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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLN


DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLGICAS
SECCIN DE BIOQUMICA Y FARMACOLOGA HUMANA
CARRERA: QUMICA CLAVE DE ASIGNATURA: 1718
PAPIME PE 205615

Q. Arcadia Hernndez Beltrn


Q. Karla Hernndez Prez

NOMBRE DEL ALUMNO:_______________________________________________

SEMESTRE: 2018-I GRUPO: _________________


MANUAL DE PRCTICAS DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA METABLICA
SEMESTRE 2018-1

NDICE
Pgina

Introduccin............................................................................................................... 2

Objetivos generales de la asignatura. 3

Cronograma................................................................................... 4

Reglamento................................................................................................................ 5

Relacin de las actividades experimentales con el programa de la asignatura. 6

Criterios de evaluacin......................................... 7

Accidentes ms frecuentes en el laboratorio. Primeros auxilios............................... 10

Manejo de residuos en el laboratorio de BQ 13

Equipo de proteccin y material de uso comn........................................................ 18

Practica 1. Cuantificacin de DNA............................................................................ 20

Practica 2. Introduccin al metabolismo.......................................................... 26

Practica 3. Fermentacin alcohlica.......................................................................... 38

Practica 4. Extraccin de glucgeno de hgado de ratn....................................... 48

Practica 5. Fotosntesis: Aislamiento de cloroplastos y reaccin de Hill.. 54

Practica 6. Cuantificacin de colesterol en suero sanguneo 63

Practica 7. Cuantificacin de creatinina en suero sanguneo 69

Practica 8. Cuantificacin de calcio en suero sanguneo........................................... 73

Practica 9. Cuantificacin de bilirrubina en suero sanguneo.................................... 77

Practica 10. Cuantificacin de urobilingeno en orina............................................... 82

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MANUAL DE PRCTICAS DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA METABLICA
SEMESTRE 2018-1

INTRODUCCIN

El curso prctico de la asignatura de Bioqumica Metablica para los alumnos de la carrera de


Qumica abarca una serie de prcticas que pretenden proporcionar al estudiante un panorama
general de tcnicas de uso comn para el estudio del metabolismo.

La metodologa que se desarrolla en cada prctica es sencilla, sin aparatos sofisticados ni costosos,
adems los reactivos y soluciones que se utilizan en su mayora son fciles de conseguir. Lo anterior
pretende que con experiencias simples el estudiante reconozca el valor de algunos compuestos de
importancia metablica a travs de extraccin de los mismos o la determinacin de sus niveles para
relacionarlos con algn padecimiento o enfermedad, as como, que comprenda la importancia de
las enzimas y sus mecanismos de regulacin; para que sea capaz de integrar el conocimiento
biolgico a la prctica profesional del qumico, sin importar el rea en el que se desarrolle.

Las prcticas que se desarrollan en Bioqumica Metablica son: Introduccin al metabolismo, en la


cual con una tcnica colorimtrica estudia una reaccin enzimtica in vitro. Se realiza una
fermentacin alcohlica con levadura con diferentes sustratos y bajo diferentes temperaturas. Se
realiza la extraccin del polisacrido de reserva de animales, del hgado de un ratn bajo dos
diferentes condiciones de sacrificio. Se aborda el tema de fotosntesis realizando la extraccin de
cloroplastos para comprobar su capacidad reductora con una tcnica colorimtrica. Se determina y
cuantifica colesterol, creatinina, calcio y bilirrubina en una muestra sangunea as como
urobilingeno en una muestra de orina mediante una tcnica espectrofotomtrica y se compara con
los niveles adecuados de cada uno de ellos.

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MANUAL DE PRCTICAS DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA METABLICA
SEMESTRE 2018-1

OBJETIVO GENERAL DE LA ASIGNATURA

Comprender la dinmica del metabolismo general, los mecanismos para su


regulacin y las bases del rediseo del metabolismo para su aplicacin en
biotecnologa.

OBJETIVO DEL CURSO EXPERIMENTAL

Que el estudiante reconozca el valor de algunos compuestos de Importancia


metablica a travs de extraccin de los mismos o la determinacin de sus
niveles, as como, que comprenda la importancia de las enzimas y sus
mecanismos de regulacin.

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SEMESTRE 2018-1

CRONOGRAMA 2018-I

CARRERA GRUPO PROFESORES DE LABORATORIO


Qumico 1701 IA Miriam lvarez Velasco /Q Karla Paola Hernndez Prez /

Qumico 1751 Q Karla Paola Hernndez Prez / Q. Yesica Natali lvarez Pacheco

SEMANA FECHAS
ACTIVIDAD
1 07-11-08-17 -------

2 14-18-08-17 Inscripcin y Presentacin

3 21-25-08-17 Seminario 1 / Prctica 1: Cuantificacin de DNA

4 28-08-01-09-17 Seminario 2: Metabolismo energtico. Parte 1

5 04-08-09-17 Prctica 2: Introduccin al metabolismo

6 11-15-09-17 Prctica 3: Fermentacin alcohlica

7 18-22-09-17 Seminario 3: Metabolismo energtico. Parte 2

Prctica 5: Fotosntesis, aislamiento de cloroplastos y reaccin de


8 25-29-09-17
Hill.

9 02-06-10-17 Prctica 4: Extraccin de glucgeno en hgado de ratn.

10 09-13-10-17
Seminario 4: Metabolismo no energtico. Parte 1
11 16-20-10-17 Prctica 6 y 7

12 23-27-10-17 Seminario 5: Metabolismo no energtico. Parte 2

13 30-10-03-11-17 Inhbil

14 06-10-11-17 Prctica 8 y 9

15 13-17-11-17 Seminario 6 / Prctica 10: Cuantificacin de Urobilingeno

16 20-24-11-17 Examen Final

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SEMESTRE 2018-1

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SEMESTRE 2018-1

RELACIN DE LAS ACTIVIDADES EXPERIMENTALES CON EL


PROGRAMA DE LA ASIGNATURA

NUMERO TITULO DE PRACTICA UNIDAD TEMTICA EN


EL PROGRAMA DE LA
ASIGNATURA

1 Cuantificacin de DNA UNIDAD 1. Flujo de la


informacin gentica

2 Introduccin al metabolismo UNIDAD 3. Panorama del


metabolismo

3 Fermentacin alcohlica UNIDAD 5. Metabolismo


energtico

4 Extraccin de glucgeno en hgado de UNIDAD 5. Metabolismo


ratn energtico

5 Fotosntesis: Aislamiento de cloroplastos UNIDAD 5. Metabolismo


y reaccin de Hill energtico

6 Cuantificacin de colesterol en suero UNIDAD 5. Metabolismo


sanguneo energtico

7 Cuantificacin de creatinina en suero UNIDAD 6. Metabolismo


sanguneo no energtico

8 Cuantificacin de calcio en suero UNIDAD 4. Diseo y


sanguneo regulacin de las vas
metablicas

9 Cuantificacin de bilirrubina en suero UNIDAD 6. Metabolismo


sanguneo no energtico

10 Cuantificacin de urobilingeno en orina UNIDAD 6. Metabolismo


no energtico

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SEMESTRE 2018-1

CRITERIOS DE EVALUACIN
La evaluacin del curso consiste en el 70% de teora y 30% de laboratorio.
La evaluacin del laboratorio se har con base en:

CONCEPTO PORCENTAJE

Promedio de prcticas 80

Examen 20

ASISTENCIA.- Es requisito indispensable para acreditar el laboratorio, tener el 80% del


total de prcticas y dems actividades realizadas y aprobadas.

PUNTUALIDAD. De acuerdo al reglamento, se dar una tolerancia de 10 minutos para la


entrada a la prctica. Es obligacin de todos estar desde a la hora de inicio de la sesin.
PROMEDIO DE PRCTICAS. Para obtener el promedio de cada prctica se consideran: el
cuestionario previo, el trabajo en el laboratorio y el reporte.

CUESTIONARIO Y EXAMEN previO A LA PRCTICA. Es un trabajo individual de


investigacin que se realiza previo a cada prctica. Se presenta al inicio de la sesin, se
desarrolla en el manual. Adems deben incluir un esquema o diagrama metodolgico del
trabajo experimental de la sesin, se debe anotar la bibliografa consultada con un mnimo de
3 referencias. Al inicio de cada prctica se realiza un examen que incluye preguntas del
cuestionario previo y de la prctica correspondiente, haciendo nfasis en la metodologa de
trabajo.

SEMINARIO DE PRCTICAS. De acuerdo a la prctica se realizar una semana antes o


el mismo da. Se realiza una discusin de la misma en la que se entregan los cuestionarios
previos y se explican con el grupo cada una de las preguntas, se revisan los objetivos y se
analiza la metodologa de tal manera que en el momento en que se lleve a cabo la parte
experimental todo este claro.

TRABAJO EN EL LABORATORIO. El trabajo de laboratorio se evala en una lista de


cotejo con rbrica, de acuerdo al desarrollo que cada alumno tiene durante la prctica y el
conocimiento que tengan del trabajo a realizar. Se consideran las participaciones que el
alumno tenga durante la explicacin de la prctica y las respuestas que den a las preguntas
formuladas por su asesor durante el trabajo prctico. Los puntos especficos a evaluar sern
explicados con detalle durante la presentacin del curso.

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SEMESTRE 2018-1

PARTICIPACIONES. Se consideran las participaciones que tengan durante la explicacin de


la prctica y las respuestas que den a las preguntas formuladas por su asesor durante el
trabajo prctico.

