, ley, teoría o
modelo, mientras no se tenga prueba de falla en la explicación de algún fenómeno.
3. Una vez determinado si se acepta, rechaza ó acepte parcialmente con el
experimento. Si este fuera el caso, es necesario especular acerca de las posibles
razones de la diferencia entre teoría y experimento, y tratar de hacer nuevas
hipótesis o modificaciones a la ya existente; esto nos conduce al inicio de un nuevo
problema.

7. Elaborar un informe escrito

La elaboración de un informe escrito sobre un trabajo científico, reviste una
importancia capital no sólo para comunicar sus resultados a la comunidad científica, sino
para dejar a la posteridad un eslabón que sirva en la evolución de la ciencia.
 Los requisitos para elaborar un informe escrito es; la claridad, orden y exactitud,
aunque también es indispensable aplicar las reglas gramaticales de ortografía, puntuación y
redacción.
De una manera más detallada, los informes pueden estructurarse de diversas formas
dependiendo de su complejidad, contenido y objeto.
En general, todos los informes de resultados que serán entregados en el laboratorio
de Bioquímica deberán contener las partes que veremos a continuación:
12
Sección preliminar

a) Portada
 Institución
 Dependencia
 Carrera
 Título y número de la práctica
 Nombre de los integrantes del equipo en orden alfabético
 Número de equipo
 Nombre de los profesores
 Grupo
 Fecha
b) Índice
c) Resumen
 Una cuartilla expresando los puntos más relevantes de la práctica, desde
objetivos, breve descripción de la técnica empleada en el experimento,
resultados y conclusiones más sobresalientes.
d) Introducción
 Planteamiento claro y ordenado del tema de la investigación, de su importancia
e implicaciones. En este punto debe recurrirse a referencias bibliográficas (1 a 2
cuartillas).
Marco teórico:
 Revisión bibliográfica relacionada con el tema En este punto deben incluirse las
referencias bibliográficas a lo largo del texto ( Autor, año) (mínimo 3 cuartillas)
e) Objetivos
 Identifican la finalidad hacia la cual se dirigió el experimento para dar
cumplimiento a los propósitos académicos. El objetivo debe responder a la
pregunta "qué", “cómo” y "para qué".

Cuerpo del trabajo

a) Material y Metodología
 En este apartado se podrá hacer uso de diagramas de flujo para describir la
metodología.
b) Resultados obtenidos
 Esta sección debe estar bien escrita, porque los resultados son los que avalarán
las conclusiones y justificarán la utilidad el trabajo realizado. Incluir las
fórmulas empleadas y las sustituciones de las mismas. Pueden presentarse en
cuadros y/o gráficamente.
c) Discusión
 Es el análisis de los resultados obtenidos y está debe además explicar aquellos
resultados inesperados que invaliden total o parcialmente alguna de las hipótesis
iniciales del trabajo. Debe comparar los resultados obtenidos en relación con los
de otros trabajos e indicar las posibles aplicaciones o implicaciones teóricas.

e) Conclusiones
 Aceptación o rechazo de los objetivos 13
 Síntesis de los aspectos fundamentales
f) Recomendaciones y sugerencias

Referencias

a) Bibliográfica
Laguna, J. y Piña, E. 1992. Bioquímica. Salvat. México.
b) Hemerográfica
Jaubert, A. and Martin, P. 1992. Reverse-phase HPLC analysis of goats caseins.
Indication of s1 and s2 genetic variants. Lait 72 : 235-247.
c) Otras fuentes
Revistas arbitradas científicamente
Páginas de la Internet (para figuras y/o tablas exclusivamente)

BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA
1. De la Vega, L. F. C. 1994. Método Científico. 2ª ed. Instituto Politécnico Nacional. México.
2. Munich, L. y Ángeles. E. 1990. Métodos y técnicas de investigación. 2ª ed. Trillas. México.
3. Rosas, L y Riveros, H. G. 1990. Iniciación al método científico experimental. 2ª ed. Trillas. México.

14
 INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

MATERIAL DE VIDRIO DEL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

INTRODUCCIÓN
Es importante conocer el uso correcto del material y equipo con el que se cuenta
dentro de cualquier laboratorio. Ello evitará que el trabajo experimental se vea afectado por
errores humanos. Todo material de laboratorio es costoso y específico por lo que es muy
importante conocerlo, saber sus usos y cuidados, evitando así, que se deteriore durante su
manejo.

OBJETIVOS
 Conocer el material de vidrio y equipo con el que cuenta el laboratorio de Bioquímica.
 Conocer la aplicación y uso correcto del material de vidrio.

Material a utilizar en el laboratorio:

Pipetas. En el laboratorio de Bioquímica, utilizamos dos tipos de pipetas:
 Volumétricas, con ellas podemos medir volúmenes fijos, ya que están
calibradas para un volumen específico.
 Graduadas, se emplean para medir volúmenes variables. Dentro de éstas
tenemos las terminales (serológicas) y las no terminales (de Mohr).

15
Matraz Erlenmeyer y vasos de precipitados. Son útiles para medir volúmenes variables y
tienen una variación en su exactitud de 5%, la cual viene inscrita en este material

Probeta y matraz volumétrico. Sirven para medir volúmenes fijos, en ellos podemos
aforar soluciones. En el caso de los matraces volumétricos, no encontraremos ningún tipo
de inscripción solamente presenta una línea de afore, la cual indica el volumen que se
puede verter en ellos.

16
Bureta. Son empleadas por lo general para hacer titulaciones ácidas o básicas. Miden
volúmenes variables y presentan en la parte final del cuerpo una llave, la cual permite el
paso o no de la solución que la contenga.

17
Embudo. Material útil para verter soluciones o solutos de material de vidrio estrecho, tales
como buretas o matraces. Existen tanto de vidrio como de plástico.

Tubo de ensaye y gradilla. Los tubos de ensaye son útiles para realizar diluciones de
volumen relativamente pequeño y/o hacer lecturas en aparatos como el fotocolorímetro.
Durante el manejo de los tubos, debe emplearse una gradilla a fin de mantenerlos en un
lugar fijo y seguro.

Cámara para cromatografía. Se emplea para cromatografía de papel ascendente. Aquí se

vierten los disolventes necesarios.

18
Bibliografía Consultada
1. Masterson, W.L., Slowinski, E.J. y Stanitski, C.L. 1987. Química general superior.
4ª ed. Interamericana. México.
2. Rosas, G.B. y Rico, P.J.L. 1998. Bases químicas e introducción al manejo de
muestras biológicas. Subcomisión de Capacitación y Área de Bioquímica y
Genética de MVZ. FES Cuautitlán, UNAM. México.
3. Skoog, D.A. y West, D.M. 1984. Análisis instrumental. 2ª ed. Interamericana.
México.

19
 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES
INTRODUCCIÓN
La mayoría de las reacciones estudiadas en bioquímica se llevan a cabo en solución,
de las cuales, las concentraciones basadas en una cantidad disuelta de soluto por unidad de
volumen, son las más ampliamente usadas en bioquímica.
Las soluciones se definen como mezclas homogéneas de dos o más sustancias, sus
componentes son el soluto (es el que se va a disolver) y el solvente o disolvente (es el que
disuelve al soluto). Por lo general, el soluto se encuentra en menor cantidad y proporción
con respecto al solvente. En el laboratorio, es muy importante saber preparar soluciones de
todo tipo, ya que el estado líquido es el más adecuado para trabajar, puesto que, es difícil
efectuar reacciones entre sólidos y gases sin contar con una gran cantidad de equipo en el
laboratorio. Los líquidos se mezclan con bastante rapidez, pueden medirse exacta y
eficazmente con equipo volumétrico.
El disolvente más común es el agua, tomándola como un disolvente típico,
examinaremos el proceso de disolución. Las moléculas del agua son muy polares por lo
que atraen a otras moléculas polares y a los iones, por ejemplo: si un cristal de cloruro de
sodio (NaCl) se introduce en agua, los iones de la superficie cristalina atraen a las
moléculas polares de agua y gradualmente los rodean separándolos de los iones
superficiales, por lo tanto, los iones se hidratan y ya no se quedan sujetos al cristal,
gradualmente, se desplazan del cristal a la solución, ésta separación iónica se llama
disociación.
Si los líquidos son completamente solubles entre sí, entonces son miscibles como el
agua y el alcohol, sin embargo, si no se disuelven entre sí son inmiscibles, como el vinagre
y el aceite.

OBJETIVOS
 Conocer los conceptos de las soluciones más empleadas en el laboratorio de
Bioquímica.
 Aplicar estos conceptos en la realización de ejercicios, así como conocer algunas
medidas de precaución en la preparación de dichas soluciones.

SOLUCIONES EMPÍRICAS
La relación que existe entre el peso del soluto y el peso del solvente recibe el
nombre de concentración. De acuerdo con la concentración una solución puede ser:
 Solución diluida. Aquella que contiene una cantidad relativamente pequeña de
soluto por unidad de volumen, es decir, la cantidad de soluto es menor en relación a
la cantidad de solvente.
 Solución concentrada. Aquella que contiene una cantidad relativamente grande de
soluto y éste sigue siendo soluble en el solvente.
 Solución saturada. Es aquella en la cual la sustancia disuelta se encuentra en
equilibrio con la sustancia no disuelta, es decir, al agregarse gran cantidad de soluto,
éste no se disuelve, se asienta en el fondo del recipiente.
 Solución sobresaturada. Aquella que contiene mayor cantidad de soluto que la
saturada, es decir, existe exceso de soluto y al añadirle más, se cristaliza parte del
que estaba ya disuelto. Para disolver dicha cantidad de soluto, la temperatura debe
ser mayor a la ambiental lo cual hace que la solución al enfriarse sea inestable.

20
 SOLUCIONES VALORADAS
Existen varios métodos para determinar con exactitud la concentración de una solución
acuosa:
Solución porcentual (%). Representa los gramos de soluto presentes en 100 partes de
solución (g o mL), pudiendo ser la concentración porcentual en masa o volumen.
Solución molar (M). Es el peso molecular (PM) del soluto, expresado en gramos
(moles) por cada 1000 mL de solución (1 L).
M = moles / 1000 ml
Solución normal (N). Es el número de equivalentes del soluto por cada 1000 mL de
solución.
N = equivalentes químicos / 1000 mL
El número de equivalentes se obtiene dividiendo el PM entre el número de valencia
de la sustancia en cuestión, el cual corresponde al número de H+ o OH–
intercambiables.
Solución molal (m). Son los moles de soluto por cada 1000 g de solvente (o 1 Kg)
m = moles / 1000 g

EJEMPLOS DE PREPARACIÓN DE SOLUCIONES VALORADAS

Porcentuales (%)
(V / V) Preparar 100 mL de una solución de alcohol al 40 %.
 Se miden 40 mL de alcohol cbp 100 mL de agua destilada

(P / V) Preparar 300 mL de NaCl al 0.9 %

0.9 g ---------100 mL
X ----------- 300 mL = 2.7 g
 Se pesan 2.7 g de NaCl y se afora a 300 mL con agua destilada

Molares (M = moles/ 1000 mL)

Preparar 1 L de NaCl al 1 M
 Determinar PM del soluto:
Na ( 23 ) + Cl ( 35.5 ) = 58.5 g . Esto representa 1 mol de soluto
 Como se requiere una sol. 1 M y 1 L de la misma, Pesar 58.5 g de NaCl y se aforan a
1000 mL con agua destilada
Preparar 350 mL de NaOH al 0.1 M
 Determinar PM del soluto:
Na ( 23) + O ( 16 ) + H ( 1 ) = 40 g
40 g ------------->1 M
X <-------------- 0.1 M X=4g

4 g -------------- 1000 mL
X <------------- 350 mL X = 1.4 g
 Se pesan 1.4 g de NaOH y se afora a 350 mL con agua destilada
 El matraz debe contener un poco de agua antes de agregar la base, disolver
perfectamente, posteriormente aforar al volumen requerido.

21
Normales (N = equivalentes químicos / 1000 mL)
Preparar 1 L de H2SO4 al 1 N
 Como se trata de un reactivo líquido, se requiere conocer la densidad que
en este caso es de 1.53 g / mL y la pureza que es de 95 %.
 Determinar PM del soluto:
H (1 x 2 ) + S ( 32 ) + 0 ( 16 x 4) = 98 g
 Determinar el número de equivalentes químicos. Como esta sustancia
tiene por fórmula 2 H , el PM se divide entre 2: 98 / 2 = 49 g , lo cual
corresponde a 49 equivalentes por cada litro.
 Recordando que la densidad es D= m / V, donde m = masa y V = volumen y
como el reactivo es líquido, requeriremos tomar un volumen determinado por
ello despejamos V = m / D, sustituyendo: V= 49 g / 1.53 g/mL, tenemos que V =
32 mL.
 La mayoría de los ácidos tienen un grado de pureza menor al 100%, por
lo tanto, para preparar una solución con 100% de pureza se realiza el siguiente
cálculo: 32 mL x 100 / 95 = 33.7 mL. Esto significa que se deben tomar 33.7 mL
del reactivo y se afora a 1000mL. Es importante aclarar que, tratándose de ácidos
concentrados, se debe agregar primero una cantidad de agua en el matraz donde
se verterá el ácido, posteriormente se debe aforar al volumen requerido.
Preparar 500 mL de NaOH al 0.1 N
 Al tratarse de un sólido no requerimos densidad ni pureza
 Determinar el PM del soluto:
Na ( 23 ) + O ( 16 ) + H ( 1 ) = 40 g
 La fórmula posee un solo OH por ello el número de equivalentes = 40 g
Dado que se requiere una solución 0.1N:
40 g ------------>1 N
X <------------- 0.1 N X=4g

4 g ------------->1000 mL
X <------------- 500 mL X=2g
 Se pesan 2 g de NaOH y se afora a 500 mL con agua destilada
 El matraz debe contener un poco de agua antes de agregar la base,
disolver perfectamente y posteriormente aforar al volumen requerido.
Para la preparación de reactivos se debe saber el manejo de sustancias y líquidos. Las
sustancias corrosivas son de uso delicado y deben de manejarse con precaución, pues al
entrar en contacto con la piel o la ropa pueden producir quemaduras.