REPORTE. Este es un trabajo de gran importancia, se entrega una semana despus de


realizada la misma. Se debe realizar a mano, con muy buena presentacin y debe cumplir
los siguientes puntos:

CARTULA: La hoja de cartula incluye los siguientes datos:


Nombre de la Institucin y Dependencia (UNAM / FES-C)
Carrera (Qumico)
Asignatura (Bioqumica Metablica)
Grupo: 1701
Reporte de la Prctica No. X ________
No. de Equipo y Nombre de los integrantes del equipo
Fecha de realizacin de la prctica y fecha de entrega del reporte
Semestre 2015-I
Asesores: ________________

INTRODUCCIN Y FUNDAMENTO: VALOR 1.0 Breve descripcin del tema, con


conceptos, importancia y /o fundamento terico de la prctica. Debe abarcar entre 1 y 2
cuartillas.
OBJETIVOS: VALOR 1.0 Se deben plantear su propio objetivo general (qu, cmo y para
qu) y objetivos particulares de acuerdo a la metodologa que se desarrolla; no se toman
en cuenta si se copian textuales del manual.
METODOLOGA: Si la metodologa se realiz exactamente como lo indica el manual,
solamente se anota La indicada en el manual de Bioqumica, correspondiente a la prctica
X, pgina, xx. Si la metodologa tuvo alguna modificacin, se indica cual(es) fue (rn).
OBSERVACIONES Y RESULTADOS: VALOR 2.0. Esta es una parte muy importante del
reporte, no se debe omitir nada. Los resultados se anotarn en cuadros o tablas, pesos,
volmenes, cambios de color, temperatura y cualquier dato obtenido durante el desarrollo
de la prctica. Se debe anotar todo lo que se haya observado, por ejemplo si se hizo
reaccionar A con B, se anota si se observ un cambio de color, de apariencia, temperatura,
o si no hubo cambio aparente, etc. Todo es importante por lo que se deben tener alerta
todos los sentidos. Si se observ algo al microscopio se debe realizar un dibujo lo ms
semejante a la realidad.
CLCULOS Y GRFICOS: En caso de que la prctica lo requiera se realizarn los clculos
correspondientes, de forma perfectamente clara y completa. Los grficos deben hacerse
en papel milimtrico y/o computadora pero siempre se debe anotar en cada coordenada la
propiedad que se est representando con sus unidades respectivas. Se debe cuidar la
escala y no olvidar poner al grfico nombre completo que permita su identificacin.

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SEMESTRE 2018-1

DISCUSIN DE RESULTADOS: VALOR 3.0 Consiste en argumentar los resultados


obtenidos y relacionarlos con los conocimientos tericos. P. ej. Estn de acuerdo los
resultados con el fundamento? Si / No, Por qu? Se discuten tanto lo que se considera
que si sali como lo que se cree que no y se explican las posibles razones. Todos los
argumentos utilizados deben tener un soporte terico que los respalde (citar la bibliografa
consultada).
CONCLUSIONES VALOR 1.0: En las conclusiones se harn deducciones de los resultados.
Para escribir las conclusiones se deben considerar los resultados que se obtuvieron en la
prctica junto con el anlisis que se hizo para cada uno de ellos y los objetivos especficos
del trabajo, adems se debe tomar la precaucin de no citar ningn autor ya que eso es
materia del marco terico presentado en la introduccin. Se debe ser muy claro y breve en
cuanto a sealar que las conclusiones estn referidas a tal objetivo, adems se debe ser
enftico, seguro de lo que se afirma y se presentan como sentencias. Por ejemplo: se logr
identificar..... o se extrajo __x_ protena o , de forma que con solo leer las conclusiones
se pueda estar al tanto de lo que se hizo y los logros obtenidos.
REFERENCIAS VALOR 1.0: Las referencias consultadas para la realizacin del reporte
deben anotarse en esta seccin, tomando en cuenta libros (no menos de 3 en cada
prctica), pginas de internet, artculos, etc. y deben reportarse de acuerdo a normas
internacionales (estilo APA).
LIBRO
Hackett, W. y Robbins, G. (1992). Manual de Seguridad y Primeros Auxilios. Mxico,
D.F: Alfaomega.
ARTICULO
Cintrn, G., Lugo, A. E., Pool, D. J. & Morris, G. (1978). Mangroves of arid
environments in Puerto Rico and adjacent islands.Biotropica, 10(2),110-121.

PAGINA DE INTERNET
Carroll, L. & Gilroy, P. J. (2002). Transgender issues in counselor preparation. Counselor
Education & Supervision, 41, 233-242. Recuperado de

BIBLIOGRAFA: Las referencias bibliogrficas consultadas (no menos de 3 en cada


prctica) se indican con todos los datos para su completa identificacin. se reporta de
acuerdo a normas internacionales. P:Ej.

Alberts,B., Dennis B., Lewis J.; Raff M.; Roberts K.; Watson J. (1994). Biologa Molecular
de la Clula. (3 Edicin). Barcelona, Espaa: Editorial Omega. Paginas Consultadas: 450-
454.

EXAMEN FINAL. Al trmino de las actividades programadas para el semestre los alumnos
realizan un examen en el que se incluyen preguntas de todas las prcticas.

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SEMESTRE 2018-1

ACCIDENTES MAS FRECUENTES EN EL LABORATORIO


PRIMEROS AUXILIOS

TRATAMIENTO URGENTE DE HERIDAS

Las heridas pequeas de las que no sale mucha sangre se desinfectan lavndolas con agua
oxigenada, alcohol o tintura de yodo, despus se tapan colocando la gasa, el algodn y,
finalmente, se recubre con una venda.

Cuando existen hemorragias importantes conviene seguir estos pasos: compresin


inmediata del vaso sangrante, sobre la herida con los dedos perfectamente limpios o con
un pauelo. Elevacin de la parte afectada. Si se controla la hemorragia, se aplica un
apsito fuertemente aunque no tanto que detenga la circulacin del miembro. Cuando la
hemorragia contina posible mente sea necesario realizar una compresin digital en el
trayecto del vaso sangrante por encima de la herida o aplicacin de un torniquete; el mejor
mtodo de aplicacin de un torniquete consiste en una venda de goma arrollada varias
veces sobre una zona ancha por encima de la herida, pero prxima a ella (5 a 10 cm). Cada
quince minutos conviene aflojar el torniquete durante unos segundos y se vuelve a apretar.

En cualquier caso las indicaciones anteriores son para primeros auxilios, despus de lo cual
es muy importante canalizar al herido a que reciba atencin mdica.

TRATAMIENTO URGENTE DE QUEMADURAS

Las quemaduras leves (de primer grado) producidas por fuego u objetos calientes y a
quemaduras producidas por agentes qumicos. Las quemaduras de segundo grado
(formacin de ampollas) y las de tercer grado (destruccin de la capa superficial de la piel)
requieren la atencin inmediata del mdico.

Las quemaduras leves producidas por objetos calientes o fuego se tratan con disolucin
acuosa o alcohlica muy diluida de cido pcrico, con dermatol o con vaselina y se vendan
despus. Para tratar quemaduras con sulfamidas se deben tomar precauciones, debido a
que hay personas que presentan alta sensibilidad a estos medicamentos.

Las quemaduras con reactivos qumicos requieren retirar rpidamente las ropas
contaminadas y lavar repetidamente la zona afectada con grandes cantidades de agua. Si
la quemadura se produjo por un cido, posterior al lavado con agua conviene realizar otro
con solucin de bicarbonato de sodio, para asegurar la neutralizacin; si la quemadura se
produjo por lcalis la neutralizacin se efecta con disolucin de cido brico.

Si la quemadura se produjo por salpicadura en los ojos, stos deben lavarse


inmediatamente con mucha agua y posteriormente debe acudir al oftalmlogo.
TRATAMIENTO URGENTE DE LA ASFIXIA Y ELECTROCUCIN

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SEMESTRE 2018-1

Los sntomas de asfixia se manifiestan por el tono azulado que adquieren los labios y los
lbulos de las orejas; la prdida del conocimiento y la interrupcin de la respiracin. Debe
situarse a la vctima al aire libre y practicarse la respiracin artificial.

Los sntomas de la electrocucin son la prdida del conocimiento, la interrupcin de la


respiracin y las quemaduras en el punto de contacto con el cable elctrico. Lo primero es
el rescate del herido y su aislamiento elctrico. Despus se le aplica respiracin artificial y
se tratan las quemaduras.

TRATAMIENTO DE LAS INTOXICACIONES MS FRECUENTES

Generalmente lo mejor es intentar que la vctima vomite bebiendo agua tibia o con una
solucin de sulfato de cobre al 0.2%. Tambin se puede provocar por estimulacin de la
garganta con un dedo.

En la siguiente tabla aparecen los venenos ms comunes y las precauciones y antdotos


que se deben tomar:

INTOXICACIONES MS FRECUENTES

SUBSTANCIA PROPIEDADES Y PRECAUCIONES Y ANTDOTOS


ACCCIN

cidos (HCl, Corrosivos Los cidos concentrados se manejan


HNO3, H2SO4, preferentemente con guantes y gafas. Las
etc.) quemaduras se lavan con agua y con solucin
de bicarbonato. Si han sido bebidos, se debe
tomar agua con bicarbonato o magnesia.

lcalis Corrosivos Las quemaduras se lavan con agua y con


solucin de cido brico o actico al 2%. Si se
han respirado vapores de amonaco
concentrado se bebe cido actico al 1% y se
tragan trocitos de hielo en reposo absoluto.

Arsnico, Muy venenosos. Los Usar guantes y mascarilla para su manejo.


arsenamida, vapores de fosfamina y
fosfamina arsenamida son Tomar aire fresco. Beber agua salada y caliente.
mortales.

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SEMESTRE 2018-1

cido cianhdrico. Los vapores de HCN Usar mascarilla para su manejo. Beber
Cianuro de son mortales. Tambin disolucin de permanganato de potasio o sulfato
potasio se produce ferroso .al 0.2%. Aplicar respiracin artificial de
envenenamiento a ser posible con oxgeno. Tomar caf
travs dela piel. concentrado como vomitivo. Llamar enseguida
al mdico.

Cloro, Bromo y Corrosivos Oler amonaco diluido, alcohol o ter. Aplicar


vapores de cido lavados con solucin de tiosulfato de sodio.
clorhdrico

Derivados Dolores de cabeza. El Usar mascarilla para su manejo.


halogenados tetra cloro etano ataca
al hgado.

ter Narctico Respiracin artificial.

Si ha sido bebido utilice vomitivos. Beber


solucin de carbonato de sodio

Fenol Corrosivo. Usar guantes de plstico para su manejo.


Enfermedades de la Mucho aire. Solucin de sulfato de sodio
piel. Cancergeno

cido fluorhdrico Corrosivo y venenoso Lavar la piel con amonaco al 3%. Para los ojos
seguir tratamiento para cidos. Inhalar
amonaco diluido

Fsforo Venenoso Beber grandes cantidades de solucin de


sulfato de cobre al 0.2%. Evite el uso de aceite.

Fosfogeno Venenoso Usar mascarilla para su manejo. Inhalacin de


oxgeno. Reposo. No aplicar respiracin
artificial.

Gases nitrosos Venenosos Inhalar oxgeno. Respirar amonaco diluido.

Mercurio y sus Vapores perjudiciales Tomar vomitivos. Leche, solucin de tanino.


compuestos

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Monxido de Venenoso. Mortal Aire fresco. Respiracin forzada, oxgeno si es


carbono necesario.