RECOMENDACIONES
 Nunca se vierta agua en ácido o álcali concentrado. Viértase siempre lentamente el
ácido en el agua, al mismo tiempo que se mezcla.
 Nunca “pruebe” el sabor ni el olor de cualquier reactivo químico.
 Si su piel tiene contacto con cualquier reactivo sólido o líquido, lávese
inmediatamente con abundante agua.
 Para pipetear utilizar la propipeta. Nunca pipetear con la boca.

22
 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES A PARTIR DE SOLUCIONES STOCK
Las soluciones stock o madre pueden ser útiles para la preparación de otras más
diluidas. Esto permite que ahorrar reactivos y aprovechar soluciones concentradas para
otras más diluidas. Para comprender mejor lo anterior, emplearemos un ejemplo.
Tenemos una solución stock de HCl a una concentración de 1.0 M y un volumen de 250
mL. ¿Cuántos mililitros se necesitan de esta solución para preparar 50 mL a una
concentración de 0.3 M?
 Utilizaremos la siguiente fórmula para su preparación
C1  V1 = C2  V2
En donde
C1= Concentración de la solución stock
V1= Volumen requerido de la solución stock
C2= Concentración de la solución requerida
V2= Volumen de la solución requerida
 De acuerdo a la ley de acción de masas, la quedaría de la siguiente manea
V1= (C2) (V2)
C1
 Sustituyendo
V1= (0.3 M) (50mL) = 15 mL
1M
 Se miden 15 mL de la solución stock y se afora a 50 mL con agua destilada para
obtener la concentración requerida.

BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA
1. Hess, G. G. y Uno, K. 1998. Química General Experimental. CECSA, México.
2. Farías, M. G. 1988. Química Clínica. 9ª. El Manual Moderno, México.
3. Holkova, Ludmila. 1988. Química Analítica Cuantitativa. Trillas, México.

23
 PH Y SISTEMAS AMORTIGUADORES

PRÁCTICA 1. TITULACIÓN VOLUMÉTRICA Y MEDICIÓN DEL PH

INTRODUCCIÓN
Las soluciones empleadas en volumetría y cuyas concentraciones deben ser
conocidas con mayor exactitud, cuanto mejores resultados analíticos se desee obtener,
reciben el nombre de soluciones valoradas o soluciones tituladas.
Para determinar la concentración de una solución desconocida se utiliza una
segunda solución de concentración conocida, que al mezclarse con la primera experimenta
una reacción química específica. La solución de concentración conocida se llama solución
valorada. Valoración o titulación es el proceso de determinación del volumen necesario de
la solución valorada para reaccionar con una cantidad determinada de la solución a analizar.
En la determinación de la concentración desconocida de un ácido se utiliza una base de
concentración conocida. En la determinación de la concentración desconocida de una base
se utiliza un ácido de concentración conocida. Se realizo una acidimetría o una alcalimetría
respectivamente. En la reacción de neutralización, los iones de hidrogeno provenientes
del ácido y los iones oxhidrilo de la base reaccionan formando agua:

HCl + NaOH H 2O + NaCl

H+ (ac) + Cl- (ac) + Na+ (ac) + Cl- (ac) H2O (1) + Na+ (ac) + Cl- (ac)

Los aniones del ácido y los cationes de la base son iones espectadores, la reacción que
verdaderamente tiene lugar es:

H+ (ac) + OH- (ac) H2O (1)

Cuando se han mezclado cantidades equivalentes de ácido y de base se dice que se llega al
punto de equivalencia de la titulación. En el punto de equivalencia el número de H+ debe
ser igual al número de OH-.

Utilizando un reactivo indicador, que tiene distinto color en solución ácida o en

solución básica, el cambio de color indica que toda la solución problema se ha neutralizado.
INDICADORES DE PH
Los indicadores (Cuadro 1) usados en alcalimetría y acidimetría son sustancias
orgánicas de carácter ácido o básico muy débil, y que tienen la propiedad de cambiar de
coloración cuando el medio pasa de un pH determinado a otro.

Cuadro 1. Indicadores más utilizados en alcalimetría y acidimetría

Nombre común Intervalo viraje pH Color ácido Color alcalino
Naranja de metilo 3.1 - 4.4 Rosa Amarillo
Rojo de metilo 4.4 - 6.0 Rosa Amarillo
Fenolftaleina 8.3 - 10.0 Incoloro Rosa violeta
Amarillo de alizarina 10.1 - 12.0 Amarillo Violeta

24
 ESCALA DE PH
La escala de pH representa las concentraciones de H+ y OH- en cualquier solución
acuosa. Srensen (1909), la propuso como el logaritmo recíproco de la concentración de
dichos iones, expresión que en forma simplificada se conoce como pH, con la siguiente
ecuación:

pH = log 1 = -log H+

H+

El valor de 7 para el pH de una solución exactamente neutra no es una cifra escogida de

manera arbitraria, proviene del valor absoluto del producto iónico del agua a 25° C. Las
soluciones que tienen un pH superior a 7 son alcalinas o básicas; las soluciones con un pH
inferior a 7 son ácidas. La escala de pH es logarítmica, no aritmética. Decir que el pH de
dos soluciones difiere en 1 unidad de pH significa que una solución tiene una concentración
de H+ cien veces superior al de la otra, pero no nos dice cual es el valor absoluto de la
diferencia. Se puede medir aproximadamente el pH de una solución acuosa utilizando
diversos colorantes indicadores, entre ellos el tornasol, la fenoftaleína y el rojo de fenol,
que experimentan cambios de color cuando se disocia un protón de la molécula de
colorante.
Las determinaciones precisas del pH en el laboratorio de químico se hacen con un
electrodo de vidrio que es selectivamente sensible a la concentración de H+ pero que es
insensible al Na+, K+ y otros cationes. En un potenciómetro se amplifica la señal de un
electrodo de este tipo y se compara con la señal generada por una disolución cuyo pH se
conoce con exactitud.
El pH afecta a la estructura y actividad de macromoléculas biológicas; por ejemplo
la actividad catalítica de las enzimas tiene una gran dependencia del pH, el pH de orina y
sangre es útil para diagnosticar enfermedades, etc.
La definición de ácidos y bases de Brönsted y Lowry, menciona que un ácido, es
un compuesto capaz de donar protones y una base es un compuesto capaz de aceptarlos.
Esta definición también puede ser formulada como la disociación de un ácido en una base y
un protón: ecuación (1)

Ácido Base + H+

Los ácidos y las bases pueden ser clasificados como fuertes o débiles dependiendo
de su grado de ionización. Un ácido fuerte es aquel que dona protones con facilidad, el
cual, en la ecuación (2) procederá rápidamente a la derecha; debido a que el ácido es
totalmente ionizado.
Los ácidos débiles por definición, se ionizan sólo parcialmente en soluciones
acuosas.
HA H+ + A-

Los valores de pH más frecuentes en soluciones de interés bioquímico, van en un

intervalo de 4 a 11. (Ver Apéndice 1, cuadro 3).

25
OBJETIVOS
 Preparar y valorar soluciones ácidas y básicas.
 Aprender a realizar los cálculos para conocer la concentración de H+ y/o OH- de
soluciones con normalidad o molaridad desconocida.
 Evaluar el pH de una solución con una concentración determinada de H+ y/o OH-
antes y después de su titulación.
 Determinar el pH por medio de un potenciometro de algunas muestras y
posteriormente comparar este pH adicionando naranja de metilo

MATERIALES
Material y equipo Reactivos y soluciones
2 Matraces volumétricos de 50 Ml Ácido clorhídrico (HCl) concentrado
2 Matraces Erlenmeyer de 250 mL Hidróxido de sodio (NaOH)
2 vasos de precipitados de 250 mL Naranja de metilo 0.04%
1 Pipeta de 1 mL Solución problema 1 y 2 de HCl
2 Pipetas de 10 mL Solución problema 1 y 2 de NaOH
1 Bureta de 25 o 50 mL Agua destilada
1 Soporte universal con pinzas para bureta
1 Embudo
1 Propipeta
Potenciómetro
MATERIAL QUE DEBERÁ TRAER CADA EQUIPO DE TRABAJO
Gafas protectoras Toallas de papel
Plumón de tinta indeleble Cubre bocas
Guantes de vinilo o latex Detergente
Muestras líquidas para medir pH

METODOLOGÍA
1. Realice los cálculos para preparar 50 mL de una solución 0.20 N de HCl. Las
propiedades del HCl se encuentran en el apéndice 1, cuadro 3.
2. Para preparar la solución 0.2 N de HCl, vierta primero al matraz volumétrico
aproximadamente 20 mL de agua desilada. Prepare la pipeta de 1 mL con la propipeta,
nunca aspire con la boca, emplee la propipeta y tome la cantidad de ácido obtenido
del punto anterior. Vierta el ácido al matraz volumétrico ( que previamente debe tener
un volumen de agua destilada).
3. Después de haber agregado el ácido en el matraz afore a 50 mL y mezcle
perfectamente.
4. Rotule el matraz indicando el tipo de solución.
5. Realice los cálculos para preparar 50 mL de una solución 0.20 N de NaOH. Las
propiedades del NaOH se encuentra en el apéndice 1, cuadro 3.

26
6. Pesar la cantidad obtenida en los cálculos realizados anteriormente y adicione al otro
matraz volumétrico.
7. Adicione un poco de agua destilada, agite muy bien hasta que el NaOH quede
completamente disuelto y afore a 50 mL con agua destilada.
8. Rotule la solución preparada.
Valoración acidimétrica
1. Llene la bureta de 50 mL con la solución de NaOH estándar. Es muy importante
sacar el aire de la punta de la bureta para lo cual deberá poner un vaso de precipitados
bajo ésta, abra la llave de la bureta permitiendo que el aire salga cuando fluya la
solución y cierre. Anote el número de la graduación en donde quedó su solución para
posteriormente anotar los mililitros que gasta en la titulación.
2. Mida 10 mL de la solución ácida problema 1 con la pipeta y viértalos en el matraz
Erlenmeyer, adicione 2 gotas del indicador naranja de metilo 0.04%. Anote el color
que adquiere la solución y mida el pH con el potenciómetro.
3. Titule la solución colocando el matraz debajo de la bureta, abra la llave con la
mano izquierda y regulando un goteo lento, agite suave y continuamente con la mano
derecha. Evite que la punta de la bureta roce con el matraz pues el material puede
romperse.
4. En el momento que la solución problema comience a cambiar de color (virar), a
una coloración canela (o durazno), cierre la llave de la bureta y anote la cantidad en
mililitros de NaOH estándar agregado.
5. Mida nuevamente el pH de la solución problema y anote los resultados.
6. La solución problema de HCl 1 ya titulada, deberá verterla en el vaso de
precipitados rotulado como “CONTENEDOR DE RESIDUOS”
7. Realizar nuevamente los pasos del 2 al 6 para la solución ácida problema 2.
8. En caso de que la solución titulada tome una coloración amarilla, indicará un exceso
de NaOH estándar agregado, lo cual traerá como consecuencia errores en la
determinación de la concentración del ácido problema. Si se da este caso, volver a
titular.
9. Una vez realizadas las dos titulaciones vierta la solución de NaOH estándar que
tiene la bureta en el otro vaso de precipitados que rotulará como “CONTENEDOR DE
RESIDUOS”.
10. Enjuague la bureta con agua destilada estando la bureta en el soporte universal. El
agua de los enjuagues será vertida al contenedor de las soluciones de NaOH.
11. Para obtener la normalidad de la solución ácida problema se utiliza la siguiente
fórmula:
N1V1 = N2 V2
En donde:
N1 = Concentración (N) de la solución ácida problema
V1 = Volumen de la solución ácida problema
N2 = Concentración (N) de la solución de NaOH estándar
V2 = Volumen de la solución de NaOH estándar

Valoración alcalimétrica
1. Llene la bureta de 50 mL con la solución de HCl estándar. Es muy importante sacar el
aire de la punta de la bureta para lo cual deberá poner el vaso de precipitados bajo
ésta, abra la llave de la bureta permitiendo que el aire salga cuando fluya la solución y
 cierre. Anote el número de la graduación en donde quedó su solución para
posteriormente anotar los mililitros que gasta en la titulación.
2. Mida 10 mL de la solución alcalina problema 1 con la pipeta y viértalos en el matraz
Erlenmeyer, adicione 2 gotas del indicador naranja de metilo 0.04%. Anote el color
que adquiere la solución y mida el pH con el potenciómetro.
3. Titule la solución colocando el matraz debajo de la bureta, abra la llave con la mano
izquierda y regulando un goteo lento, agite suave y continuamente con la mano
derecha. Evite que la punta de la bureta roce con el matraz pues el material puede
romperse.
4. En el momento que la solución problema comience a cambiar de color (virar), a una
coloración canela (o durazno), cierre la llave de la bureta y anote la cantidad en
mililitros de HCl estándar agregado.
5. Mida nuevamente el pH de la solución problema y anote los resultados.
6. La solución problema de NaOH 1 ya titulada, deberá verterla en el vaso de
precipitados rotulado como “CONTENEDOR DE RESIDUOS”
7. Realizar nuevamente los pasos del 2 al 6 para la solución alcalina problema 2.
8. En caso de que la solución titulada tome una coloración rosa, indicará un exceso de
HCl estándar agregado, lo cual traerá como consecuencia errores en la determinación
de la concentración del ácido problema. Si se da este caso, volver a titular.
9. Una vez realizadas las dos titulaciones vierta la solución de HCl estándar que tiene la
bureta en el vaso de precipitados que rotuló como “CONTENEDOR DE RESIDUOS”
10. Enjuague la bureta con agua destilada estando la bureta en el soporte universal. El
agua de los enjuagues será vertida al contenedor de las soluciones de HCl.
11. Para obtener la normalidad de la solución ácida problema se utiliza la siguiente
fórmula:
N1V1 = N2 V2
En donde:

N1 = Concentración (N) de la solución alcalina problema

V1 = Volumen de la solución alcalina problema
N2 = Concentración (N) de la solución de HCl estándar
V2 = Volumen de la solución de HCl estándar

1. Una vez concluidas las cuatro titulaciones se procederá al desecho de las soluciones
de los contenedores. (Esto se realizará posteriormente a través de la neutralización
de las soluciones ácidas con las soluciones alcalinas, hasta llegar a un pH 7, el cual
se medirá con el potenciómetro.)
2. Lave el material de vidrio que se le proporcionó con detergente y elimine el exceso
de agua de la parte externa del material con toallas absorbentes.

Medición del pH de diversas muestras.

1. Mida el pH de las soluciones que cada equipo haya traído a la práctica.
2. Anote los resultados de la medición en un cuadro
Resultados
1. Complete el siguiente cuadro con los resultados obtenidos en cada una de las etapas
de la práctica, muéstrelos a los profesores y posteriormente discútalos con en
grupo.

RESULTADOS DE LAS TITULACIONES

Solución Gasto de Normalidad pH inicial pH final

Problema titulante (mL)
Ácida 1

Ácida 2

Alcalina 1

Alcalina 2

2. Realice la medición de pH de las muestras. Anote sus resultados en el cuadro.

Muestra pH

BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA PARA ESTA PRÁCTICA

Ayres, G. 1980. Química Analítica Cuantitativa. Harla, México
Bohinski, R.C. 1998. Bioquímica. Reverté, S.A., Barcelona
Lehninger, A. 1998. Bioquímica, Omega, Barcelona
Orozco, F. 1993. Análisis químico cuantitativo. Porrúa. México
Rending, G. 1971. Experimental Methods in Modern Biochemistry, W.B. Sanders
Company. USA
Segel, I. H. 1976. Biochemical calculations. John Wiley & sons, Inc. London

29
 PRÁCTICA 2. REGULACIÓN DEL EQUILIBRIO ÁCIDO-BASE
INTRODUCCIÓN
El sistema de regulación ácido-base protege al organismo contra las modificaciones
de pH debidas principalmente a la continua formación de diversos ácidos producidos en el
curso del metabolismo; de hecho, el pH del líquido extracelular es muy constante entre 7.35
y 7.45. En los mamíferos, la vida es incompatible con valores de pH en la sangre menores
de 7 o mayores de 8.

La mayoría de las sustancias degradadas en el organismo producen CO 2 como

producto final, el cual se combina con el H2O y forma ácido carbónico (H2CO3) en gran
cantidad, hasta 20 o más moles de ácido por día, equivalente a 2 litros de HCl concentrado.
Como el H2CO3 tiene la enorme ventaja de ser eliminado en forma de CO 2 a través de la
respiración, se facilita el mantener constante la composición de los compartimientos
líquidos de los animales.

MECANISMOS DE REGULACIÓN

Estos mecanismos impiden que existan alteraciones en el equilibrio ácido- base y se

les conoce como sistemas amortiguadores. De estos, el más efectivo en los mamíferos es
el formado por el HCO3-/H2CO3, pues el organismo dispone de cantidades casi ilimitadas
de H2CO3 proveniente de la hidratación del CO2 metabólico. Sin embargo, no es el único
presente en el organismo, las proteínas plasmáticas y celulares, la hemoglobina del glóbulo
rojo y los fosfatos intra y extracelulares intervienen también en los procesos de
neutralización.

MECANISMOS COMPENSATORIOS
Cuando se presenta una alteración en el equilibrio ácido-base, participan dos tipos
de compensación: respiratoria y renal. En la respiratoria, participan los cambios en la
frecuencia y volumen respiratorios que afectan el transporte de oxígeno en la sangre, el
efecto amortiguador de la hemoglobina y la eliminación del H2CO3 (en forma de CO2) a
través de los pulmones. La cantidad de CO2 en los pulmones, aumenta o disminuye a
medida que crecen o decrecen la velocidad y profundidad de las respiraciones. A su vez, el
pH y la pCO2 en la sangre influyen en la amplitud y frecuencia de los movimientos
respiratorios. Por ejemplo, una elevación en la concentración sanguínea de H2CO3 se refleja
en una mayor pCO2 en la sangre y una disminución del pH; ambos factores, a través del
sistema nervioso central, estimulan los movimientos respiratorios y así eliminan más CO 2,
por los pulmones; con ello baja progresivamente la pCO2 en la sangre, sube el pH y
desaparece el estímulo de los movimientos respiratorios; éstos ajustan su frecuencia y
amplitud y se expulsa menos CO2, disminuyendo la concentración de H2CO3. Se restablece
así la relación [HCO3-]/ [H2CO3] normalmente de 20 a 1 moles, respectivamente.
En el mecanismo compensatorio renal se lleva a cabo la eliminación de los ácidos
fijos, o sea, los H+; mientras éstos se excretan se combinan con el HCO 3- impidiendo así
cambios importantes en el pH. Los ácidos fijos producidos en el metabolismo son cerca de
100 mEq diarios; el riñón los elimina al mismo tiempo que recobra la reserva alcalina
(HCO3-) para que el organismo siga contando con capacidad amortiguadora. El ajuste en el
pH urinario depende de la disponibilidad de ácidos fijos, H+, necesarios para acidificar la
orina o la de HCO3- necesario para alcalinizarla.

ECUACIÓN DE HENDERSON-HASSELBALCH
Para conocer el pH de un sistema amortiguador como el del HCO 3-/H2CO3, se
emplea la ecuación (1) de Hendersson-Hasselbach, sin embargo es necesario conocer el pK
del ácido débil del para el par amortiguador, en este caso el pK del H2CO3 es de 6.1.

pH = pKa + log [HCO-3] (1)

[H2CO3]

OBJETIVOS
 Discutir casos clínico auxiliándose de los conocimientos adquiridos en teoría,
acerca del tema por equipo.
 Discutir los mecanismos compensatorios del desequilibrio ácido-base que se
presentan en el mismo caso clínico con ayuda de los profesores

METODOLOGÍA
1. Lea con su equipo el caso clínico y discuta con sus compañeros el tipo de alteración que
se presenta en el equilibrio ácido-base.
2. Una vez que el equipo haya determinado la alteración que se está presentando en el
animal al que hace referencia el caso clínico, discuta como compensan los mecanismos
renal y/o respiratorio dicha alteración.
3. En el caso de la compensación renal y con base a su discusión en equipo, especifiquen
si el riñón produce orina ácida o alcalina.
4. Al término de la práctica, se discutirá cada caso clínico frente al grupo.

BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA PARA ESTA PRÁCTICA

Manual de prácticas de Bioquímica para la carrera de MVZ. FES Cuautitlán, UNAM.

México.
Laguna, J. y Piña, E. 1992. Bioquímica. Salvat. México.
Lehninger, A. 1998. Bioquímica. Omega, Barcelona.
Montgomery R. 1992. Bioquímica. 5ª. ed. Mosby Year Book. Wolfe Publishing. España.
Murray, R.K., Granner, D.K., Mayes, P.A. y Rodwell, V.W. 2000. Bioquímica de Harper.
15ª. Manual Moderno. México.

31
 MÉTODOS DE SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE
AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS

PRÁCTICA 3. SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS

POR CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
INTRODUCCIÓN
En los laboratorios de bioquímica, frecuentemente es necesario separar, purificar e
identificar los componentes de mezclas complejas. Sin embargo, dado que los componentes
individuales de dichas mezclas suelen ser muy parecidos entre sí, en lo que se refiere a sus
propiedades físicas y químicas, se requiere emplear técnicas especializadas, las cuales
permitan lograr tal separación.
Una de las técnicas antes referidas es la cromatografía, la cual se define como una
técnica de separación de los componentes de una mezcla por migración diferencial. Es así
como la cromatografía puede ser identificada como una técnica para separar mezclas de
solutos, basándose en las diferentes velocidades con que se mueven todos y cada uno de
tales solutos a través de un soporte; en tal caso, los solutos son arrastrados por un
disolvente en movimiento. La separación se lleva a cabo según la distinta interacción que
presenta cada uno de los componentes de una muestra respecto a la fase móvil y a una fase
estacionaria.
De acuerdo con el o los tipos de interacción que se establece entre las sustancias a
separar con la fase estacionaria, se ha agrupado a los diversos tipo de cromatografías en:
cromatografía de adsorción, de reparto, de intercambio iónico, de penetrabilidad o de
afinidad; las cuales, a su vez, en función del tipo de soporte y/o eluyente empleado, pueden
ser identificadas como, por ejemplo: en capa fina, en columna o en papel y aun más
sofisticadas como las de alta resolución en fase líquida (HPLC) o de gas.

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
Esta técnica se basa en la separación de una mezcla de compuestos, los cuales se
asocian de manera preferencial, con relación a su naturaleza química, a dos fases distintas,
una que es la fase móvil (constituida por una mezcla de solventes a la que se le denomina
“eluyente”) y otra, que es la fase estacionaria, misma que en tal caso está representada por
las moléculas de agua inmersas entre las moléculas de celulosa que conforman al papel.
Este tipo de cromatografía resulta ser muy versátil y sus métodos se han empleado
con mucha frecuencia en los protocolos de separación de moléculas. Aunque, diversas
clases de compuestos pueden ser separados por este método, la separación va a depender de
la selección del adsorbente y el sistema de solventes, para lo cual es necesario considerar la
polaridad de la muestra, misma que está determinada por el número y tipo de grupos
funcionales presentes en los compuestos por separar.
La aplicación de la técnica puede ser muy variada, así, por ejemplo, suele emplearse
para la separación de aminoácidos en sangre y orina, en humanos como una prueba
preliminar para fines de diagnóstico a nivel pediátrico. En medicina veterinaria este tipo de
análisis puede resultar de interés al momento de desarrollar proyectos específicos de
investigación, o bien, con fines diagnósticos también, como en el caso de cistinuria en
perros, así como en estudios comparativos de excreción renal en mamíferos. Cabe señalar
al respecto que, en perros alimentados con una dieta rica en proteínas se ha observado
excreción anormal de aminoácidos en cantidades excesivas de taurina y glutamina.

SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS
Los aminoácidos con grandes cadenas laterales no polares, tales como: Leu, Ile,
Fen, Trp, Val, Met y Tir, migran más lejos sobre un cromatograma, en comparación con
aquellos que presentan cadenas laterales más cortas no polares (Pro y Ala) o con los que
tienen cadenas laterales polares (Tre, Glu, Ser, Arg, Asp, His, Lis, Cis). Ello es
consecuencia de que existe una mayor solubilidad relativa de las moléculas polares en una
fase estacionaria hidrófila, así como una mayor afinidad de las moléculas no polares en
solventes orgánicos.

DETERMINACIÓN CUALITATIVA
Existen sustancias que detectan de manera específica a los aminoácidos, resultando
de gran utilidad para la identificación de aquellos, dentro de la cromatografía. Tales
sustancias son, entre otras, la ninhidrina y la fluorescamina. La ninhidrina, que es la
sustancia que será utilizada en esta práctica, lo que hace es descarboxilar, por oxidación, a
los alfa-aminoácidos, convirtiendo a los grupos funcionales Carboxilo y Amino, en CO2,
NH3, respectivamente, resultando también la formación de un aldehído que va a presentar
un átomo de carbono menos con respecto del aminoácido precursor. Una vez que la
ninhidrina (la cual fue reducida durante la reacción) interacciona con el amoniaco liberado,
se forma un complejo coloreado azul, mismo que puede ser identificado mediante un
espectrofotómetro, ya que absorbe la luz dentro de una longitud de onda de 570 nm. Cabe
señalar que la prolina y la hidroxiprolina, se comportan de diferente manera, ya que, en
lugar del color azul, producen un color amarillo al reaccionar con la ninhidrina, pues
presentan su máxima absorción a 440 nm. La reacción de la ninhidrina con los aminoácidos
se muestra en la Figura 1.

Figura 1. Reacción de la ninhidrina con un aminoácido

OBJETIVOS
 Conocer el principio de separación por cromatografía en papel y a través de ello,
comprender su importancia al ser empleada como técnica de separación de
moléculas, tales como los aminoácidos
 Realizar la separación de aminoácidos por cromatografía en papel e identificar los
aminoácidos presentes en una mezcla a través del uso de aminoácidos patrón.

33
MATERIALES
Material Reactivos y soluciones
1 Pieza de papel Whatman No. 3 (10 x 8 cm) Solución de Fenilalanina 1%
1 Cámara cromatográfica Solución de Leucina 1%
6 tubos capilares Solución de Prolina 1%
1 Parrilla eléctrica Solución de Glicina 1%
Solución de Histidina 1%
Solución de Ninhidrina 0.05%
Material que deberá traer cada equipo Eluyente: v/v/v/v
Regla y lápiz Butanol/acetona/ácido acético/agua
2 Pinzas de disección sin dientes de ratón 7.0/7.0/1.5/4.5
1 Par de guantes de látex Muestra biológica
Cubre bocas por cada integrante Mezcla de aminoácidos

METODOLOGÍA
1. Sujete el papel de cromatografía (cromatograma) por los bordes empleando pinzas
de disección , pues las yemas de los dedos no deben tener contacto con la superficie
del mismo.
2. A 0.5 cm del extremo inferior del cromatograma, marque, con lápiz, seis cruces
muy finas y bien distribuidas a lo largo de los 10 cm. de este, las cuales indicarán la
posición respectiva para cada aminoácido y de la mezcla.
3. Coloque con un capilar, en el centro de la primera cruz, una pequeña muestra del
aminoácido Histidina, en la segunda la Fenilalanina, en la tercera la Prolina, en la
cuarta la Glicina y, en la quinta, la Leucina (estos 5 aminoácidos serán los
aminoácidos patrón). En la sexta, se coloca la mezcla de aminoácidos problema, tal
como se ilustra en la Figura 2.

X X X X X X 0.5 cm
His Phe Pro Gly Leu Mezcla

Figura 2. Distribución de los aminoácidos en el cromatograma

4. Una vez que se hayan secado las aplicaciones, es conveniente realizar una segunda
en el mismo orden.
5. Proceda a colocar el cromatograma dentro de la cámara de cromatografía (Figura 3),
la cual habrá sido previamente preparada con el eluyente saturado dentro de las 24
horas anteriores a su uso. Al momento de colocar el papel dentro de la cámara,
deberá tener cuidado de que no se rebase el nivel de aplicación de las muestras,
antes de comenzar a ascender por capilaridad.