Sulfato de Venenoso Usar guantes de plstico para su manejo. Lavar


dimetilo la piel con agua y jabn. En caso de haberlo
respirado, inhalar vapores de amonaco diluido y
beber solucin de bicarbonato.

Sulfuro de Venenoso Aire fresco.


carbono

cido sulfhdrico Venenoso Aire fresco. Respiracin forzada, inhalacin de


oxgeno si es necesario.

MANEJO DE RESIDUOS EN EL LABORATORIO DE BIOQUMICA


En el laboratorio de bioqumica igual que en la mayora de los laboratorios donde se realizan
prcticas se manejan una cantidad de productos y se efectan diversas actividades
experimentales que conllevan a la generacin de residuos que en la mayora de los casos
son peligrosos para la salud y el medio ambiente. Aunque el volumen de residuos que se
generan en los laboratorios de docencia, es pequeo en relacin al proveniente del sector
industrial, no por ello se debe minimizar el problema.

Las condiciones de trabajo adecuadas en un laboratorio, incluyen el control, tratamiento y


eliminacin de los residuos generados en el mismo, lo cual disminuye los riesgos
potenciales en la salud que normalmente se corren al trabajar con agentes qumicos; por lo
que su gestin es un aspecto imprescindible en la organizacin de todo laboratorio. La
minimizacin, eliminacin y reduccin de los residuos generados, almacenados o
descargados y el almacenamiento y tratamiento de los residuos qumicos peligrosos, es
una actividad que cada vez esta adquiriendo mayor importancia en todas las instituciones
dedicadas a la enseanza, y cada uno de los laboratorios en los que se imparten prcticas,
se est haciendo responsable de promover un manejo adecuado de los residuos que
generan para posteriormente canalizarlos a los responsables de su tratamiento.

Algunos factores que deben tenerse en cuenta para solucionar el problema son:

Aplicar permanentemente las Normas de Bioseguridad establecidas para los desechos en


el laboratorio.
Tener en cuenta las Condiciones de Riesgo de algunos residuos.
El incremento de los desechos por el uso de material desechable, como elemento esencial
de Bioseguridad.
Informacin Actualizada del manejo adecuado de los desechos.

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Integracin de la comunidad educativa, en el Manejo Responsable de los Desechos.

RECOMENDACIONES

1. Considerar los desechos como potencialmente peligrosos, por ser el producto de


todos los procesos biolgicos y qumicos.

2. En el manejo de los desechos se deben tener en cuenta tres elementos bsicos:

El Individuo
Las acciones Institucionales
La coordinacin interinstitucional.

3. Clasificar los residuos en la fuente, utilizando recipientes debidamente marcados y/o


bolsas con los cdigos de colores respectivos de acuerdo con el tipo de residuo que
se vaya a desechar.

BOLSA ROJA: Desechos Anatomopatolgicos Residuos que implican


contaminacin biolgica
BOLSA NEGRA: Desechos ordinarios, comunes, no reciclables
BOLSA BLANCA: Material reciclable.

DESECHO BIOLGICO

Son aquellos desechos o residuos generados en el diagnstico, tratamiento, inmunizacin,


produccin o pruebas de productos biolgicos, que alteran el proceso salud enfermedad
debido a que contienen microorganismos patgenos o que sus caractersticas fsico
qumicas pueden ser txicas para las personas que tengan contacto con ellos o alteren al
Medio Ambiente.

DESECHO QUMICO

Son todos los residuos derivados del manejo de productos qumicos, que por ser corrosivos,
reactivos, txicos, explosivos, inflamables y radioactivos, generan efectos nocivos para las
personas y el Medio Ambiente.

1. GENERACIN DE LOS DESECHOS

La generacin de residuos o desechos, est determinada por la complejidad y la frecuencia


de las actividades que se realizan durante el desarrollo de las prcticas en cada uno de los
laboratorios, la eficiencia que alcancen en sus tareas los responsables (docentes) de
realizar todas las acciones y de la metodologa aplicada. Estos factores son tiles para
evaluar la generacin de residuos en cada prctica, adems, son el punto de partida para
el dimensionamiento del sistema de manejo.

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FLUJOGRAMA DEL MANEJO DE RESIDUOS QUMICOS

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EQUIPO DE PROTECCIN Y MATERIAL DE USO COMN


EQUIPO DE PROTECCIN

En cada prctica es requisito indispensable el uso de:


Bata blanca hasta la rodilla de manga larga, en buenas condiciones, limpia y planchada
Cubrebocas nivel 3
Guantes de nitrilo para cirujano
Lentes de seguridad aun cuando se usen anteojos

MATERIAL DE USO COMN

Cada alumno debe contar con:


Manual de prcticas con nombre y engargolado con pastas en color morado
Marcador indeleble de punto fino
Lpices de colores
Propipeta
1 Regla
1 Tijeras

Cada equipo de trabajo debe contar con:


1 L de alcohol 96
1 L de cloro
Detergente lquido para trastes
Escobilln para tubos de ensaye
Escobilln para vasos y matraces
Una franela para el rea de trabajo de 50 x 60 cm
2 jergas o franelas (una para secar material y otra para derrames)
1 Rollo de servitoallas
1 Pinzas de diseccin
1 Navaja de un solo filo
10 gasas de 10 x10 cm

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10 abatelenguas
5 lancetas
Papel aluminio
1 esptula de cromo-nquel
1 paquete de algodn de 50g
Cerillos o encendedor
10 Bolsas de plstico para basura

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PRACTICA 1
CUANTIFICACIN DE DNA

OBJETIVO

Cuantificar DNA mediante la reaccin colorimtrica con Difenilamina para comparar la


cantidad de DNA de diferentes especies.

CUESTIONARIO PREVIO

1. Explique los mtodos de extraccin de cidos nucleicos en muestras biolgicas


2. Cules son las reacciones qumicas de identificacin de cidos nucleicos?
3. Cul es el fundamento de la reaccin colorimtrica que se realizar en la prctica?
4. Investigar la longitud de onda a la cual se puede cuantificar el DNA
espectrofotomtricamente.

GENERALIDADES

En los organismos eucariontes el DNA se encuentra formando parte de la ncleoprotena


de los cromosomas del ncleo. La cantidad de DNA en las clulas de una especie
determinada es constante. La funcin es almacenar informacin gentica.

Hay diferentes tcnicas que permiten obtener cidos nucleicos con alto grado de pureza.
Las ms utilizadas suelen incluir una etapa de ultracentrifugacin en gradientes de CsCl o
una cromatografa de intercambio inico. Sin embargo, muchas aplicaciones de laboratorio
no necesitan un grado de pureza tal que justifique incluir estas tcnicas en los protocolos
de purificacin. Por ello se lleva acabo procedimientos como la desintegracin del tejido,
solubilizacin y homogenizacin de los componentes celulares, precipitacin de los cidos
nucleicos y disolucin en un buffer adecuado.

En la mayora de los casos cuando se trabaja con DNA es importante realizar una
cuantificacin de la cantidad con la que se dispone. La cuantificacin del DNA se puede
llevar a cabo por estimacin de la intensidad de una banda en geles de agarosa en el que
el DNA es teido por algn colorante como Bromuro de Etidio o bien mediante tcnicas de
espectrofotometra de luz ultravioleta.

Debido a las caractersticas de los nucletidos se han podido obtener mtodos qumicos de
identificacin, por ejemplo mediante la reaccin colorimtrica del monosacrido con los
reactivos de Bial y Difenilamina. En solucin cida, la cadena lineal de una desoxipentosa

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SEMESTRE 2018-1

se convierte a la forma -hidroxilevulinoaldehdo altamente reactiva y que reacciona con


difenilamina para dar un complejo azul con una absorcin mxima a 595 nm.

NOTA: En el DNA nicamente reacciona la desoxirribosa de los nucletidos de purina, as


que el valor obtenido representa la mitad del total de desoxirribosa presente.

MATERIAL Y REACTIVOS

MATERIAL QUE DEBEN PROPORCIONAR LOS ALUMNOS

1 navaja 1 palillo largo de madera


1 cuadro de 10x 10cm de madera NaCl
Detergente lquido (Dawn o Axin) 1 kiwi

MATERIAL POR EQUIPO MATERIAL POR GRUPO

1 varilla de vidrio 5 espectrofotmetros


4 tubos de ensaye 1.5 x 15 cm 1 virtis
1 embudo de vidrio 2 balanzas electrnicas
2 pipetas graduada de 10mL 5 baos mara con gradilla
2 vasos de precipitado 250mL 5 termmetros
2 vasos de precipitado 100mL 2 celdas de cuarzo
1 propipeta 1 micropipeta de 10-100L
1 probeta de 100mL 1 micropipeta de 100-1000L
1 vaso de precipitados de 500mL 1 pipeta graduada 10mL
1 piseta 3 vasos de precipitado 10mL
2 vidrio de reloj mediano 1 vaso de precipitado 50mL
3 tubos Eppendorf
1 soporte universal
1 aro metlico
1 triangulo de porcelana
1 tripie
1 mechero Bunsen
1 tela de asbesto
1 vaso de precipitados de 250mL

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MANUAL DE PRCTICAS DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA METABLICA
SEMESTRE 2018-1

REACTIVOS

25 mL de reactivo de difenilamina al 4% (en frasco 15 mL Acido perclrico (PCA) 10% (en


mbar) gotero)
10 mL de reactivo de Bial (en frasco mbar con
10 mL Acetaldehdo 0.8% fro
gotero)

100 mL de etanol 1 pliego de papel filtro

10 mL HCl concentrado (en gotero)

METODOLOGA

I. Extraccin del DNA de Kiwi

1. Prepare un bao de agua con hielo, en un recipiente de una profundidad de 5 a 8


cm. Ponga los 50 mL de etanol fro en un vaso de precipitados de 100 mL y coloque
en el bao de hielo.
2. Prepare la disolucin de extraccin de DNA, para ello disuelva 2 g de NaCl en 90 ml
de agua en un vaso de precipitados de 250 ml, luego agregue 10 mL de detergente
lquido y agite muy suavemente! con el agitador.
3. Pele el kiwi y corte en pedazos regulares.
4. Use la balanza para pesar 30 g de pedazos de kiwi, luego realice un pur fino.
5. Coloque el pur de kiwi en un vaso de precipitado de 100 mL.
6. Vierta la disolucin de extraccin de DNA (paso 2) sobre el pur de fruta, de forma
tal que el volumen total de fruta y lquido sea aproximadamente el doble del de pur
de fruto solo.
7. Prepare un bao de agua caliente (aprox. a 80C) hasta una profundidad entre 5 y 8
cm.
8. Coloque el vaso de precipitados con la fruta y la disolucin de extraccin en el bao
de agua caliente por 15 minutos. Agite la disolucin ocasionalmente para distribuir el
calor. La temperatura del bao no debe bajar de 60C en ningn momento durante
el periodo de incubacin.
9. Despus de los 15 minutos, transferir el vaso que contiene la fruta al bao de hielo
y deje reposar all por 5 minutos, agitando ocasionalmente a medida que se enfra.
10. Mientras se enfra la mezcla de extraccin, monte el dispositivo de filtracin. Este
consiste del embudo que se coloca sobre un vaso de precipitado de 250 mL, con el
papel filtro doblado y humedecido. Ayudndose de un soporte universal y de anillo
metlico.
11. Coloque la mezcla de extraccin fra en el embudo. Permita que el lquido se filtre
por 5 minutos.