34
 Figura 3. Forma de colocar el comatograma dentro de la cámara cromatográfica
(nota: el eluyente será transparente)

6. Cierre la cámara y deje desarrollar el corrimiento cromatográfico hasta que el

eluyente haya llegado aproximadamente 0.5 cm antes del borde superior.
7. Retire el cromatograma de la cámara y seque por calentamiento en la parrilla,
evitando quemar el papel. Puede auxiliarse de las pinzas de disección sin dientes de
ratón para el manejo de este.
8. Una vez seco el cromatograma, rocíe sobre este la solución de ninhidrina, misma
que estará dentro de un frasco aspersor.
9. Seque nuevamente el cromatograma, sin pegar a la parrilla, hasta que se hagan
visibles las manchas de los aminoácidos.
10. Marque los bordes de cada una de las manchas para medir la distancia recorrida y
calcule los factores de corrimiento de los aminoácidos.

RESULTADOS
Anexe en el informe escrito el cromatograma ya revelado, con base en lo que obtuvo su
equipo durante el desarrollo de la práctica. Además, realice los cálculos para obtener el Rf
de cada aminoácido patrón, el cual se calcula de la siguiente manera:

Rf = Distancia recorrida por un compuesto

Distancia recorrida por el eluyente

Las medidas se toman desde el lugar donde se aplicó la muestra y debe tenerse presente que
el valor de Rf nunca podrá ser mayor a la unidad.

Calcule los Rx para los compuestos problema, con la siguiente fórmula:

Rx = Distancia recorrida por un compuesto problema

Distancia recorrida por un compuesto patrón

35
BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA PARA ESTA PRÁCTICA
1. Alexander, R. and Griffiths, J. 1993. Basic biochemistry methods. 2a. ed. Ed. Wiley-
Liss. E.U.A.
2. Bohinski, R.C. 1998. Bioquímica. 5a. ed. Addison-Wesley Iberoamericana. EUA.
3. Bowen R.W. and Baxter D.W. 1980. Experimental cell biology: an integrated
laboratory guide and text. 2a. ed. Ed. Macmillan. E.U.A.
4. D ‘ Ocon, M.C. y col. 1999. Fundamentos y técnicas del análisis bioquímico. 1ª. ed.
Ed. Acribia. España.
5. Gonzalez de Butrago, A. y col. 1979. Conceptos, técnicas y problemas de bioquímica
básica. 2ª ed. Ed. Alhambra. España.
6. Laguna, J. y Piña, E. 1992. Bioquímica. Salvat. México.
7. Lehninger, A.1998. Bioquímica, Ed. Omega, Barcelona.
8. Murray, R.K., Granner, D.K., Mayes, P.A. y Rodwell, V.W. 2000. Bioquímica de
Harper .15a. ed. Manual Moderno. México.

36
 PRÁCTICA 4. SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
LÁCTEAS POR ELECTROFORESIS EN GEL DE
POLIACRILAMIDA-SDS (SDS-PAGE)
INTRODUCCIÓN
Las proteínas usualmente poseen una carga neta positiva ó negativa, que refleja la
mezcla de aminoácidos que contienen. Si un campo eléctrico es aplicado a una solución que
contiene una proteína, ésta migrará en un rango que depende de su carga neta, de su tamaño
y de su forma. Esta técnica, conocida como electroforesis, fue usada originalmente para
separar mezclas de proteínas, tanto en solución acuosa como incluidas en una matriz porosa
como el almidón.
Las proteínas no están en un medio acuoso convencional, sino que incluye un detergente de
carga muy negativa, el dodecilsulfato de sodio (SDS, por sus siglas en inglés) lo que
provoca que las proteínas migren hacia el electrodo positivo cuando es aplicado un voltaje.

En la ténica de SDS-PAGE, se mezclan las proteínas con el detergente SDS para formar
complejos desnaturalizados. La técnica de SDS-PAGE posee un alto poder de resolución.
Lo anterior se deriva del uso de un sistema electroforético discontinuo, formado de dos
geles de distinta porosidad y pH, que primero compactan las muestras (en el gel superior o
compactador) y luego las separan (en el gel inferior o separador)
Los geles de poliacrilamida constituyen un excelente medio de soporte para separaciones
electroforéticas, dado que reúnen una serie de propiedades idóneas: transparencia,
elasticidad, porosidad controlable y compatibilidad con una gran variedad de compuestos
químicos. La poliacrilamida se forma por copolimerización de dos compuestos, la
acrilamida y la bis-acrilamida (N,N'-metilén-bis-acrilamida), en una reacción iniciada por
la tetrametiletiléndiamina (TEMED) y el persulfato de amonio. El radical persulfato
activa al TEMED, el cual a su vez activa al monómero de acrilamida para que polimerice.
Las cadenas de poliacrilamida son entrecruzadas al azar por la bisacrilamida, formándose
así una red de porosidad bastante uniforme, que puede ser regulada variando las
condiciones de la reacción y las concentraciones de los monómeros.
Si la muestra ha sido reducida con 2-mercaptoetanol los enlaces disulfuro intra- e inter-
catenarios son disociados, la estructura cuaternaria se pierde y las subunidades se separan
como cadenas peptídicas individuales

SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS LÁCTEAS

La muestra biológica que se estudiará en esta práctica mediante la técnica de
electroforesis SDS-PAGE será de leche, cuya proteína representativa es la caseína. La leche
presenta varios tipos de caseínas y dentro de estas existen isoformas genéticas. Dichas
proteínas son: -lactoalbumina, -lactoglobulina (presentes en el suero de la leche) y las
caseínas s1, s2,  y . Estas caseínas son los elementos proteicos de las micelas de la
leche. Se han podido separar por medio de electroforesis y además se han identificado
algunas de sus isoformas, como se muestra en la Figura 1.

37
Figura 1. SDS-PAGE de leches de cabra y fracciones separadas por RP-HPLC (muestras A, B, C y D). Las
muestras 1 y 2 son leches de cabras heterocigotas para las variables E/F y homocigotas para las variables A/A
para el locus s1-Cn.

OBJETIVO
 Comprender los principios de la separación de proteínas por medio de la técnica de
electroforesis.
 Conocer la importancia de los marcadores de peso molecular para la identificación de
las proteínas separadas.
 Identificar las proteínas separadas y determinar su peso molecular

MATERIALES
Material Reactivos y soluciones
Cámara de electroforesis (una por cada 2 equipos)
Acrilamida 30%/bisacrilamida 0.8%
2 Placas de vidrio (por equipo) Tris-Cl 4X/SDS pH 8.8
1 Fuente de poder (por c/dos equipos) Tris-Cl4X/SDS pH 6.8
Micropipeta de 2-20 µL (por c/dos equipos) TEMED 8.4%
Micropipeta de 20-200 µL (por c/dos equipos) Persulfato de amonio 10%
Micropipeta de 200-1000 µL (por c/dos equipos) Buffer de corrimiento pH 8.6
Puntas para micropipetas β-mercaptoetanol
3 Pipetas de 5 mL Buffer regulador
Propipeta Solución de Azul de Coomassie
Solución desteñidora
Solución de albúmina de suero bovino
Material que deberá traer cada equipo Muestra biológica
1 par de guantes de latex y cubre bocas (por Leche de cualquier especie animal,
integrante) preparada previamente con buffer regulador
Charola de plástico con tapa de 12x12 cm de muestra pH 8.6 y -mercaptoetanol.
Plumón de tinta indeleble

38
METODOLOGÍA
1. Se usarán guantes de latex y cubre bocas durante todo el experimento.
2. A cada equipo se le proporcionará un par de placas de vidrio que limpiaran con SDS al
0.2% y toallas absorbentes.

Preparación del gel

a) Los cristales para electroforesis limpios con SDS 0.2%, se colocarán en los soportes
de armado y estos a su vez en la base respectiva. Para descartar alguna fuga de
líquido se llenará el espacio entre ambos cristales con agua destilada. Después, sin
desarmar el dispositivo, se desechará el agua y se secarán los cristales introduciendo
entre las placas papel filtro.
b) Se prepararán 2 geles: uno llamado separador, que como su nombre lo indica sirve
para separar las proteínas de la muestra y otro llamado concentrador, que va
encima del anterior y sirve para concentrar las proteínas de la muestra, de tal modo
que su recorrido por el gel separador sea uniforme. La preparación de estos geles es
la siguiente:
NOTA: Los volúmenes se proporcionarán en la práctica cuando se revise la metodología. Volúmenes
mayores a un mililitro se medirán con pipetas graduadas y menores a un mililitro con micropipetas.

Gel separador 15%

Reactivos o soluciones Volumen
Agua destilada
Acrilamida 30% / Bis-acrilamida 0.8%
Tris-Cl 4X/SDS pH 8.8
Persulfato de amonio (APS) 10%
TEMED 8.4%*

Gel concentrador
Reactivos o soluciones Volumen
Agua destilada
Acrilamida 30% / Bis-acrilamida 0.8%
Tris-Cl 4X/SDS pH 6.8
Persulfato de amonio (APS) 10%
TEMED 8.4%*

* Una vez que se agregue este reactivo, la polimerización iniciará

c) Primero preparare el gel separador, vacíe esta mezcla se entre los cristales con una
micropipeta, dejando espacio para el gel concentrador, de aproximadamente 1.5 cm.
Debe tener cuidado de no dejar burbujas dentro de la mezcla, para evitar
distorsiones durante el corrimiento electroforético de la muestra.
d) Agregue cuidadosamente 200 µL de agua, sin mezclar con el gel separador, para
que cuando éste gelifique, se diferencie el gel del agua.
e) Una vez gelificado, retire el agua y seque la superficie del gel cuidadosamente con
papel filtro.
f) Agregue posteriormente el gel concentrador y antes de que gelifique, introduzca el
peine para formar los pozos donde serán agregadas las muestras.
g) Una vez gelificado, retire el peine.

39
 h) Sin separar las placas de vidrio, el gel coloque en la cámara de electroforesis y se
procederá a llenar esta cámara con el amortiguador de corrimiento.

Preparación del corrimiento

1. Se colocan en el segundo pozo 20 l de marcador de peso molecular que consistirá en
una solución de albúmina de suero bovino y 20 l de muestra en el resto de los pozos
Figura 2.
.
Muestra
Cátodo Cámara

Amortiguador
Gel Ánodo

Amortiguador

Figura 2. Llenado de los pozos con marcadores de peso molecular y muestra

2. La cámara de electroforesis, ya con el gel cargado con las muestras correspondientes

será cerrada y conectada a la fuente de poder. Esta será encendida y programada para
efectuar la electroforesis, por 2 h aproximadamente a 120 v.
3. El término del proceso de corrimiento de la electroforesis, será cuando el colorante azul
de bromofenol que contiene el buffer regulador de muestra, llegue al final del gel.
4. La fuente de poder se apagará y entonces se desconectará la cámara de electroforesis.
5. Desmontar las placas de vidrio y con una espátula hacer palanca entre las dos placas y
separar el gel cuidadosamente.
6. El buffer de corrimiento puede conservarse para otro corrimiento.

Tinción
1. El gel se colocará en un recipiente con solución acuosa de azul de Coomassie para su
tinción.
2. Colocar el recipiente en un agitador orbital con movimiento moderado, las bandas de
proteínas teñidas pueden verse en menos de una hora si el colorante esta recién
preparado o al día siguiente si ya ha sido usado.
3. Posteriormente se destiñe con solución desteñidora, se vuelve a poner con esta solución
en el agitador.
4. Finalmente se observan las bandas de proteínas al día siguiente.

40
RESULTADOS
1. Calcule los valores de peso molecular de las proteínas obtenidas, con ayuda del
marcador de peso molecular (Albúmina de suero bovino).
2. ¿Cuántas proteínas contiene la muestra que recibió?
3. ¿Cuál es la más abundante y como determina esto a simple vista?

NOTA:
La acrilamida es NEUROTÓXICA. Al pesar el reactivo sólido debe usarse guantes y
mascarilla. Limpie cualquier residuo de acrilamida en la balanza y sus alrededores, pues la
inhalación es tan nociva como el contacto con la piel.
Al preparar geles es necesario usar guantes e igualmente, limpiar cualquier derrame. Los
sobrantes de solución de monómeros no deben ser vertidos en el desagüe, es mejor
polimerizarlos y descartarlos en forma de gel ya que EL POLÍMERO PIERDE LA TOXICIDAD.

BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA PARA ESTA PRÁCTICA

1. Alberts, B. 1994. Molecular biology of the cell. 3a. ed. Garland. E.U.A.
2. Bowen R.,W. and Baxter D.,W. 1980. Experimental cell biology: an integrated
laboratory guide and text. 2a. Ed. Macmillan. E.U.A.
3. Jaubert, A. and Martin, P. 1992. Reverse-phase HPLC analysis of goats caseins.
Indication of s1 and s2 genetic variants. Lait 72 : 235-247.
4. Lehninger A., A. 1993. Principles of biochemistry. 2a. Ed. Worth. E.U.A.
5. Martin, P. 1993. Polymorphisme génetique des lactoprotéines caprines. Lait 73: 511-
532.
6. Remeuf, F. 1993. Influence du polymorphisme génetique de la caseina s1 caprine sur
les caractérisiques physico-chimiques et technologiques du lait. Lait 73 : 549-557.