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MANUAL DE PRCTICAS DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA METABLICA
SEMESTRE 2018-1

12. Vierta el filtrado en un vaso de precipitados de 50 mL de filtrado en cada uno.

II. PRECIPITACIN DEL DNA


1. Con mucho cuidado deje escurrir por las paredes de los vasos de precipitado 10 mL
de etanol fro (lo ms fro que se pueda tener) sobre el filtrado. Tambin puede
agregarse el alcohol por medio de un gotero, dejando resbalar las gotas con el gotero
inclinado
2. Observe lo que sucede en la interfase entre el alcohol y el filtrado. Anotar sus
observaciones
3. Permita que la muestra repose durante por dos minutos, sin moverlas. Se formarn
fibras blancas viscosas en la interfase con el alcohol. Este es el DNA.
4. Recupere el DNA enrollndolo en la varilla de vidrio o palillo de madera a partir de la
interfase con el alcohol y colquelo en un tubo Eppendorf, etiquete

III. DETERMINACIN COLORIMTRICA DE LA PRESENCIA DE CIDOS NUCLEICOS


1. En un tubo Eppendorf coloque una alcuota de 10 L de la muestra de DNA obtenido
2. Caliente en bao mara por 10min.
3. Aada 2 gotas del reactivo de Bial y 15 L de HCl concentrado.
4. Observe el color producido. Anote su observacin en el cuadro A.
5. En un tubo de ensayo coloque una alcuota de 500 L de muestra de DNA obtenido
y 500 L de cido perclrico (PCA) al 10%.
6. Caliente en bao mara por 10min. Esperar a que enfri un poco.
7. Poner los tubos en hielo. Aadir 2 mL del reactivo de Difenilamina y agitar. Proteger
el tubo de la luz.
8. Aadir 100 L de la solucin de acetaldehdo y agitar.
9. Observe el color producido. Anotar observacin en el cuadro A.
10. Realice la lectura en el espectrofotmetro a 595nm

IV. CUANTIFICACIN DE DNA


1. Reporte la lectura de absorbancia registrada en el paso 10 del apartado III y con
ayuda de la curva patrn (tabla 1) determinar la concentracin de DNA de la muestra.
Tabla 1. Curva patrn de DNA

[ ] g/mL
20 25 50 75 100
DNA

Abs 0.026 0.037 0.080 0.117 0.157

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MANUAL DE PRCTICAS DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA METABLICA
SEMESTRE 2018-1

2. Grafique en papel milimtrico e interpole

OBSERVACIONES Y RESULTADOS

Cuadro A. DETERMINACIN COLORIMTRICA DE LA PRESENCIA DE CIDOS


NUCLEICOS

Eppendorf Tubo de ensayo

Cuadro B. CUANTIFICACIN DE DNA

[ ] g/mL
Absorbancia
DNA

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MANUAL DE PRCTICAS DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA METABLICA
SEMESTRE 2018-1

MANEJO DE RESIDUOS

Los residuos producidos en esta prctica sern manejados de acuerdo a las indicaciones
proporcionadas en el apartado correspondiente de este manual: los cidos o bsicos se
neutralizan y se eliminan en las tarjas con suficiente agua; los solventes y mezclas de
reactivos se guardarn en frascos perfectamente etiquetados que permita conocer en todo
momento que tipo de residuos son, quin los gener y en que prctica. Los desechos
slidos se colocan en bolsas y se depositan en los cestos de basura. Si tiene dudas consulte
a su asesor.

BIBLIOGRAFA

1. Karp, G. (2010). Biologa celular y molecular. (6 ed) D.F., Mxico: Mc Graw Hill.
2. Sambrook, J. y Russell, D. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (3
ed.) Nueva York, USA: Cold Spring Harbor Laboratories.
3. Flores, G., Domnguez, M. y Gonzlez, N. (2013). Manual de Prcticas de
Gentica Molecular. D.F, Mxico: Facultad de Estudios Superiores Cuautitln,
UNAM.
4. Horton, R. (2008). Principios de Bioqumica. (4 ed.) D.F, Mxico: Pearson
Educacin.
5. Alberts, B., Dennis, B., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. y Watson, J. (2000).
Biologa Molecular de la Clula. (4 ed.) Barcelona, Espaa: Editorial Omega.

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MANUAL DE PRCTICAS DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA METABLICA
SEMESTRE 2018-1

PRCTICA 2
INTRODUCCIN AL METABOLISMO

OBJETIVOS

1. Comprender que el metabolismo es un proceso integrado por una serie de reacciones para
determinar la funcin vital de las enzimas.

2. Reconocer la importancia de las enzimas dentro del metabolismo global, utilizando como
ejemplo la degradacin del almidn in vitro.

3. Conocer la funcin y actividad de la enzima -amilasa.

CUESTIONARIO PREVIO

1. Qu es el metabolismo? Explique
2. Explique cada una de las fases del metabolismo.
3. Cul es la importancia de las enzimas dentro del metabolismo global?
4. Qu significa IN VIVO e IN VITRO? D un ejemplo.
5. Cul es la composicin de la saliva?
6. Cules son las funciones de la saliva?
7. Qu es la Dilisis y como se realiza?
8. Qu le ocurre a una muestra de saliva al dializarla?
9. Cul es la estructura del almidn y cules son sus productos de hidrlisis?
10. Explique la reaccin del iodo con el almidn y sus productos de hidrlisis.

CONTENIDO

En esta prctica el alumno realiza la hidrlisis enzimtica del almidn, por medio de la
amilasa salival y para detectar la desaparicin de este polisacrido utiliza la reaccin con
lugol. Lleva a cabo la dilisis de la saliva y compara la actividad de una muestra de saliva
dializada y una no dializada. A travs del mtodo espectrofotomtrico determina
cuantitativamente la actividad de la amilasa salival.

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MANUAL DE PRCTICAS DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA METABLICA
SEMESTRE 2018-1

GENERALIDADES

METABOLISMO

El metabolismo se define como la suma total de reacciones enzimticas complejas que se


llevan a cabo en un organismo. Implica el estudio de miles de reacciones que suceden
dentro de la clula, pero tambin, la coordinacin, regulacin y sus requerimientos
energticos.
Dentro de las finalidades del metabolismo estn las de:

Obtener energa qumica del entorno, ya sea de elementos orgnicos nutritivos o


de la luz solar.
Convertir los elementos nutritivos exgenos en precursores de macromolculas.
Formar macromolculas.
Formar y degradar biomolculas necesarias para las funciones celulares
especializadas.

Se le llama ruta metablica a la secuencia de reacciones que permite degradar, sintetizar


o transformar un sustrato en particular, por ejemplo, la degradacin de glucosa en piruvato
(gluclisis). Una ruta metablica en especial puede ser lineal (como la gluclisis), ramificada
(sntesis de aminocidos), cclica(el ciclo del cido ctrico), o en espiral(la degradacin de
cidos grasos).

Las vas metablicas se pueden agrupar dentro de dos fases principales:

1. Catabolismo. Es la degradacin enzimtica de molculas nutritivas complejas


como: grasas, carbohidratos y protenas a molculas ms simples como: lactato,
piruvato, etanol, CO2, H2O y NH3.

2. Anabolismo. Biosntesis enzimtica de grandes biomolculas complejas a partir de


molculas precursoras ms pequeas.

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MANUAL DE PRCTICAS DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA METABLICA
SEMESTRE 2018-1

Caractersticas distintivas entre el catabolismo y el anabolismo:

Catabolismo

Degradacin de biomolculas
Proceso global de oxidacin qumica y produccin de cofactores reducidos NADH,
NADPH y FADH2
Liberacin de energa qumica (reacciones exotrmicas) y produccin de ATP a
partir de ADP
Convergencia de vas

Anabolismo

Sntesis de biomolculas
Abarca todo el proceso de reduccin qumica y produccin de cofactores oxidados
NAD+, NADP+, FAD
Requiere de energa qumica (reacciones endotrmicas) y utiliza ATP
Divergencia de vas

La comprensin del metabolismo requiere del conocimiento de la qumica de las


biomolculas, de las reacciones en las cuales participan y los mecanismos reguladores de
la velocidad de las reacciones.

DIGESTIN
Los seres vivos requieren de un suministro continuo de energa para subsistir. Esta energa
la obtienen de la oxidacin de los alimentos, que son compuestos qumicos procedentes de
otros animales o de vegetales, tales como; carbohidratos, lpidos y protenas. Estos
compuestos qumicos se caracterizan por ser de elevado peso molecular y de estructura
muy compleja; por lo que la mayor parte de ellos no pueden ser asimilados directamente.
Para que puedan ser absorbidos por el organismo deben ser degradados a sus
componentes ms sencillos, es decir: las protenas a aminocidos, los oligo y polisacridos
a monosacridos y los lpidos a alcoholes y cidos grasos
El conjunto de procesos mecnicos e hidrolticos que sufren los alimentos para ser
asimilados se denomina digestin, sta puede ser intra o extracelular. En la mayor parte
de los organismos inferiores la digestin es intracelular y en los organismos superiores
extracelular y se realiza en el tubo digestivo.
Los cambios qumicos que ocurren durante la digestin se llevan a cabo con la ayuda de
las enzimas, que se encuentran distribuidas en diferentes zonas del aparato digestivo. Los

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MANUAL DE PRCTICAS DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA METABLICA
SEMESTRE 2018-1

factores que afectan la actividad de las enzimas son entre otros el pH y la temperatura y
para que cada enzima presente su mxima actividad debe encontrarse en condiciones
ptimas, de lo contrario se disminuye considerablemente su actividad. Adems, es
importante recordar que se deben encontrar presentes en el medio de reaccin los
cofactores o coenzimas respectivos.

SALIVA
En los organismos superiores, como el hombre, la digestin se inicia en la boca con la
masticacin de los alimentos que fragmenta las partculas grandes de alimento, que se
mezclan con la saliva y se transforman en una papilla denominada bolo alimenticio. En
ausencia de saliva, las partculas pequeas tienden a dispersarse y hacen difcil la
deglucin por que no forman bolo. La cantidad de masticaciones depende del alimento pero,
por lo general vara entre 20 y 25.

Glndulas salivales

La saliva es un fluido biolgico viscoso producido por las glndulas salivales, que contiene
99.5 % de agua, sales minerales ( Na+, K+, Cl-, HCO3,) y varias enzimas digestivas; la lipasa
lingual una enzima importante para la digestin de la leche, y la -amilasa. Tambin
contiene mucinas, glucoprotena lubricante del alimento y protectora de la mucosa oral; es
la responsable de la viscosidad de la saliva.

Otras protenas presentes son la muramidasa o lisozima que ataca el cido murmico de
algunas bacterias, la lactoferrina, una protena que liga al hierro, el factor de crecimiento
epidrmico que estimula el crecimiento de las clulas de la mucosa gstrica,
inmunoglobulinas (IgA) y sustancias del sistema sanguneo.
La saliva desempea varias funciones importantes: facilita la deglucin, conserva la boca
hmeda, sirve como solvente para las molculas estimulantes de las papilas gustativas,
ayuda al habla al facilitar los movimientos de los labios y de la lengua, adems de que
conserva la boca y los dientes limpios. El agua y las mucinas que contiene ablandan y
lubrican el bolo y las enzimas digestivas que contiene inician el proceso digestivo.

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MANUAL DE PRCTICAS DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA METABLICA
SEMESTRE 2018-1

La saliva puede servir de vehculo para la excrecin de algunas sustancias, (como el alcohol
y la morfina), de iones inorgnicos (como el K+, Ca2+, HCO3, yodo, tiocianato) y de
inmunoglobulinas.
El pH de la saliva por lo general es de 6.8, pero puede variar a ambos lados de la neutralidad
y debido a su contenido de HCO3- tiene propiedades neutralizantes de los cidos, de
manera que juega un importante papel en la higiene bucal.

-AMILASA
Para los carbohidratos la digestin se inicia en la boca, por la
saliva, la cual contiene a la enzima ptialina, -amilasa o
amilasa salival, que es una enzima que hidroliza enlaces
glucosdicos del almidn y glucgeno, dando como productos
maltosa, maltotriosa, dextrinas lmites y algo de glucosa (in
vitro); en el organismo, debido al corto tiempo que actan
sobre los alimentos su accin, no es de mucha importancia.
Adems es fcilmente inactivada a pH de 4 o ms cidos, por
eso su accin cesa en el medio cido del estmago. En ciertas
personas la saliva presenta una actividad de amilasa muy Amilasa salival humana
dbil o nula.

Enzima Fuente y estmulo deActivadores y Sustrato Productos finales


secrecin condiciones
ptimas para su
actividad
-amilasa Glndulas salivales, Requiere el ion Almidn Maltosa,
o amilasa secretan saliva como cloruro Glucgeno Oligosacridos
salival respuesta refleja a la pH de 6.6 a 6.8 Maltotriosa
presencia de alimentos Dextrinas lmite
Algo de glucosa

DILISIS

Los lquidos presentes en los organismos son dispersiones de diversas sustancias en el


seno del agua. Segn el tamao de las partculas se formarn dispersiones moleculares o
disoluciones verdaderas como ocurre con las que se forman con las sales minerales o por
sustancias orgnicas de molculas pequeas, como los azcares o aminocidos.
La dilisis es un mtodo de separacin y purificacin de biomolculas que consiste en el
paso de molculas de bajo peso molecular a travs de una membrana dializadora. El
disolvente, y las molculas de bajo peso molecular como iones inorgnicos (cloruro y sodio)
y pequeas molculas orgnicas (glucosa) atraviesan la membrana desde la solucin ms
concentrada a la ms diluida, la difusin de las molculas es inversamente proporcional a

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MANUAL DE PRCTICAS DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA METABLICA
SEMESTRE 2018-1

su peso molecular. Las membranas dialticas son aquellas permeables al agua y a solutos
cristaloides, como el celofn, pergamino y el colodin.
Este mtodo permite la separacin de iones y molculas pequeas como la glucosa de
macromolculas como las protenas, con lo cual estas ltimas se pueden purificar.
La dilisis es un proceso muy lento, en algunos casos requiere das e incluso semanas para
su realizacin. Los coloides muy dializados se vuelven inestables al perder demasiados
electrolitos y tienden a precipitar.
La difusin es el fenmeno por el cual las molculas disueltas tienden a distribuirse
uniformemente en el seno del agua. Puede ocurrir tambin a travs de una membrana si
es lo suficientemente permeable.
Cuando se tienen dos disoluciones acuosas de distinta concentracin separadas por una
membrana semipermeable (deja pasar el disolvente pero no el soluto), se produce el
fenmeno de la smosis que sera un tipo de difusin pasiva caracterizada por el paso del
agua (disolvente ) a travs de la membrana semipermeable desde la solucin ms diluida
(hipotnica) a la ms concentrada (hipertnica), este traslado continuar hasta que las dos
soluciones tengan la misma concentracin (isotnicas o isoosmticas). Se entiende por
presin osmtica la presin que sera necesaria para detener el flujo de agua a travs de
la membrana semipermeable.

A travs de estos fenmenos se realizan los intercambios de gases y de algunos nutrientes


entre la clula y el medio en el que vive. La membrana plasmtica de la clula puede
considerarse como semipermeable, y por ello las clulas deben permanecer en equilibrio
osmtico con los lquidos que las baan. Cuando las concentraciones de los fluidos
extracelulares e intracelulares es igual, ambas disoluciones son isotnicas. Si los lquidos
extracelulares aumentan su concentracin de solutos se hacer hipertnicos respecto a la
clula, y sta pierde agua, se deshidrata y mueren (plamlisis). Y si por el contrario los
medios extracelulares se diluyen, se hacen hipotnicos respecto a la clula, el agua tiende
a entrar y las clulas se hinchan, se vuelven turgentes (turgencia), llegando incluso a
estallar.

MEMBRANAS SEMIPERMEABLES
Son aquellas que permiten el paso de molculas en funcin de su peso/tamao molecular,
permitiendo el paso de pequeas molculas pero impidiendo el paso de molculas de gran
tamao. Estas membranas estn dotadas de poros microscpicos y dependiendo de las
dimensiones de los poros, podrn pasar determinadas molculas a travs de ellas. Unas
lo harn libremente, otras a medias y otras no podrn pasar en absoluto. Este transporte
de masa a travs de las membranas semipermeables sigue determinadas reglas:
Transporte difusivo: por diferencia de concentracin. Es un transporte pasivo que no
consume energa. El movimiento de solutos por difusin es el resultado del movimiento al
azar que tienen las molculas dentro de esta solucin. Un soluto en una disolucin, en su
movimiento aleatorio de vez en cuando impacta contra la membrana. Si la molcula de
soluto encuentra un poro de tamao adecuado podr pasar al otro lado de la membrana.
De igual manera en la solucin existente al otro lado de la membrana podr ocurrir lo mismo
y otro soluto podr pasar en direccin contraria.

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SEMESTRE 2018-1

Diferencia o gradiente de concentracin: la cantidad de soluto que pase de una solucin A


a una solucin B y viceversa va a depender del nmero de impactos o colisiones contra la
membrana. La frecuencia de colisiones contra la membrana va a depender de la
concentracin de solutos a cada lado de la membrana. Por ejemplo, si la concentracin de
un soluto x en una solucin A es 50 mmol y en la otra solucin B este mismo soluto tiene
una concentracin de 10 mmol, la probabilidad de que el soluto x en la solucin A choque
contra la membrana, y por la tanto pase al lado B es 5 veces mayor que del lado B este
mismo soluto pase al lado A. Por tanto la transferencia neta de soluto de una solucin A, a
la solucin B va a ser mayor mientras ms grande sea el gradiente de concentracin entre
las dos soluciones.

Peso molecular: cuanto mayor sea el peso molecular de un soluto, menor ser su tasa de
transporte a travs de una membrana semipermeable. Los motivos para esto se deben a la
velocidad y al tamao. La velocidad de una molcula en una solucin est inversamente
relacionada con el peso de la molcula. Por ejemplo, la velocidad de una molcula que
pesa 200 daltons ser menor que la de una molcula que solo pesa 100 daltons. Las
molculas pequeas se mueven a una velocidad elevada e impactan con gran frecuencia
con la membrana por lo que su transporte difusivo va a ser alto. Las molculas grandes,
aunque pudieran pasar fcilmente por los poros, van a difundir poco ya que al ir a una
velocidad ms lenta van a colisionar con menos frecuencia contra la membrana. El tamao
de una molcula se relaciona con su peso molecular. La membrana va a impedir parcial o
totalmente el paso a su travs de un soluto que sea de un tamao aproximado o mayor que
el del poro de la membrana.
Permeabilidad de la membrana: tamao de poros, densidad de poros, grosor de la
membrana
Resistencia de la membrana: la resistencia de la membrana al transporte de solutos ser
mayor si la membrana es gruesa, si el nmero de poros es pequeo o si los poros son
estrechos.

MATERIAL Y REACTIVOS
MATERIAL QUE DEBEN PROPORCIONAR LOS ALUMNOS
1 liga o trozo de parafina Hilo camo

MATERIAL POR EQUIPO MATERIAL POR GRUPO


1 vaso de precipitados de 250mL 1 vaso de precipitados 2000 mL
2 vaso de precipitados de 100mL 1 vaso de precipitados de 500mL
4 tubos de ensaye 15 x 2.5cm 20 celdas para espectrofotmetro
2 pipetas graduadas de 2mL 1 magneto grande
4 pipetas graduadas de 1mL 1 parrilla de calentamiento c/agitacin
2 pipetas pasteur 1 pipeta graduada de 2mL
2 matraces volumtricos de 100mL 3 pipeta graduada de 1mL
1 probeta de 100mL 5 vasos de precipitado de 100mL

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SEMESTRE 2018-1

1 propipeta 5 espectrofotmetro
1 gradilla 1 mechero bunsen
1 placa de porcelana 1 tripie
1 piseta 1 tela de asbesto
1 termmetro
5 bao mara

REACTIVOS
100 mL de almidn al 1% 100 mL de lugol 0.01M / en 2 frascos goteros
60 mL HCl 0.1M 6 L de agua destilada
10 tubos para dilisis de 10 cm de longitud Parafilm
100g Bicarbonato de sodio/ 100mL NaOH

METODOLOGA

I. Recoleccin de la muestra

1. Un voluntario se enjuaga perfectamente la boca y mastica un trozo de parafilm


2. Colecte una muestra de 10 mL de saliva.

II. Dilisis de una muestra de saliva

1. En un vaso de precipitados con agua destilada, hierva un segmento de tubo para


dilisis y cierre cuidadosamente por un extremo.
2. Coloque 2 mL de saliva en la bolsa y cierre el otro extremo.
3. Sumerja la bolsa en 1L de agua destilada y ponga en agitacin durante 60 min.
4. Cambie el agua cada 20 min.