41
 MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

PRÁCTICA 5. CINÉTICA DE LA ENZIMA UREASA

INTRODUCCIÓN
Una enzima es una proteína que funciona como catalizador biológico, es decir,
acelera una determinada reacción bioquímica en la que uno o varios sustratos son
transformados en uno o varios productos. Es importante señalar que sin intervención de la
enzima esta reacción tomaría mucho más tiempo en llevarse a cabo, con un mayor gasto de
energía.
Para obtener el producto de una reacción bioquímica siempre se pasa por una
transición de un estado energético inicial (de los sustratos) a un estado energético final
(de los productos). Durante el proceso de transición se alcanza además un estado
energético intermedio (de transición). A la diferencia de energía del estado de transición y
de los sustratos iniciales se le llama energía de activación. Generalmente, la energía de
activación es mayor que la energía inicial del sustrato. Las enzimas pueden disminuir esta
barrera energética, con lo que la reacción respectiva ocurrirá a mayor velocidad.
La presencia de enzimas en los procesos bioquímicos permite a la célula una
optimización fisiológica de recursos moleculares y energéticos. Es importante comprender
esto ya que la gran cantidad de enfermedades que ocurren en los animales domésticos y el
ser humano se deben a la falla de una o varias enzimas, ya sea por su deficiente producción
o por defectos en su constitución molecular.

ENZIMA UREASA
La ureasa fue de las primeras enzimas en ser caracterizadas por Sumner en 1926.
Esta enzima tiene especificidad absoluta por un solo sustrato, la urea. La ureasa cataliza la
reacción que hidroliza este compuesto nitrogenado en dos moléculas del ión hidróxido de
amonio y una de bióxido de carbono, dicha reacción se muestra en la Figura 1. Para llevar
a cabo su actividad requiere del ión Ni2+.

2 NH+3
Figura 1. Reacción de la hidrólisis de la urea por la enzima ureasa

Es importante señalar que la urea es producida naturalmente en el hígado en el

llamado ciclo de la urea y en el caso de los animales ureotélicos es un compuesto clave para
la eliminación del exceso de N metabólico. En los rumiantes puede ser reciclada y ya sea
por vía sanguínea o salival, retornada al rumen, donde la ureasa producida por algunas
bacterias ruminales permite obtener el ión amonio que es reabsorbido como amoníaco y
utilizado para la formación de aminoácidos. Conocida esta propiedad fisiológica de los
rumiantes, con fines zootécnicos de alimentación se ha extendido la práctica de suministrar
urea como fuente de nitrógeno no proteico, especialmente en explotaciones intensivas.
La ureasa tiene un peso molecular de 483 Kd y un punto isoeléctrico de 5.0. Consta
de seis subunidades idénticas. Además de ser producida por las bacterias del rumen,
también es producida por diversos invertebrados marinos, así como ciertas plantas
leguminosas como el frijol de soya y el haba.

CINÉTICA ENZIMÁTICA
La cinética enzimática comprende el estudio de la velocidad de reacción de una
enzima determinada y de las condiciones que la modifican. Las variables importantes en los
estudios cinéticos son las concentraciones de sustrato (S) y producto (P), temperatura,
presión, el efecto de ciertos disolventes, cambios de pH, fuerza iónica del medio, tiempo, la
presencia de inhibidores, así como la estereoquímica y la estequiometría de las moléculas
involucradas, entre otros factores.
En forma práctica, la velocidad de reacción de una enzima puede determinarse
utilizando cualquiera de los siguientes procesos:
a) Medir la disminución en la concentración de sustrato en una unidad de tiempo
determinada.
b) Medir el aumento en la concentración de producto final en una unidad de tiempo
determinada.
c) Medir el cambio en la concentración de una coenzima en una unidad de tiempo
determinada, como medición indirecta de la actividad de la enzima.
Los primeros conocimientos sobre el comportamiento enzimático se deben a V.
Henri (1903) y más adelante a L. Michaelis y Maud L. Menten (1913). Henri y el equipo de
Michaelis y Menten propusieron en esencia al mismo modelo, pero los segundos basaron el
suyo en datos obtenidos mediante experimentos de laboratorio cuidadosamente diseñados y
controlados.
El trabajo experimental de Michaelis y Menten se realizó con un extracto de
levaduras ricas en invertasa, enzima que cataliza la hidrólisis del carbohidrato sacarosa. Se
recopilaron datos sobre los cambios en la velocidad inicial v0 de dos experimentos
independientes que consistían en:
1) Cuando la concentración de sustrato [S] se mantuvo constante mientras se hacía
variar la cantidad de enzima [E], se observó un incremento lineal en la velocidad al
aumentar la concentración de enzima presente.
2) En experimentos de tipo inverso, cuando la concentración de la enzima [E] se
mantuvo constante y se hizo variar la cantidad de sustrato [S], lo que se observó fue
una reacción hiperbólica entre la velocidad y la concentración de sustrato [S].
Se propuso que la enzima podía cambiarse de modo reversible con el sustrato para
formar un complejo intermediario integrado por la enzima y el sustrato, ES, el cual se
descompone luego para formar los productos P y la enzima libre en su forma original.
E + S  ES  P + E

Lo que esto implica es que la transformación de S en P ocurre en el nivel del

complejo intermediario ES.

43
OBJETIVO
 Determinar los diversos factores que influyen en la actividad de las enzimas y la
manera en la que pueden ser observados y medidos en el laboratorio, tomando como
ejemplo a la ureasa producida por el frijol de soya.
 Determinará la influencia del inhibidor Bicloruro de Mercurio (HgCl 2), en la
reacción catalizada por la ureasa.
MATERIALES
Material y equipo Reactivos y soluciones
5 Tubos de ensaye grandes Urea 0.25 M.
3 Pipetas (1, 5 y 10 mL) Amortiguador de fosfatos 0.05 M, pH 7.2.
2 Matraces Erlenmeyer de 250 mL Amortiguador de fosfatos de pH diferentes
1 Bureta de 25 o 50 mL Bicloruro de mercurio al 1%.
1 Soporte universal Ácido clorhídrico 0.1 N.
1 Pinzas de bureta Rojo de metilo al 0.04%.
1 Propipeta MUESTRA BIOLÓGICA
Gradilla para tubos de ensaye Extracto de ureasa proveniente de frijol de soya
Vórtex
1 Piseta Termómetro
Baño María
Material que deberá traer cada equipo
Guantes de latex Toallas de papel
Plumón indeleble Detergente

METODOLOGÍA
Determinación del efecto de la variación en la concentración de sustrato (urea)
sobre la velocidad de reacción de la ureasa.
Prepare la siguiente serie de tubos:
Tubo 1 2 3 4 5
Urea 0.25 M 0.5 1 2 5 7.5
Amort. fosfatos pH 7.2 1 1 1 1 1
Agua destilada 8 7.5 6.5 3.5 1
Incubar en baño María durante 5 min. a 50ºC
Ureasa 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Incubar en baño M aría durante 30 min a 50ºC
HgCl2 al 1% (gotas) 4 4 4 4 4
Cada volumen agregado a los tubos será en mL, excepto donde indica gotas.

1. Para la titulación mida 5 mL del tubo 1 y viértalos un matraz Erlenmeyer de 125

mL.
2. Agregue 2 gotas del indicador rojo de metilo y observe la coloración obtenida. Si
hubo actividad enzimática se habrá formado el producto final, o sea, hidróxido de
amonio (NH4OH), que es una base y la solución se verá amarilla. Si no hubo
actividad enzimática, entonces la solución tendrá un color rosa y no será titulada.
Esto último se debe a que el inhibidor no permitió que la enzima hidrolizará al
sustrato y por lo tanto no se forma hidróxido de amonio. El color rosa indicará

44
 además que se trata de una solución ácida y no es correcto titular un ácido con otro
ácido.
3. Cuando la solución sea amarilla, proceda a titular, agregando lentamente al matraz
ácido clorhídrico 0.1N por medio de la bureta, hasta que el color del indicador vire a
canela. Anote los mL de HCl utilizados en la titulación.
4. Titule 5 mL de cada uno de los tubos restantes de este experimento en su respectivo
matraz, tal como se realizó con el tubo inicial.
5. El contenido de las soluciones tituladas se verterá en un contenedor etiquetado
como RESIDUO
6. El HCL 0.1 N de la bureta se reciclará en el mismo matraz de donde lo obtuvo.

Determinación del efecto de la variación en la concentración de enzima (ureasa) sobre

la velocidad de reacción de la misma.
Prepare la siguiente serie de tubos:
Tubo 1 2 3 4 5
Urea 0.25 M 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5
Amort. fosfatos pH 7.2 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5
Incubar en baño María durante 5 min. a 50ºC
Ureasa 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9
Incubar en baño María durante 30 min. a 50ºC
HgCl2 al 1% (gotas) 4 4 4 4 4
Cada volumen agregado a los tubos será en mL, excepto donde indica gotas.
Realice la titulación de cada tubo, como se indica del punto 2 al 6 de esta metodología.

Determinación del efecto de la variación de la temperatura sobre la velocidad de

reacción de la ureasa.
Prepare la siguiente serie de tubos:
Tubo 1 2 3 4
Urea 0.25 M 7.5 7.5 7.5 7.5
Amort. fosfatos pH 7.2 2.0 2.0 2.0 2.0
Incubar por 5 min a: 0 20 50 80ºC
Ureasa 0.5 0.5 0.5 0.5
Incubar por 30 min a: 0 20 50 80ºC
HgCl2 al 1% (gotas) 4 4 4 4
Cada volumen agregado a los tubos será en mL, excepto donde indica gotas.
Realice la titulación de cada tubo como se indica del punto 2 al 6 de esta metodología.

45
 Determinación del efecto de la variación del pH del medio sobre la velocidad de
reacción de la ureasa.
Prepare la siguiente serie de tubos:
Tubo 1 2 3 4 5
Urea 0.25 M 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
4,5 mL de fosfatos con pH 4.5 6 7,2 8.5 10
Incubar en baño María durante 5 min. a 50ºC
Ureasa 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 ml
Incubar en baño María durante 30 min. a 50ºC
HgCl2 al 1% (gotas) 4 4 4 4 4
Cada volumen agregado a los tubos será en mL, excepto donde indica gotas.
Realice la titulación de cada tubo, como se indica del punto 2 al 6 de esta metodología.

RESULTADOS
Calcule lo que se pide en los siguientes cuadros.

Determinación del efecto de la variación en la concentración de sustrato (urea) sobre

la velocidad de reacción de la ureasa
Tubo mL de urea M de urea inicial en cada mL gastados M de urea
tubo (x) hidrolizada (y)
1
2
3
4
5

Para calcular los M de urea inicial, se debe considerar que ésta se preparó a 0.25 M, es
decir, hay 250 M por cada mL y cada tubo tendrá un volumen final de 10 mL. Esto se

deberá calcular así: M de urea inicial

Para calcular la concentración de urea hidrolizada (en μM), se debe de multiplicar el

valor VTC por 50. Esto se debe a que cada molécula de urea da origen a dos de NH 4OH,
cada una de las cuales reacciona con una molécula de HCl. Como la solución de HCl es 0.1
N, esto significa que hay 100 μM/mL, por lo que cada mL de dicha solución equivale a 50
μM/mL (100/2) de moléculas de urea hidrolizada. Este cálculo se hará en cada una de las
variaciones manejadas en este experimento.
Grafique los μM de urea hidrolizada en el eje de las ordenadas (y) y los μM de
sustrato inicial en el eje de las abscisas (x). Con los datos obtenidos trabaje el método de
Michaelis-Menten para determinar la afinidad de la enzima por su sustrato.
}

46
 Determinación del efecto de la variación en la concentración de enzima (ureasa) sobre
la velocidad de reacción de la misma.
Tubo mL de enzima inicial mL gastados M de urea
en cada tubo (x) hidrolizada (y)
1
2
3
4
5
Se procederá a graficar* las μM de urea hidrolizada en el eje de las ordenadas (y) y los mL
de enzima inicial en el eje de las abscisas (x).

Determinación del efecto de la variación de la temperatura sobre la velocidad de

reacción de la ureasa
Tubo Temperatura (x) mL gastados M de urea
hidrolizada (y)
1
2
3
4
Se procederá a graficar* las μM de urea hidrolizada en el eje de las ordenadas (y) y la
temperatura en el eje de las abscisas (x).

Determinación del efecto de la variación del pH del medio sobre la velocidad de reacción de la
ureasa
Tubo pH del medio (x) mL gastados M de urea
hidrolizada (y)
1
2
3
4
5
Se procederá a graficar* las μM de urea hidrolizada en el eje de las ordenadas (y) y el pH
del medio en el eje de las abscisas (x).
*Reportar sus cálculos y gráficas elaboradas en una hoja de cálculo (Excel).
Analizar acerca de los resultados obtenidos en cada uno de los ensayos efectuados
para determinar el efecto de la concentración de sustrato, la concentración de enzima, la
temperatura y el pH en la actividad de la ureasa.

BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA PARA ESTA PRÁCTICA

1.Bohinski, R.C. 199. Bioquímica. 5a. ed. Addison-Wesley Iberoamericana. EUA.
2.Laguna, J. Y Piña, E. 1992. Bioquímica. Salvat. México.
3.Lehninger, A.1998. Bioquímica, Ed. Omega, Barcelona.
4.Murray, R.K., Granner, D.K., Mayes, P.A. y Rodwell, V.W. 2000. 15a. ed. Manual
Moderno. México.
5.Vega, C.L.P. 1993. Manual de laboratorio de Bioquímica para MVZ. FES Cuautitlán,
UNAM. México

47
 MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN DE BIOMOLÉCULAS

PRÁCTICA 6. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO

DE BRADFORD
INTRODUCCIÓN
Las proteínas son moléculas con estructuras complejas y por esto se pueden
clasificar de acuerdo a su forma, composición, función y niveles de organización
estructural. Tienen muchas y diversas funciones en la naturaleza, ejemplos de estas son: las
enzimáticas que aceleran y dirigen reacciones bioquímicas, estructurales que
proporcionan protección y sostén, de movimiento que participan en el desplazamiento de
organelos o vesículas dentro de las células, de defensa al organismo contra agentes ajenos a
éste, de transporte de moléculas o iones a través de las membranas o entre células y
almacenamiento las cuales actúan como reserva de nutrientes esenciales.

NIVELES DE ORGANIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS

La cadena polipeptídica tiene una secuencia de aminoácidos específica dado por la
secuencia del gen. Los bioquímicos han diferenciado varios niveles de organización o
estructura y que se diferencian por la sencillez o complejidad de su arreglo tridimensional,
así como en el tipo de uniones intramoleculares. La más sencilla es la estructura primaria
siendo los enlaces peptídicos quienes mantienen su estabilidad. La estructura secundaria
presenta a su vez dos tipos de organización: hélice- y lámina . En la primera, los puentes
de hidrógeno se forman dentro de una única cadena polipeptídica y son casi paralelos al eje
de la hélice. En la segunda los puentes de hidrógeno se forman entre cadenas adyacentes y
pueden presentarse en sentido paralelo o antiparalelo. Las estructuras secundarias y
supersecundarias casi siempre están organizadas en dominios. Las estructuras terciarias
describen las relaciones entre estos dominios, las formas en las cuales las proteínas
plegadas pueden reunir aminoácidos separados en un sentido estructural primario y los
enlaces que estabilizan estas conformaciones. Por último, las estructuras proteicas que
presentan dos o más cadenas polipeptídicas unidas por fuerzas no covalentes se conocen
como cuaternarias, en ellas, la cadena individual se denomina protómero, mientras que en
su conjunto se nombran oligómeros. En la Figura 1. se representa el esquema de cada una
de las estructuras antes mencionadas.

48
 Estructura secundaria α-hélice

Estructura primaria
Estructura terciaria

Estructura cuaternaria
Figura 1. Niveles de organización o estructuras tridimensionales de las proteínas.

MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

Sin duda alguna, una de las determinaciones más usadas en el área de las Ciencias
Biológicas, es la cuantificación de proteínas. Existen muchos métodos para realizarlas; sin
embargo se deben considerar los siguientes criterios para elegir el más adecuado:
1) la cantidad total de proteína presente en la muestra,
2) la concentración de la proteína,
3) la especificidad del método,
4) la presencia de otras sustancias que pudieran interferir y
5) la facilidad y reproducibilidad del método.
La concentración de proteínas se puede determinar midiendo la absorbancia a
280nm se basa en la capacidad de absorbancia sobre la luz ultravioleta de los aminoácidos
aromáticos en proteínas en solución, debido principalmente a los residuos triptófano y
tirosina y en menor medida a los residuos fenilalanina. Este método puede usarse para
cuantificar soluciones con concentraciones de 20-300 mg/mL.
También se puede medir a través de la emisión de fluorescencia por los aminoácidos
aromáticos triptófano, tirosina y/o fenilalanina. Usualmente la fluorescencia del triptófano
es la medida. La intensidad de la fluorescencia de la muestra es medida y su concentración
de proteínas es calculada a partir de una curva de calibración basada en la emisión de
fluorescencia de soluciones estándar preparadas con proteínas purificadas. Este ensayo
puede ser usado para cuantificar soluciones con concentraciones de 5-50 mg/mL.
Existen otros métodos para la cuantificación de proteínas basados en la unión de un
colorante. Ejemplos de ellos son:
 Bradford: Se emplea azul brillante de Coomassie. Está diseñado para cuantificar de
1-10 mg de proteína. Las determinaciones de proteína en el rango de 10-100 mg
pueden ser realizadas incrementando el volumen de la solución del colorante 5
veces y usando tubos más grandes o placas de cultivo (microBradford).
 Lowry: Cuantifica el color obtenido de la reacción entre el reactivo de Folin-fenol
Ciocalteu con los residuos tirosil de una proteína desconocida Este ensayo está
diseñado para cuantificar de 1-20 mg de proteína. Las determinaciones de proteína
en el rango de 5-100 mg puede realizarse incrementando todos los volúmenes 5
veces. Este método no es apropiado para proteínas que no contengan residuos de
tirosina, dado que el ensayo se basa en la reacción de estos residuos con el reactivo
de Lowry. Además, aunque es un método sensible, la cantidad de color producido
varía con diferentes proteínas y en ocasiones el color no es estrictamente
proporcional a la concentración.
 Biuret: Se base en el uso una solución de sulfato de cobre a un pH altamente
alcalino, permitiendo que los iones de Cu+ en presencia de proteínas formen
complejos químicos conocidos como quelatos y obteniendo finalmente una
coloración azul-púrpura.
Los métodos colorimétricos más frecuentemente usados para cuantificar proteínas
son; Bradford y Lowry. El método de Bradford, es más rápido que el de Lowry.

CURVA DE CALIBRACIÓN
En la cuantificación de proteínas, independientemente el método de elección, debe
compararse la absorbancia obtenida de la muestra de proteína contra la de una proteína
conocida con concentración conocida (estándar). Para ello, se realizan una serie de
diluciones de la proteína estándar, se determina la absorbancia de cada una y finalmente
se realiza una curva estándar o curva de calibración (absorbancia vs concentración). Una
vez realizada esta curva, se podrá comparar la absorbancia de la muestra y determinar su
concentración. La proteína estándar preferentemente empleada es la albúmina de suero
bovino (BSA por sus siglas en inglés).

OBJETIVOS
 Determinar la concentración de proteínas de una muestra a través del método de
Bradford.
 Realizar una curva de calibración para cada método.
 Aprender el uso del espectrofotómetro para medir la absorbancia.

50
 MÉTODO DE BRADFORD
MATERIALES
Material y equipo Reactivos y soluciones
10 Tubos Eppendorf Albúmina de suero bovino (BSA): 1g/L
Micropipeta 2-20 L (por c/dos equipos)
Micropipeta 20-200 L (por c/dos equipos) Reactivo de Bradford
Micropipeta 200-1000 L (por c/dos equipos) Agua destilada
Puntas para micropipetas Muestra biológica
Espectrofotómetro Suero sanguíneo, leche o calostro
Celdas de lectura

METODOLOGÍA

1 A partir de los tubos de BSA de 1000 µL de agua destilada, preparar la siguiente serie de tubos (1 al 6)
completando con agua destilada hasta un volumen de 1000 µL
BSA
Tubo Agua destilada (µL)
(µg/µL)

1 0 1000 Blanco

2 125 875

3 250 750 Curva de calibración

4 500 500

5 750 250

6 1000 0

7 1000 µL de leche Problema

2. Al tubo 1 se le adicionará 300 µL del reactivo de Bradford, se vaciará a la celda del espectrofotómetro y se
procederá a calibrar a cero (Tubo blanco). Se realizará la lectura a 595 nm. Dejar en la celda por si es
necesario volver a calibrar
3. Cuando el espectrofotómetro esté calibrado, se adicionarán 300 µL del reactivo de Bradford a cada tubo (2
al 7) e inmediatamente se procede a realizar la lectura (volumen total de cada tubo 1300 µL)
4 .La lectura se hará del tubo 2 al tubo 6 para realizar la curva de calibración, vaciar de uno en uno el tubo en
la celda y leer. En éste orden no es necesario enjuagar la celda (Solo se cuenta con una celda para lectura )
Tener cuidado del orden de los tubos.
5. Se realizará la lectura de la muestra problema en una celda limpia.
6. Anotar toda las lecturas teniendo cuidado del orden de lectura,
RESULTADOS
1. Realizar la curva estándar con las lecturas obtenidas de los tubos 1 al 6 en papel
milimétrico graficando los g/L de BSA en el eje de las abscisas (X) y la absorbancia 51
de cada una de estas concentraciones en el eje de las ordenadas (Y). Indicar en esta
gráfica la absorbancia del problema e interpolar el eje de las abscisas para determinar la
concentración de proteína de la muestra Figura 2.

Absorbancia
(Y)

ABS µg/µL (X)

Concentración de
proteína problema

Figura 2. Curva estándar

2. Realizar otra curva estándar en una hoja de cálculo (Excel) y calcular la concentración
de la proteína muestra por regresión lineal con la fórmula:
y= mx+b
Despejando x:
y b
x
m
en donde:
x= concentración de proteína de la muestra
y= absorbancia del problema
b= ordenada al origen
m= pendiente
3. El valor obtenido corresponderá al total de g de proteína en el volumen de muestra
usado. Si la muestra se diluyo, el valor obtenido deberá multiplicarse por la dilución
para obtener la concentración de proteína en la muestra en el orden de g/L.
4. Efectuar una discusión en equipo en torno al logro del objetivo, desarrollo
metodológico y resultados obtenidos.

.
BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA PARA ESTA PRÁCTICA
1. Bradford, MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of micrograms
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochem.
72:248-252.
2. Bohinski, R.C. 1991. Bioquímica. 5ª ed. Addison Wesley Iberoamericana. EUA.
3. García, AH. y Vázquez DR. 1998. Cuantificación de proteínas: una revisión. Bitácora.
BioTecnología. 3: 77-88
4. Laguna, J. y Piña E. 2002. Bioquímica. 5ª ed. Manual Moderno. México.
5. Murray, RK., Mayes, PA., Granner, DK. y Rodwell, VW. 2000. Bioquímica de Harper.
15ª ed. Manual Moderno. México.
6. Mathews, CK., Van Holde, KE. y Ahern, KG. 2002. Bioquímica. 3ª ed. Addison 7.
Wesley. España
8. McKee, T. Y McKee, JR. 2003. Bioquímica. La base molecular de la vida. 3ª ed.
McGraw-Hill. España. pp. 125-138

53
 PRÁCTICA 7. CUANTIFICACIÓN DE LOS NIVELES DE GLUCOSA

INTRODUCCIÓN
Los carbohidratos tienen como fórmula general (CH2O)n Se clasifican en
monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos y polisacáridos, dependiendo del número de
azúcares simples que los forman. Los monosacáridos o azucares simples, están constituidos
por un único polihidroxialdehido o bien por una sola polihidroxicetona. Los oligosacáridos
contienen de 2 a 10 unidades monosacáridas unidas por enlaces glucosídicos. Los
polisacáridos están constituidos por cadenas muy largas de unidades monosacáridas que
pueden ser lineales o ramificadas.
En la biósfera hay mas hidratos de carbono que toda la demás materia orgánica, ya
que el almidón y el glucógeno (2 polímeros de la glucosa) son un material de reserva
energética en la mayoría de las células.
GLUCOSA
La glucosa es el azúcar más importante ya que de ella obtenemos nuestra principal
fuente de energía. Sin embargo, existen alteraciones que pueden provocar que esta circule
por la sangre en niveles altos o bajos. Estas alteraciones pueden tener causa fisiológica,
(generalmente mediada por hormonas), aunque también pueden ser de tipo anormal
(patológico).
En el caso de que los niveles de glucosa sean altos, se le denomina hiperglucemia. Esta
puede ser producida por insuficiencia de la hormona insulina, lo cual impide que la gran
mayoría de las células del cuerpo puedan introducir la glucosa a su citoplasma y esta
permanece circulante en la sangre. Esta condición es conocida como diabetes y afecta al
hombre y a algunos animales domésticos como el perro y el gato. Cuando los niveles de
glucosa son bajos, se conoce como hipoglucemia. Esto también puede ser producido por
efecto de las hormonas. Esta condición también tiene causa hormonal (fisiológica o
patológica). En la producción porcina, la hipoglucemia de los lechones es un evento común
no deseable porque puede ser mortal y genera pérdidas económicas.
Debido a lo anterior, es importante en ocasiones llevar a cabo una medición de los
niveles de glucosa sanguínea, preferentemente en ayunas, para realizar un diagnostico
clínico de apoyo en aquellas enfermedades relacionadas con el metabolismo de
carbohidratos. Un método rápido, relativamente sencillo, basado en la lectura de
absorbancia es el método de Dubowsky.
OBJETIVOS
 Conocer la importancia de la cuantificación de glucosa en sangre en el diagnóstico clínico.
 Explicar las posibles alteraciones en el metabolismo de glucosa con respecto a la
cuantificación de los niveles de glucosa en sangre
 Realizara por equipo la revisión de artículos arbitrados relacionados con el tema en
medicina veterinaria
BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA PARA ESTA PRÁCTICA
1. Anderson, N.V., 1966. “Laboratory Diagnosis Of The Canine Pancreatic Diseases” Southwest.,
Vet 19 p 119
2. Devaux, Guy , et al ,1999. Técnicas de Bioquímica Clínica, Editorial Jims. Barcelona.
3. Kaneko, JJ 1989, Clinical Biochenistry of Domestic Animals. 4a ed. Academic Press, New
York.

54
 PRÁCTICA 8. CUANTIFICACIÓN DE COLESTEROL EN SUERO
SANGUÍNEO POR EL MÉTODO DE LIEBERMANN-BURCHARD

INTRODUCCIÓN
Los esteroles son derivados lipídicos, que se encuentran presentes en la mayoría de
las células eucariotas. Su estructura característica es un núcleo esteroide que consiste en
cuatro anillos fusionados, tres de ellos con seis carbonos y uno con cinco; a este grupo de
anillos también se le llama grupo ciclopentano-perhidrofenantreno. El núcleo esteroide es
casi plano y relativamente rígido, los anillos fusionados no permiten la rotación alrededor
de los enlaces C-C.

COLESTEROL
Es el principal esterol en tejidos animales, el cual es un compuesto anfipático, con un
grupo de cabeza polar (el grupo hidroxilo en C-3) y un cuerpo hidrocarbonado apolar (el
núcleo esteroide y la cadena lateral hidrocarbonada en C-17) que es casi tan largo como un
ácido graso de 16 carbonos en su forma extendida Figura 1. Los esteroles de todas las
especies se sintetizan a partir de subunidades isopropeno de cinco carbonos (lo mismo que
las vitaminas liposolubles, las quinonas y los dolicoles).
En algunos seres vivos se encuentran esteroles similares al colesterol, por ejemplo
el estigmasterol (en plantas) y el ergosterol (en hongos). Por otra parte, cabe señalar que,
con pocas excepciones, las bacterias carecen de esteroles.