III. Mtodo colorimtrico para la observacin de la actividad de amilasa salival.

1. Diluya una fraccin de saliva no dializada. Elija usted la dilucin (Se sugiere iniciar con
una dilucin 1:10).
2. Coloque en un tubo de ensaye 1 mL de sol. de almidn al 1% en agua.
3. Incube a 37C por 2 min.
4. Aada al tubo 1 mL de saliva diluda e incube a 37 C.
5. Tome, cada 30 seg una muestra de la mezcla de incubacin y colquela sobre una
cavidad de una placa de porcelana a la cual previamente se le ha depositado 2 gotas
de solucin de lugol.
6. Busque la dilucin adecuada para que el tiempo en que la enzima degrade el almidn
sea de entre 3 y 5 min.
7. Una vez obtenida la dilucin adecuada, repita la metodologa con una muestra de saliva
dializada a la misma dilucin (no pipetee el precipitado obtenido en el tubo de dilisis).
8. Compare sus resultados y concluya.

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SEMESTRE 2018-1

IV. Mtodo espectrofotomtrico para la cuantificacin -amilasa

1. Rotule dos tubos de ensaye como 1 (testigo) y 2 (problema).


2. Adicione a cada tubo 2 mL de almidn calentado previamente a 37 oC.
3. Agregue al tubo 2 (problema), 0.1 mL de saliva.
4. Incube los dos tubos en un bao a 37oC y deje actuar durante 30 minutos.
5. Mientras espera prepare dos matraces volumtricos de 100 mL y rotlelos como 1
(testigo) y 2 (problema).
6. Adicione a cada matraz 2 mL de HCl 1.0 N y 50 mL de agua destilada.
7. Transfiera el contenido de cada tubo al matraz respectivo y lave con agua destilada
cada uno de los tubos por lo menos cinco veces y vierta el agua de lavado al matraz.
8. Agregue al matraz No. 1, 0.1 mL de saliva.
9. Adicione a cada matraz 1 mL de solucin de lugol y homogenice perfectamente.
10. Lleve el volumen de cada matraz a 100 mL y deje reposar 15 minutos.
11. Lea la absorbancia de cada matraz en el espectrofotmetro a 580 nm y utilice agua
destilada como blanco para ajustar el aparato.
12. Para obtener las unidades de amilasa utilice la siguiente relacin:

. .
100 = 600
.

Nota: Investigue que significa unidades de amilasa para que pueda elaborar de manera
correcta su reporte.

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Observaciones y resultados

Mtodo colorimtrico para la observacin de la actividad de amilasa salival.

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Mtodo de colorimetra visual para la observacin de la actividad de amilasa salival.

Dilucin Tiempo (Saliva no dializada) Tiempo (Saliva dializada)

Mtodo espectrofotomtrico para la cuantificacin -amilasa

Absorbancia del testigo

Absorbancia del problema

En su reporte debe dar respuesta a las siguientes preguntas


1. Qu es la amilasa y qu reaccin cataliza?
2. Al hacer una dilisis qu le ocurre a la saliva?
3. La amilasa requiere de cofactores y/o activadores. Cul o cules son?
4. Por qu incuba a 37 oC?
5. Todas las salivas que contienen diferentes amilasas tienen la misma actividad a una
dilucin especfica? Por qu son diferentes?
6. Al hacer la reaccin con almidn y utilizando saliva dializada, Que observa?
7. A qu se debe esa diferencia de actividad?
8. Cul es el papel de?
8.1. Una coenzima

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SEMESTRE 2018-1

8.2. Un activador enzimtico.

MANEJO DE RESIDUOS

Los residuos generados en esta prctica sern manejados de acuerdo a las indicaciones
generadas en el apartado correspondiente de este manual: los cidos o bsicos se
neutralizan y se eliminan en las tarjas con suficiente agua; los solventes y mezclas de
reactivos se guardarn, en frascos perfectamente etiquetados que permita conocer en todo
momento que tipo de residuos son, quin los gener y en que prctica. Los desechos
slidos se colocan en bolsas y depositan en los cestos de basura. Si tiene dudas consulte
a su asesor.

BIBLIOGRAFA

1. Crockford. (1990). Fundamentos de Fisicoqumica. Mxico: Limusa Noriega.


2. Ganong, F. (2002). Fisiologa Mdica. (18a ed.) Mxico: Manual Moderno.
3. Rendina, G. (1974). Tcnicas de bioqumica Aplicada. Mxico: Interamericana.
4. Skoog, A.D., Holles, J. F., Nieman, A.T. (2001). Principios de Anlisis
Instrumental. (5 ed.) Espaa: Mc Graw Hill.
5. Stryer, L. (1996).Bioqumica . (4 ed.) Barcelona, Espaa: Editorial Revert.
6. Ynez, A. R. (1996). Manual de Prcticas de Bioqumica. Mxico: IPN.

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SEMESTRE 2018-1

PRCTICA 3
FERMENTACIN ALCOHLICA

OBJETIVOS

Realizar fermentacin alcohlica con levadura bajo diferentes condiciones, para relacionar
el tipo de metabolismo con la produccin de energa que se realiza en estos organismos.

CUESTIONARIO PREVIO

1. Qu es la respiracin aerbica? Explique


2. Qu es la respiracin anaerbica? Explique
3. Qu es la fermentacin? Cuntos tipos hay?
4. Qu organismo es Saccharomyces cerevisae? Qu tipo de carbohidratos puede
metabolizar?
5. Investiga las rutas metablicas que realiza Saccharomyces cerevisae
6. Explica con detalle la gluclisis. Incluye frmulas y enzimas que participan.
7. Cules son los posibles destinos metablicos del piruvato?
8. Qu regulacin presenta la gluclisis?
9. La taza de fermentacin se afecta con la temperatura?
10. Qu efecto provoca el NaF sobre la gluclisis? Afecta a alguna enzima en
especial? Cul y Cmo?

CONTENIDO

En esta prctica el alumno realiza la fermentacin alcohlica con levadura, comprueba la


desaparicin de glucosa con la prueba de Benedict, experimenta la fermentacin con
diferentes carbohidratos como sustratos: glucosa, fructosa, galactosa y sacarosa. Realiza
la fermentacin a dos temperaturas diferentes y prueba tambin el efecto que el NaF ejerce
sobre la ruta metablica.

INTRODUCCIN

De todos los organismos que habitan la tierra, solo unas cuantas especies son
estrictamente anaerbicos, es decir, que solamente pueden vivir en ausencia de oxgeno.
La mayora son microorganismos que habitan ambientes que tienen poco oxgeno o
carecen de l, como: el intestino de los animales, el suelo profundo, sedimentos de lagos y

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SEMESTRE 2018-1

ocanos o pantanos. Sin embargo, hay una gran cantidad de organismos que pueden vivir
en ausencia y presencia de oxgeno, entre ellos, se incluyen microorganismos, sino tambin
animales superiores y plantas. Incluso ciertos tejidos de nuestro organismo pueden
funcionar anaerbica o aerbicamente.

Las clulas que pueden vivir bajo ambas condiciones reciben el nombre de clulas
facultativas. Un aspecto muy significativo de ellas es que, cuando el oxgeno est ausente
de su medio ambiente, pueden extraer energa de la glucosa mediante el mismo tipo de
mecanismo de fermentacin anaerbica que utilizan las anaerbicas estrictas. Mientras que
en presencia de oxgeno prefieren oxidar completamente los alimentos hasta la formacin
de CO2, agua y energa, esto es, hacen oxidacin aerobia.

Los productos de fermentacin varan de un tipo de clula o microorganismo a otro. La


fermentacin alcohlica es un proceso anaerbico realizado por las levaduras y algunas
clases de bacterias. Estos microorganismos transforman el azcar en alcohol etlico y
dixido de carbono. La fermentacin alcohlica, inicia despus de que la glucosa entra en
la clula. La glucosa se degrada en cido pirvico. Este cido pirvico se convierte en
seguida en CO2 y etanol. Los seres humanos han aprovechado este proceso para la
fabricacin de pan, cerveza, y vino. El bixido de carbono crea la efervescencia en la
cerveza y hace que el pan suba dentro del horno. El etanol que se produce es el alcohol
presente en la cerveza y en los vinos. Para la elaboracin de estos tres productos se emplea
el mismo microorganismo: la levadura comn o Saccharomyces cerevisae.

Saccharomyces cerevisae.

Cuando se requiere contraccin repetida en el msculo esqueltico, por ejemplo, durante


el ejercicio fuerte y continuo, el suministro de oxgeno no puede mantener la demanda
metablica de las clulas y en este caso el piruvato producto de la glucolisis se convierte
en lactato. La acumulacin de cido lctico causa el dolor caracterstico cuando se ejercitan
los msculos excesivamente. La fermentacin lctica ocurre tambin en algunas bacterias

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gracias a este proceso se obtienen productos de origen lcteo tales como el yogurt, crema
agria y quesos.