Fig. 1 Estructura química del colesterol

El colesterol se encuentra ampliamente distribuido en todas las células del

organismo animal, pero especialmente en el tejido nervioso. La mayor parte de dicho
compuesto (aproximadamente 1 g/día) se origina por vía sintética, mientras que solo
aproximadamente 0.3 g/día se suministra en la dieta. Al ser este un producto del
metabolismo animal, está presente, por lo tanto, en cantidades importantes en los alimentos
de origen animal como la carne, hígado, cerebro y yema de huevo.
La eliminación del colesterol se da por dos rutas principales, a) la conversión de
ácidos biliares y b) la excreción como esteroles neutros en las heces. Por otra parte, cabe
señalar que la síntesis de las hormonas esteroides a partir del colesterol y la eliminación de
sus productos de degradación en la orina son mecanismos adicionales de eliminación, si
bien, son de menor significación cuantitativa. La persistencia de concentraciones anormales
puede ocasionar la formación de placas en vena aorta y arterias menores, condición
patológica denominada aterosclerosis y que puede ser causa de insuficiencia cardiaca.

IMPORTANCIA DE LA CUANTIFICACIÓN DE COLESTEROL

La importancia de determinar cuantitativamente el colesterol radica en conocer los
niveles de dicho compuesto en el suero, ya que constituye un indicador del estado
metabólico y fisiológico del organismo animal. Es así como podemos llegar a darnos cuenta
de un posible riesgo en la acumulación de lípidos y estrechamiento gradual de las arterias
en los animales.
En la presente práctica, se realizará la determinación de este compuesto a través de un
reactivo que es capaz de reaccionar selectivamente con el colesterol, para ello, se deberá
haber precipitado previamente las proteínas del suero. Para lograr esta precipitación se
utilizará una solución alcohólica de hidróxido de potasio (KOH) y éter de petróleo. La
reacción del colesterol con el reactivo de Liebermann-Burchard modificado, dará como
resultado una variación en la intensidad de la coloración en diferentes diluciones patrón de
colesterol. La concentración de colesterol de la muestra de suero será determinada a través
de la curva de calibración.
OBJETIVOS
 Comprender el significado metabólico y fisiológico de la variación de las
concentraciones de colesterol en la sangre del organismo animal.
 Familiarizarse con una técnica utilizada en la determinación cuantitativa del
colesterol en el suero sanguíneo, como herramienta para el diagnóstico de
alteraciones en la concentración del mismo en los animales.
MATERIALES
Material y equipo Reactivos y soluciones
2 Tubos de ensaye grandes Estándar de colesterol (0.4 mg/ml)
6 Tubos medianos Solución alcohólica de KOH
6 Tubos para espectrofotómetro Éter de petróleo
1 Gradilla para tubos de ensaye Anhidro acético
2 Pipeta de 1 mL Ácido sulfúrico
2 Pipetas de 5 mL Ácido acético glacial
2 Pipetas de 10 ml
1 Propipeta
Espectrofotómetro Muestra biológica
2 Parrillas eléctricas (por grupo) Suero sanguíneo
4 Vasos de precipitados 250 mL (por grupo)
1 Termómetro (por grupo)
1 Vórtex
Material que deberá traer el grupo
1 rollo de papel aluminio
Material que deberá traer cada equipo
Toallas absorbentes Masking tape
Plumón indeleble Pinzas de disección sin dientes de ratón
Detergente líquido
Material que deberá traer de manera individual
Gafas protectoras, guantes y cubre bocas

54
56
 RECOMENDACIONES PARA LA REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA

 Durante todo el desarrollo de la práctica, deberá usar cubre bocas, guantes, y gafas
protectoras, además de seguir las indicaciones que mencionen los profesores.
 El material de vidrio que entra en contacto con el reactivo de Liebermann-Burchard
debe trabajarse perfectamente SECO.
 El material deberá regresarse LIMPIO Y PERFECTAMENTE SECO al término
de la práctica.

METODOLOGÍA
Los profesores le proporcionarán a cada equipo dos tubos grandes, los cuales fueron
preparados de la siguiente manera:
Tubos
Estándar Problema
Estándar de colesterol 5.0 ---
Suero sanguíneo --- 2.0 ml de suero
Solución alcohólica de KOH 5.0 5.0
Agitación e incubación a 40º C por 55 minutos
Enfriamiento a temperatura ambiente
Éter de petróleo 10 10
Agua destilada 1 1
Agitación vigorosa por 1 minuto
Las unidades de medición son en ml.

1. Mida con la pipeta ___ ml del éter de petróleo del tubo problema y transfiera a un tubo
mediano. Rotule con plumón indeleble con la letra P.
2. Del tubo estándar, mida del éter de petróleo, los mL que le indique su profesor los
cuales se pasarán a 6 tubos medianos cada medida. Rotule perfectamente sus tubos
como E1, E2 y así sucesivamente.
3. Coloque los tubos en baño maría dentro de la campana de extracción hasta que se
evapore el éter de petróleo. Cabe señalar que se deberá secar perfectamente
cualquier residuo de agua, ya que de lo contrario, al agregar el reactivo de
Liebermann-Burchard, se puede producir una reacción de combustión, con la
consecuente explosión.
4. Enfríe los tubos a temperatura ambiente y envuélvalos en papel aluminio.
5. Agregue 3.5 mL del reactivo de Liebermann-Burchard modificado, el cual será
preparado por el profesor en la campana de extracción de la siguiente forma:
a) 20 volúmenes de ácido acético anhídro (enfriado previamente por 10 min. a 10º C)
más un volumen de ácido sulfúrico concentrado. Mezclar suavemente y refrigerar
por 9 min. Este reactivo deberá usarse dentro de la primera hora de elaboración.
b) Después de enfriar la mezcla anterior, agregar 10 volúmenes de ácido acético
glacial y mezclar perfectamente.
Es importante recordar que debido a su composición química, el reactivo de
Liebermann-Burchard no deberá entrar en contacto con el agua.
6. Agite gentilmente y colóquelos en baño María a 25º C por 30 min., tapando la boca de
sus tubos. Al sacar del baño María tenga cuidado de no salpicar sus muestras ni las de
los demás compañeros
7. Calibre el espectrofotómetro con un tubo blanco, el cual contendrá 3.5 ml del reactivo
de Liebermann-Burchard, a una longitud de onda de 575 nm.
8. Deberá cerciorarse que los tubos para realizar la lectura en el espectrofotómetro
estén perfectamente secos antes de verter la mezcla, que salió de incubación, ya que
como se ha mencionado reiteradamente, dicho reactivo no debe entrar en contacto con
el agua. Para asegurarse, seque perfectamente la parte interna de los tubos con un trozo
de toalla de papel auxiliándose con unas pinzas de disección sin dientes de ratón.
9. Realice la lectura de absorbancia de cada tubo y anote sus resultados. 57
10. Al terminar sus lecturas pase la gradilla de sus tubos cerca de la tarja para que el
profesor se haga cargo de los residuos generados.
11. El contenido de los tubos que aun contienen éter de petróleo deberá vaciarlo en el
contenedor que estará etiquetado como RESIDUO
12. LAVE Y SEQUE PERFECTAMENTE TODOS LOS TUBOS.

RESULTADOS
Realice la curva de calibración en papel milimétrico y en hoja de cálculo (Excel)
como se explica en la Práctica “Cuantificación de proteínas por el método de Bradford ”.
El eje de las ordenadas representará la variable de absorbancia y el eje de las abscisas la de
concentración de colesterol estándar (mg/mL). Calcule los mg de colesterol por mL de
suero con la ecuación:
x= y-b/m

BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA PARA ESTA PRÁCTICA

1. Bohinski, R.C. 1998. Bioquímica. 5a. ed. Addison-Wesley Iberoamericana. EUA.
2. Gallegos, G. 1990. Manual de Bioquímica. Facultad de Medicina Veterinaria y
Zootecnia, UNAM. México.
3. Lehninger, A.1998. Bioquímica. Omega, Barcelona.
4. Murray, R.K., Granner, D.K., Mayes, P.A. y Rodwell, V.W. 2000. Bioquímica de
Harper. 15a. ed. Manual Moderno. México
PRACTICA 9. AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DEL ADN
INTRODUCCIÓN

Los ácidos nucleicos son necesarios para el almacenamiento y expresión de la información

genética. Existen dos tipos químicos distintos de ácidos nucleicos: el ácido
desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN). El ADN, es almacén de la
información genética, no sólo se encuentra en los cromosomas del núcleo de los
organismos eucariotas, también en las mitocondrias y en los cloroplastos de las plantas.

Las células procariotas carecen de núcleo y tienen un solo cromosoma, pero también es
posible que tengan ADN no cromosómico en forma de plásmidos.
El ADN es un polidesoxirribonucleotido que contienen muchos
monodesoxirribonucleotidos unidos mediante enlaces fosfodiéster. Excepto por unos
cuantos virus que contienen ADN de cadena sencilla, el ADN existe como una molécula de
doble cadena, que forma una doble hélice. En las células eucariotas, el ADN se encuentra
relacionado con varios tipos de proteínas (conocidas en conjunto como nucleoproteínas),
presentes en el núcleo, en tanto que en los procariotas el complejo proteína-ADN se
encuentra en el nucleoide. Fig 1

Debido a que el tamaño del núcleo celular impediría la existencia de las cromosomas en
forma extendida, el ADN se compacta formando estructuras superenrolladas. Para lograr
esto es necesaria la interacción del ADN con una gran cantidad de proteína, cada una de las
cuales realiza una función específica en el empacamiento ordenado de estas largas
moléculas de ADN. El ADN eucariota se relaciona con proteínas básicas unidas con
firmeza llamadas histonas. Sirven para ordenar el ADN en unidades estructurales básicas
llamadas nucleosomas y que se parecen a las cuentas de un collar. Los nucleosomas se
disponen además en estructuras cada vez más complejas que organizan y condensan las
largas moléculas de ADN en cromosomas que pueden separarse durante la división celular.

Figura 1. Organización de las Histonas con el ADN, y ejemplificación de Nucleosomas

AISLAMIENTO DEL ADN

El ADN celular es una fuente de material para la obtención de genes que pueden ser
utilizados para la observación estructural e incluso la clonación, procedente de cualquier
tipo de organismo ya sea vegetal, animal, fungal e incluso bacteriano .

59
La extracción se basa en técnicas de ruptura celular por métodos físicos (maceración,
filtración y centrifugación) y químicos, donde la lisis celular es llevada a cabo por
exposición a agentes que afectan la integridad de la membranas celulares:
 NaCl, es una sal que degrada las membranas celulares por su carácter negativo.
 Papaína, es una enzima que desnaturaliza proteínas.
 El dodecil sulfato de sodio (SDS), es un detergente iónico que actúa separando las
grasas (lípidos) y las proteínas que constituyen las membranas que rodean la célula
y el núcleo. Una vez que estas membranas se han roto, el ADN es liberado de la
célula.

Las moléculas del jabón y de grasa están hechas de dos partes:

 La cabeza, a quien le gusta el agua (porción hidrófila)
 Las colas, las cuales odian el agua (porción hidrofóbica)

La moléculas de grasa y jabón se organizan estructuralmente formando burbujas (esferas),

las cuales tienen las cabezas hacia afuera (de manera que estén orientadas hacia el agua) y
sus colas hacia adentro para ocultarse del agua. Fig 2
Cuando el jabón entra en contacto con los lípidos, la similitud de sus estructuras causa que
se combinen formando una bola de grasa jabonosa.
La membrana de la célula tiene dos capas de moléculas de lípidos (grasa) con proteínas
atravesándolas. Cuando el detergente entra en contacto con la célula, captura los lípidos y
las proteínas lo cual libera el ADN.

Figura 2. Ejemplifica la apetencia que tiene el detergente sobre las proteínas que
conforman la membrana celular

Además de permitirnos ver el ADN, el alcohol separa el ADN de otros componentes

celulares por precipitación.

60
OBJETIVOS
 Comprender la importancia del ADN celular
 Realizar la técnica de extracción del ADN de un tejido animal
 Cuantificar a través de espectofotometría, el ADN extraído

MATERIALES

Material y Equipo Reactivos

1 Mortero Chico con pistilo Solución de NaCl 2 M
1 Probeta de 50 mL Agua destilada
1 Tubo de ensaye grande Solución de dodecilsulfato de sodio (SDS) al 2.5%
1 Pipeta Pasteur Papaina
1 Pipeta de 10 mL Etanol al 70% frío
1 Pipeta de 5 mL Solución de NaOH 8 mM
1 Propipeta
Muestra biológica
Hígado de pollo fresco

Material que deberá traer el grupo

1 Hígado de pollo fresco

Material que deberá traer cada equipo de trabajo

3 gasas, toallas de papel, 1 limón y 100 mL de cloro
Material que deberá traer de manera individual
Guantes de látex

METODOLOGÍA

1. Pese 5 g de hígado y macere en el mortero. Una vez macerado agregue 10 mL de

agua destilada.
2. Filtre con ayuda de las gasas en una probeta de 50 mL
3. Agregue 10 mL de NaCl y agite gentilmente durante 5 min.
4. Añada 5ml de SDS al 2.5% y agite gentilmente por 1 min
5. Vierta la solución en el tubo de ensaye grande lentamente por las paredes y evitando
formar espuma.
6. Añada 5 mg de papaína al tubo, teniendo cuidado de que no quede en las paredes,
agite gentilmente y deje reposar 3 min.
7. Agregue 10 mL de etanol al 70% (frío) a la solución anterior vertiendo por las
paredes del tubo. Evite mezclar las fases que ya se han formado.
8. Deje reposar, el ADN se irá separando, a mayor tiempo de reposo mayor cantidad
de ADN.
9. Obtenga una muestra de ADN con ayuda de una pipeta Pasteur (un tercio de la
pipeta) y suspender con 5mL de NaOH al 8mM

61
 10. Calibre el espectrofotómetro con un tubo blanco que contenga 5 mL de NaOH al
8mM. Lea a una absorbancia de 340 nm

RESULTADOS

Para calcular la concentración de ADN por mg de tejido, deberá considerar que:

1 Unidad de absorbancia = 4 mg de ADN

BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA PARA ESTA PRÁCTICA

1. Alberts, B. y col. 1994. Molecular biology of the cell. 3a.. Garland. E.U.A.
Barrera, S.H.A. 1992. Interacción genética: su estructura, función y manipulación.
CONACYT. México.
2. Bowen, R.W. y Baxter, D.N. 1980. Experimental cell biology: an intejnted laboratoy
guide and text. 2a ed. Mc Millan. EUA.
3. Curtis, H. y col. 2000. Biología. 6ª. Médica Panamericana. España.
4. Champe
5. Glauert A. 1991. Fixation, dehydration and embedding of biological specimens. 8a.
North-Holland Publishing Company. E.U.A.
6. Hernández-Montes, H.G.,Iglesias, S. y Mujica, A. 1973. Solubilization of mammalian
spermatozoa structures. Explt. Cell Res. 76: 437-440.
7. Holtzman, E. y Novikoff B., A. 1988. Estructura y dinámica celular. 3a. Interamericana.
México.
8. Lehninger, A.A. 1993. Principles of biochemistry. 2a ed. Worth. EUA.