MATERIAL Y REACTIVOS

MATERIAL QUE DEBEN PROPORCIONAR LOS ALUMNOS


1 paquete de levadura fresca

MATERIAL POR EQUIPO MATERIAL POR GRUPO


2 vasos de precipitado de 250 mL 5 balanzas granataria
4 vasos de precipitado de 100 mL 5 baos mara con gradilla
1 probeta de 100 mL 5 termmetros
4 pipeta graduada de 10 mL 1 vaso de precipitado de 600mL
2 pipetas graduada de 5 mL 2 vasos de precipitado de 100mL
6 pipetas graduada de 2 mL 5 vasos de precipitado de 50mL
2 pipetas graduada de 1 mL 3 pipetas graduada de 10mL
2 pipetas pasteur 2 pipetas graduada de 2mL
6 tubos de ensaye de 15 x 2.5 cm 3 pipeta volumtrica de 2mL
15 tubos de ensaye de 15 x 1.5 cm 10 propipetas
1 gradilla p/tubo de ensaye grande 2 frascos de residuos de 100mL
1 piseta Papel parafilm
1 esptula chica
3 varillas de vidrio
1 tripie
1 tela de asbesto
1 vaso de precipitados 600mL
1 mechero bunsen
2 pinzas para tubo de ensaye

REACTIVOS
400 mL de solucin de glucosa al 10 % 50 mL de solucin de sacarosa al 2 %
150 mL de solucin de glucosa al 2 % 80 mL de NaF al 0.01M
50 mL de solucin de galactosa al 2 % 100 mL Reactivo de Benedict
50 mL de solucin de fructosa al 2 % 1 galn de agua destilada

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METODOLOGA

Para esta metodologa es importante revisar la temperatura a la cual deben estar las
soluciones que se van a utilizar.

Preparacin de una suspensin de levadura al 10%

1. Pese 7g de levadura fresca


2. Agregue 70 mL de agua destilada
3. Agite con varilla de vidrio hasta que se disuelva la levadura
4. Coloque 10 mL de suspensin de levadura en un bao de hielo y los otros 60 mL
en un bao a 37C

II. Fermentacin de glucosa y demostracin con la prueba de Benedict

Prueba de Benedict:

1. Para comprobar la presencia de azucares reductores en la solucin de glucosa


al 2%, realice una prueba de Benedict. Mida 0.5 mL de la solucin problema +
Agregue 1 mL del reactivo de Benedict. Caliente en un bao de agua hirviendo
durante 3 minutos:

Prueba positiva : color rojo ladrillo Prueba negativa: color azul

2. Para verificar que la levadura no contiene ningn azcar reductor realice un


blanco de la siguiente manera: Mezcla 3 mL de levadura al 10% con 10 mL de
agua destilada. Efectu una prueba de Benedict tomando nicamente 0.5 mL de
esta disolucin.

Fermentacin de glucosa.

3. En un tubo de ensaye 15 x 2.5 cm, agregue 10 mL de una solucin de glucosa al


2%.
4. Agregue 3 mL de suspensin de levadura al 10% a 37C
5. Mezcle perfectamente hasta que la mezcla este homognea
6. Incube a 37C
7. Realice una prueba de Benedict con 0.5 mL de la mezcla a los 30, 60, 90 y 120
minutos de incubacin.
8. Registre sus resultados en la tabla 1

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III. Fermentacin con diferentes carbohidratos

1. Rotule cinco tubos de ensaye como: agua, glucosa, fructosa, sacarosa, galactosa
2. Adicione a cada uno lo siguiente:
Agua: 2 mL de agua destilada
Glucosa: 2 mL de glucosa al 2%
Fructosa: 2 mL de fructosa al 2 %
Sacarosa: 2 mL de sacarosa al 2%
Galactosa: 2 mL de galactosa al 2 %

3. Para cada uno de los tubos por separado y uno por uno:
4. Adicione 2 mL de suspensin de levadura y
Llene completamente una pipeta graduada de 2mL con la solucin del tubo que
corresponda y tape el extremo con un dedo, mientras sella el lado opuesto con un
trocito de parafilm. Utilizando una pipeta pasteur, contine el llenado de la pipeta
graduada hasta que la solucin llegue hasta antes de que se desborde.
Invierta la pipeta y colquela dentro del tubo de ensaye.
5. Inicie la toma del tiempo.
Observe cada 5 minutos, durante media hora y con ayuda de una regla anote el
volumen desplazado del lquido.
Registre sus datos en la tabla 2.

IV. Fermentacin a diferentes temperaturas

1. Prepare un bao de agua con hielo (0C) y un bao a 37C


2. Rotule dos tubos de ensaye de 15 x 1.5 cm como: A (0C) y B (37C)
3. Adicione a cada uno lo siguiente:
A: 7.5 mL de suspensin de levadura incubada 0C + 7.5 mL de glucosa al 10% +
7.5 mL de agua destilada fra.
B: 7.5 mL de suspensin de levadura a 37C + 7.5 mL de glucosa al 10% + 7.5 mL
de agua destilada a 37C.
4. Coloque sobre cada tubo un tubo de ensaye de 15 x 2.5 cm, invirtalos rpidamente
y ponga el tubo A en el bao de agua con hielo (0C) y el B en el bao a 37C.
5. Inicie la toma del tiempo.
Observe cada 5 minutos, durante media hora y con ayuda de una regla anote el
volumen desplazado del lquido.
Registre sus datos en la tabla 3.

V. Efecto del NaF sobre la fermentacin.

1. Rotule dos tubos de ensaye de 15 x 1.5 cm como: C (sin NaF) y D (con NaF)
2. Adicione a cada uno lo siguiente:
C: 7.5 mL de suspensin de levadura a 37C + 7.5 mL de glucosa al 10% + 7.5 mL
de agua destilada a a 37C.

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D: 7.5 mL de suspensin de levadura a 37C + 7.5 mL de glucosa al 10% + 7.5 mL


de solucin de NaF 0.01M a 37C
3. Coloque sobre cada tubo un tubo de ensaye de 15 x 2.5 cm, invirtalos rpidamente
y ponga los dos tubos en un bao a 37C.
4. Inicie la toma del tiempo.
Observe cada 5 minutos, durante media hora y con ayuda de una regla anote el
volumen desplazado del lquido.
Registre sus datos en la tabla 4.

OBSERVACIONES Y RESULTADOS

Tabla 1. Fermentacin de glucosa y demostracin con la prueba de Benedict

Muestra Prueba de Benedict

Glucosa

Levadura

30 min

60 min

90 min

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120 min

Tabla 2. Fermentacin con diferentes carbohidratos

Tiempo Agua Glucosa Fructosa Sacarosa Galactosa


(min)

10

15

20

25

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Tabla 3. Fermentacin a diferentes temperaturas

Tiempo (min) A (0C) Volumen desplazado A (37C) Volumen desplazado

10

15

20

25

30

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Tabla 4. Efecto del NaF sobre la fermentacin

Tiempo (min) C(sin NaF) Volumen desplazado D (con NaF) Volumen


desplazado

10

15

20

25

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Respuestas que debe considerar para la elaboracin de su reporte

Cul fue la produccin de CO2 (mL/30 min) para cada tubo?

Qu tipo de fermentacin ocurrio?

Puede la levadura metabolizar cada uno de los carbohidratos que se utilizaron? por
qu?

Qu sucedera si no se sella con parafilm el extremo superior de la pipeta?

Por qu hay diferencia en la fermentacin de los carbohidratos usados?

Se realiza la fermentacin a las dos temperaturas de ensayo?

Qu efecto provoca sobre la fermentacin el NaF?

MANEJO DE RESIDUOS

Los residuos generados en esta prctica sern manejados de acuerdo a las indicaciones
generadas en el apartado correspondiente de este manual: los cidos o bsicos se
neutralizan y se eliminan en las tarjas con suficiente agua; los solventes y mezclas de
reactivos se guardarn, en frascos perfectamente etiquetados que permita conocer en todo
momento que tipo de residuos son, quin los gener y en que prctica. Los desechos
slidos se colocan en bolsas y depositan en los cestos de basura. Si tiene dudas consulte
a su asesor.

BIBLIOGRAFA

1. Alberts, B., Dennis B., Lewis J.; Raff M.; Roberts K.; Watson J. (2000). Biologa
Molecular de la Clula. (4 ed.) Barcelona, Espaa: Editoral Omega.
2. Nelson, D.L. y Cox, M.M. (2000). Principios de Bioqumica de Lehninger. (3 ed.)
Barcelona, Espaa: Omega.

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SEMESTRE 2018-1

3. Stryer, L. (1996). Bioqumica. (4 ed.) Barcelona, Espaa: De Revert.


4. Ynez, A. R. (1996). Manual de Prcticas de Bioqumica. Mxico: IPN.

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PRCTICA 4

EXTRACCIN DE GLUCGENO DE HGADO DE RATN

OBJETIVOS

1. Inducir la sntesis de glucgeno por medio de una dieta rica en carbohidratos para
extraerlo en hgado de ratn.
2. Conocer las rutas metablicas implicadas en la sntesis y degradacin del glucgeno.
3. Realizar el sacrificio de los animales de experimentacin y su diseccin posterior
para obtener el rgano que se va a trabajar.

CUESTIONARIO PREVIO

1. Cul es la importancia del uso de animales de experimentacin?


2. Cules son las formas de sacrificar a un ratn?
3. Cmo se realiza la diseccin de un ratn?
4. Qu es el glucgeno y cul es su estructura?
5. Cul es la va metablica de sntesis del glucgeno?. Explique ampliamente e
incluya las enzimas que participan.
6. Cul es la va metablica de degradacin del glucgeno?. Explique ampliamente e
incluya las enzimas que participan.
7. Explique ampliamente la gluconeognesis e indique que significa.
8. Explique la regulacin energtica de la sntesis y degradacin del glucgeno.
9. Explique la regulacin hormonal de la sntesis y degradacin del glucgeno

CONTENIDO

En esta prctica se manejan como mnimo 3 ratones; de las cuales 2 se someten a dieta
rica en carbohidratos por un periodo mnimo de 15 das, el tercero sirve como control y
recibe una dieta normal.
Se sacrifican los tres animales por dislocacin cervical. De los de dieta rica en
carbohidratos, a uno se le somete durante un mnimo de 15 minutos a estrs y despus se
sacrifica. Se realiza la diseccin, se extrae el hgado y se pesa. Despus se realiza la
tcnica de extraccin de glucgeno y por ltimo se identifica mediante la reaccin con yodo.
El alumno realiza una investigacin completa de las rutas metablicas implicadas en la
sntesis y degradacin del glucgeno.

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GENERALIDADES

En animales, el glucgeno es la forma principal de almacenamiento de los carbohidratos.


Se presenta sobre todo en hgado (hasta 8 %) y en msculo donde raras veces excede el
1%. Sin embargo, debido a la gran masa muscular de los animales, el glucgeno del
msculo, representa de 3 a 4 veces la reserva heptica. El glucgeno es un polmero de
glucosa con una estructura mucho ms ramificada que la amilopectina del almidn,
presenta cadenas de 12 a 14 residuos de alfa D - glucopiranosa, con enlaces glucosdicos
alfa -D[1 - 4] y ramificaciones unidas por enlaces glucosdicos alfa [1 - 6].