OTRAS FUENTES CONSULTADAS

www.arrakis.es/~rfluengo/anucleico.html
www. Ceniap.gov.ve/pbd/Revistas técnicas/ceniaphoy/guillen at.pdf

62
 APÉNDICE 1
SOLUCIONES, ÁCIDOS, BASES E INDICADORES DE PH

Densidad () de un ácido es igual a:

= b
v
Donde:
b = peso del ácido
v = volumen del ácido
Los equivalentes (E) de un ácido se calculan con el volumen (V) y la normalidad
(N), pero también se pueden calcular con el peso (a) y el peso equivalente (E) del ácido.
N= a
(V)(E)

En el análisis volumétrico, así como se utiliza el término de normalidad de una

solución, podemos usar la unidad mol y se refiere a la molaridad o concentración molar
(M), que no es otra cosa más que el número de moles por litro de solución.

Moles = gramos del soluto

peso molecular del soluto

Molaridad = moles del soluto

litros de solución
o bien, de forma más cómoda

Molaridad = milimoles del soluto

mililitros de solución

Cuadro 1. Sistemas más comunes usados en análisis cuantitativo

para indicar la concentración de las soluciones.
Sistema Abreviatura
Normal N
Molar M
Molal m
Por ciento en peso P%
Por ciento en volumen V%

63
 Cuadro 2. pH de algunas sustancias o soluciones y coloración que adquieren
diferentes indicadores

Sustancia pH Naranja de metilo

HCl 0.1 N 1.0 Rojo
Jugo de limón 2.0 Rojo
Jugo de naranja 3.5 Canela
Leche 6.4 Amarillo
Agua 7.0 Amarillo
Sangre 7.0 Amarillo
Amoniaco 0.1 N 11.0 Amarillo
NaOH 0.1 N 14.0 Amarillo

Cuadro 3. Características de algunos ácidos y bases

Nombre Peso Equivalente de  Pureza g/l de solución

molecular H g / mL %. 0.1 N
Ácido clorhídrico 36.46 HCl 1.19 37 3.646
Ácido fosfórico 98.00 1/3 H3PO4 1.08 85 3.267
Ácido láctico 90.08 C3H6O3 9.008
Ácido nítrico 63.02 HNO3 1.42 70 6.302
Ácido sulfúrico 98.08 1/2 H2SO4 1.53 95 4.904
Cloruro de amonio 53.49 NH4Cl 5.349
Hidróxido de amonio 35.05 NH4OH 3.505
Cloruro de sodio 58.4 NaCl 5.84
Hidróxido de sodio 40.0 NaOH 4.00

64
 APÉNDICE 2
FUNCIONES Y USO DEL EQUIPO E INSTRUMENTOS EMPLEADOS EN EL
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

Balanza granataria: Esta es utilizada para pesar de 0.1 a 100 g. Algunas presentan un solo
plato y otras dos. Están hechas de metal.

(c)
(b)

(a)

(d)

Balanzas granatarias

Instrucciones para su uso

1. Colocar las pesas (a) en cero de la graduación
2. La aguja (b) debe quedar centrada en la línea negra (c). De no ser así, proceder a mover
la perilla de la derecha (d) hasta que la aguja quede centrada
3. Ahora la balanza esta equilibrada.
4. Coloque sobre el plato derecho, el recipiente donde pondrá su muestra a pesar.
5. La aguja se moverá hacia la derecha y entonces podrá mover la pesa para centrarla
nuevamente.
6. Anote el número de la graduación y ese será el peso del recipiente.
7. Proceder a mover la pesa hasta la cantidad que deseamos pesar, sumando la del peso del
recipiente.
8. La aguja se moverá aun más a la derecha.
9. Sobre el recipiente, ponga poco a poco la muestra hasta que la aguja vuelva a quedar
centrada. Ahora tenemos el peso deseado de la muestra.

65
 Balanza analítica: Este tipo de balanza nos permite pesar de 0.0001 hasta 200 g. Es
más precisa que la granataria. Es importante tomar en cuenta que debe permanecer
en un lugar fijo, ya que el movimiento la descalibra fácilmente.

Balanza analítica

(a)

(d) (b)

(e)
(c)

Instrucciones para su uso

1. Cerciorares de que el platillo (a) este limpio, de lo contrario limpiarlo con un pincel de
cerdas finas.
2. Cerrar las puertas de la balanza.
3. Poner las pesas en cero con los botones selectores (b)
4. En el costado izquierdo inferior, se localiza una burbuja que debe hacerse coincidir con
el circulo marcado en la mica que la contiene, para lograr esto, se deben mover las
perillas que están en la base de la balanza (c).
5. Mover la palanca que se encuentra en el costado izquierdo (d) y que debe estar en
posición horizontal (bloqueo) hacia abajo para encender la escala luminosa que se
encuentra en el tablero, en este momento la balanza esta en disparo. Con el botón del
costado derecho, hacer coincidir en cero de la escala luminosa (e) con la marca.
6. Regresar la palanca en posición horizontal estaremos frenando la balanza y podremos
entonces pesar.

66
7. Para pesar debemos abrir la puerta derecha y colocaremos en el centro del platillo el
recipiente donde se pesará la muestra.
8. Mover la palanca hacia arriba y ajustar el cero de la escala en la marca, esto permitira
descontar el peso del recipiente.
9. Proceder a mover la escala al peso que se desea y posteriormente bajar la palanca.
10. Agregar poco a poco la muestra hasta obtener el peso deseado.
11. Poner la palanca en posición horizontal.
12. Abrir la puerta derecha y sacar el recipiente. Colocar las pesas en cero.
13. Limpiar el platillo de la balanza y cerrar las puertas.

Baño María: Nos sirve para realizar algunas incubaciones a temperaturas superiores a la
del medio ambiente. Existen algunos tipos de baño María que tienen integrado un
mecanismo de movimiento, lo cual permite que la solución adquiera la temperatura deseada
de manera homogénea.

Instrucciones para su uso

Baño María sin agitación

1. El agua que se emplea en el Baño María debe ser destilada y se agregará de ésta hasta el
nivel que se requiera, según el tipo y muestra a incubar.
2. Conectar a la fuente de luz
3. Encender con el interruptor (a)
4. Poner un termómetro en el orificio (b)
5. Regular la temperatura deseada con la perilla (c)

(b) (c)
(a)

Baño María sin agitación

Potenciómetro: También llamado pH-metro, es un aparato que nos permite

determinar la actividad de protones (H+) u hidroxilos (-OH) de una muestra, es
decir, nos determina que tan ácida o alcalina es. Su funcionamiento se basa en que
este aparato mide la actividad de estos iones a través de un electrodo (a). Este
electrodo debe estar siempre en una solución buffer cuando no se utilice(b).
 Algunos potenciómetros deben calibrarse con dos soluciones buffer una con pH
ácido y otra con pH básico.

Potenciómetros

(a)

(b)

Fotocolorímetro y espectrofotómetro: Estos aparatos ópticos, se basan en la medición

de absorbancia o transmitancia de luz a través de soluciones coloridas que contienen
concentraciones conocidas o desconocidas de moléculas, tales como proteínas,
carbohidratos o lípidos.
La determinación cuantitativa de las proteínas, glucosa o colesterol, es importante bajo
diversas condiciones para apoyar el diagnóstico clínico de diversas enfermedades de los
animales. La metodología a emplear es usualmente la fotocolorímetria o la
espectrofotometría, estos métodos nos permiten evaluar la concentración de dichas
moléculas.
Estos métodos ópticos se basan en la medición de absorbancia o transmitancia de
soluciones coloridas y la comparación de la luz que absorbe o transmite la solución
problema, comparada con varias soluciones de concentraciones conocidas.
La ley de Lambert-Bouger-Beer se aplica en los métodos señalados y se refiere a la
intensidad de un rayo luminoso (lo), que incide en una solución, relacionándola con la
intensidad de aquél que, una vez que ha atravesado la solución, sale de la misma con una
intensidad diferente (l). Y puesto que parte del mismo fue absorbido por la solución, dicha
absorbancia dependerá en mayor o menor grado de la concentración (C) de la solución, así
como del diámetro del recipiente que lo contenga (l) y del coeficiente de extinción molar
del disolvente usado:

l = lo e cl

68
Partes del fotocolorímetro
El fotocolorímetro Klett-Summerson consta esencialmente de las siguientes partes,
las cuales se pueden apreciar en el siguiente esquema.
1. Fuente luminosa o lámpara que emite la luz.
2. Dispositivo colimador. Para alinear los rayos luminosos, formando un haz de rayos
paralelos.
3. Selector de longitud de onda, comúnmente llamado filtro, el cual tiene como
función eliminar del haz de luz las radiaciones de longitud de onda que se desee,
para obtener así luz monocromática. Existen tres tipos de filtros, mismos que se
seleccionan dependiendo del color de la solución por estudiar. El filtro azul presenta
una escala espectral de 400 a 465 nm, el verde de 500 a 570 nm y el rojo de 640 a
700 nm.
4. Fotocelda. Transforma la energía luminosa que incide sobre la solución de energía
electrónica.
5. Potenciómetro. Mide la corriente generada en la fotocelda, con escala graduada en
unidades Klett; las cuales presentan equivalencia con las unidades de densidad
óptica (D.O.) de acuerdo a la siguiente fórmula:

D.O = UNIDADES KLETT/500

1
2 3 4
1 4 5
2 3 A

Esquema de las partes que componen el fotocolorímetro. 1. Fuente luminosa,

2.Dispositivo colimador, 3. Filtro, 4. Fotocelda y 5. Potenciómetro y A. Tubo con
muestra

Instrucciones para su uso

1. Antes de encender el aparato, cerciórese de que el filtro esté en su sitio, ya que la
luz sin este dañará la fotocelda. Es conveniente que consulte la siguiente fotografía,
en la que se ilustran los diferentes interruptores del fotocolorímetro.
2. Asegúrese de que la aguja indicadora (c) esté en cero. Si no es así, debe ajustar a
cero con la perilla (d), que solo debe usarse cuando la lámpara del fotocolorímetro
esté apagada.

69
3. Encienda la lámpara con el apagador de la luz (e) y deje que el instrumento se
caliente 5 minutos, hasta que se equilibre para su operación.
4. Ajuste la escala del potenciómetro (b) a cero, moviendo la perilla (a).
5. Coloque el tubo con el blanco de reactivo en el orificio (f) que presenta el aparato
en la parte superior.
6. Encienda el interruptor (h) y con la perilla (g) ajuste la lectura.
7. Una vez calibrado el aparato, se apaga el interruptor (h) y se saca el tubo blanco.
8. Para leer la absorbancia de cualquier tubo, éste es colocado ahora en el orificio (f) y
se debe utilizar nuevamente el sistema de encendido (h). La aguja (c) se desviará de
su posición central hacia un extremo, entonces mueva la perilla (a) que gira la
escala (b), hasta que la aguja (c) marque el trazo central.
9. Anote la lectura en unidades Klett que se tiene en la escala (b) y que posteriormente
se debe convertir a densidad óptica (D.O.) al dividir entre 500. Este es el valor de
absorbancia de la solución colorida que se esta leyendo y no olvide que las lecturas
menores de 25 y mayores de 500 no son confiables.

Fotocolorímetro

(c)

(d) (g) (f)

(b) (a)

(h) (e)

Partes del espectrofotómetro.

El espectrofotómetro posee:
1. Escala de absorbancia y transmitancia.
2. Cuenta con un selector de longitud de onda que nos permite trabajar con
longitudes de onda precisas, comparado con el fotocolorímetro, que utiliza filtros de
color que seleccionan intervalos de longitudes de onda bastante amplios.
3. Los portamuestras en este aparato son tubos de ensaye redondos pero existen
otros modelos de espectrofotómetros que utilizan cubetas de paredes planas que
permiten mediciones más exactas. El laboratorio de Bioquímica cuenta con el
modelo Spectronic 20.

70
 4. Entre sus detectores fotosensibles, cuenta con fotoceldas de capa interpuesta,
tubos fotoemisores y tubos fotomultiplicadores que junto con un miliamperímetro
permiten la obtención de los valores precisos de absorbancia y transmitancia.

Instrucciones para su uso.

1. Debe iniciar con la calibración del aparato, para lo cual será necesario consultar la
fotografía correspondiente.
2. Encender el aparato con la perilla (c) y dejar calentar por 10 min.
3. Seleccionar la longitud de onda deseada con la perilla (a).
4. Ajustar a cero en la escala de transmitancia con la perilla (b), teniendo vacío el
compartimiento donde se introduce el portamuestras
5. Insertar el tubo blanco en la fotocelda (d) y ajuste con la perilla (c) a 100% en la
escala de transmitancia.
6. Retire el tubo e inserte el tubo que contenga la muestra problema y anote la lectura
en porcentaje de transmitancia o absorbancia, según lo requiera la metodología de
su práctica.

(d)

(a)
(b) (c)

ESPECTROFOTÓMETRO

Cámara de electroforesis: Son utilizadas en la separación de biomoléculas como las

proteínas. Cuenta con una cámara, un soporte para colocar los geles que a su vez están entre
dos placas de vidrio y una tapa, la cual tiene dos cable ánodo rojo y cátodo negro, los cuales
se conectan a una fuente de poder.

Cámara de elctroforesis

Fuente de poder

71
 APÉNDICE 3
HOJAS DE SEGURIDAD DE LOS DIFERENTES REACTIVOS EMPLEADOS EN EL
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

72