El glucgeno muscular funciona como fuente de fcil disponibilidad de unidades de hexosa


para la gluclisis dentro del propio msculo. El glucgeno heptico sirve en gran medida
para exportar unidades de hexosa para la conservacin de la glucosa sangunea, en
particular entre comidas. Despus de un ayuno de 12 a 18 horas, el hgado casi agota sus
reservas de glucgeno. Por su parte el glucgeno muscular slo disminuye de manera
significativa despus de un ejercicio vigoroso prolongado.

El glucgeno se sintetiza por medio de glucognesis a partir de glucosa y otros


precursores., ocurre en todos los tejidos, pero es ms activa en msculo y en hgado. La
glucogenlisis es la degradacin de glucgeno a glucosa; la degradacin se realiza tanto
en el hgado como en el msculo por la enzima glucogeno-fosforilasa , que es la enzima
que cataliza la fosforolisis de los enlaces alfa [1 - 4] glucosdicos del glucgeno liberando
glucosa 1P, las fosforilasas del hgado y del msculo son semejantes; son alostricas y
requieren de fosfato de piridoxal (vitamina B6), las dos enzimas presentan una
interconversin entre la forma fosforilada activa y la forma desfosforilada inactiva. La
adrenalina activa a las dos fosforilasas, en su efecto interviene el AMPc, la insulina tiene
un efecto depresivo en la degrdacin del glucgeno, el glucagn tiene efecto estimulante al
igual que la adrenalina.

La regulacin de la sntesis de glucgeno y su utilizacin est vinculada en los mecanismos


reguladores de la gluclisis y del ciclo de Krebs. As un exceso de glucosa, se refleja por
una elevada concentracin de glucosa-6-fosfato, o un abundante suministro de otros
combustibles que se refleja en una gran carga energtica, tiende a hacer funcionar a la
glucgeno sintetasa (para la glucogensis) y desconectar la glucgeno fosforilasa (para la
glucogenlisis) con lo que se producir un almacenamiento de glucosa en forma de
glucgeno en hgado y msculo. Cuando hacen falta combustibles por que la carga
energtica es baja, como ocurre en el trabajo muscular intenso o cuando el nivel de glucosa
sangunea es bajo, se estimula la glucgeno fosforilasa y se inhibe la glucgeno sintetasa
y el glucgeno heptico se degrada para rendir glucosa sangunea y el glucgeno muscular
produce glucosa-6-P.

La regulacin en el metabolismo del glucgeno se basa en el equilibrio de la actividad entre


la glucgeno sintetasa y la fosforilasa, las cuales estn bajo control del sustrato por medios
alostricos y desde luego bajo control hormonal. As la fosforilasa no slo se activa cuando
hay elevacin de AMPc por accin de la fosforilasa-cinasa sino que, la glucgeno sintetasa

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es convertida a su forma inactiva y estos efectos estn mediados por protein-cinasas que
depende del AMPc. Al inhibirse la glucogenolisis se incrementa la glucognesis y si se
inhibe la glucognesis aumenta la glucogenlisis. La concentracin de la fosforilasa a, es
el factor ms importante en el control del metabolismo del glucgeno en el hgado ya que
esta enzima no slo controla el paso limitante de la velocidad en la glucogenlisis, tambin
inhibe la actividad de la protein-fosfatasa 1 y en esta forma controla la sntesis de
glucgeno.

La enfermedades por almacenamiento de glucgeno son un grupo de trastornos


hereditarios caracterizados por la deficiente movilizacin de glucgeno o por la deposicin
de formas de glucgeno anormales, originado debilidad muscular e incluso la muerte.

MATERIAL Y REACTIVOS

MATERIAL QUE DEBEN PROPORCIONAR LOS ALUMNOS

Navaja para bistur 1 Jaula por equipo con bebederos


Tabla de madera para diseccin Peridico y/o papel estraza

MATERIAL POR EQUIPO MATERIAL POR GRUPO

1 vaso de precipitados 250 ml 10 vasos de precipitado de plstico


1 vaso de precipitados de 100 ml 1 mechero
4 tubos de ensaye para centrifuga 1 tripie
4 tubos de ensaye de 15 x 1.5 cm 1 tela de asbesto
1 pipeta graduada de 5 ml 2 frascos para residuos de 100 ml
1 pipeta graduada de 2 ml pliego de papel filtro
1 pipeta graduada de 1 ml 5 centrifugas
1 propipeta 5 balanza granataria de 2 platos
estuche de diseccin (mango p/bistur, 2 balanzas electrnicas
tijeras, pinzas de diseccin)
1 gradilla 1 vaso de precipitado de 250mL
1 mortero chico con pistilo 4 vasos de precipitado de 50mL
2 vidrio de reloj 2 vasos de precipitado de 100mL
2 varilla de vidrio 1 pipeta graduada de 10mL
1 piseta 1 pipeta graduada de 5mL
1 placa de porcelana 1 pipeta graduada de 2mL
2 pinzas p/ tubo de ensaye 1 pipeta graduada de 1mL
1 placa de porcelana 1 vortex

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REACTIVOS

100 mL etanol de 96o 60 mL etanol absoluto


50 mL cido tricloroactico al 10% 3 g NaCl (cristales)
20 mL solucin de lugol 40 mL reactivo de molish
40 mL cido sulfrico 4 L agua destilada
100mL cloroformo

METODOLOGA

1. Se alimentan dos ratones durante 2 semanas con alimento rico en


carbohidratos (10% almidn y 5% sacarosa) y se les da a beber una solucin al 5 % de
glucosa. Se debe disponer de un animal control el cual se somete a una dieta normal.
2. Un ratn con dieta normal y otro con dieta rica en carbohidratos se sacrifican, mediante
sobredosis de cloroformo, de acuerdo a las indicaciones de su asesor. Se realiza la
diseccin del animal, se extrae el hgado, lo ms rpido posible. El tercer ratn se somete
a estrs por un periodo mnimo de 15 minutos y posteriormente se sacrifica de la misma
forma que los otros.
3. Se seca el hgado con una tela o toalla de papel y se coloca sobre hielo molido.
4. Una vez fro el hgado, se pesa lo ms exacto posible y se anota el peso.
5. Corte el hgado en trozos pequeos y colquelo en un mortero previamente enfriado que
contenga 1 ml de cido tricloroactico al 10 % (fro) por cada gramo de peso del tejido.
6. Moler el tejido con mucho cuidado hasta obtener una pasta totalmente homognea.
7. Transfiera cuidadosamente el homogenizado a tubos de centrifuga (previamente
enfriados). Lave el mortero con la mnima cantidad de cido tricloroactico al 10 % (fro).
8. Equilibre los tubos de centrfuga con las camisas que deben estar fras tambin
9. Centrifugue a 2500 rpm durante 10 minutos.
10. El sobrenadante se decanta en otro tubo previamente pesado y la pastilla se desecha.
11. Agregue lentamente dos volmenes de alcohol etlico (96%) al extracto de cido
tricloroactico, agitando constantemente.
12. Deje reposar la mezcla hasta que observe un precipitado. (Si no hay precipitado
agregue un poco de cloruro de sodio en cristales y caliente ligeramente el recipiente).
13. Centrifugue a 2500 rpm durante 5 minutos.
14. Deseche el sobrenadante y lave el precipitado con 2 ml de alcohol etlico al 96 % y agite
fuerte.
15. Elimine el sobrenadante y repita el lavado con 3 ml de alcohol absoluto y vuelva a
centrifugar.
16. Si el precipitado no es blanco repita el lavado.
17. Deje secar el precipitado, pese el tubo nuevamente y anote sus resultados.
18. Calcule el rendimiento del glucgeno con base al peso hmedo del tejido de cada
animal.
19. Analice los resultados de todos los ratones y concluya.

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SEMESTRE 2018-1

OBSERVACIONES Y RESULTADOS

Peso del Hgado Peso del % de glucgeno


glucgeno
Ratn con dieta rica en
carbohidratos
Sacrificado sin estrs (1)

Ratn con dieta rica en


carbohidratos
Sacrificado con estrs (2)

Ratn con dieta normal


Sacrificado sin estrs
(1)

Ratn con dieta normal


Sacrificado con estrs
(2)

En su reporte debe dar respuesta a las siguientes preguntas


1. Por qu es necesario enfriar el hgado y los reactivos en las primeras etapas de
separacin y purificacin?
2. Por qu se eligi el hgado para extraer el glucgeno y no otro rgano o tejido?
3. Compare y discuta los resultados obtenidos en cada ratn.

MANEJO DE RESIDUOS

Los residuos generados en esta prctica sern manejados de acuerdo a las indicaciones
generadas en el apartado correspondiente de este manual: los cidos o bsicos se
neutralizan y se eliminan en las tarjas con suficiente agua; los solventes y mezclas de
reactivos se guardarn, en frascos perfectamente etiquetados que permita conocer en todo
momento que tipo de residuos son, quin los gener y en que prctica. Los desechos
slidos se colocan en bolsas y depositan en los cestos de basura. Si tiene dudas consulte
a su asesor.

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SEMESTRE 2018-1

BIBLIOGRAFA

5. Alberts,B., Dennis B., Lewis J.; Raff M.; Roberts K.; Watson J. (2000). Biologa
Molecular de la Clula. (4 ed.) Barcelona, Espaa: Editorial Omega.
6. Nelson, D.L. y Cox, M.M. (2000). Principios de Bioqumica de Lehninger. (3 ed.)
Barcelona, Espaa: Omega.
7. Hill, R. (1937). Oxygen envolved by isolated chloroplasts. Nature 139: 881.
8. Rendina, G. (1974). Tcnicas de bioqumica Aplicada. Mxico: Interamericana.
9. Stryer, L. (1996). Bioqumica. (4 ed.) Barcelona, Espaa: De Revert.
10. Ynez, A. R. (1996). Manual de Prcticas de Bioqumica. Mxico: IPN.

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SEMESTRE 2018-1

PRCTICA 5
FOTOSNTESIS
AISLAMIENTO DE CLOROPLASTOS Y REACCION DE HILL

OBJETIVO

Realizar el aislamiento de cloroplastos de hojas de espinaca mediante una tcnica de


fraccionamiento celular para aprender algunos principios fundamentales de la
fotosntesis as como demostrar la capacidad reductora de los cloroplastos aislados: la
reaccin de Hill.

CUESTIONARIO PREVIO

1. Cules son los componentes estructurales del cloroplasto?


2. Cules son los componentes qumicos de cada parte del cloroplasto?
3. Qu pigmentos estn presentes en las membranas tilacoides y qu
caractersticas de absorcin tienen?
4. Qu es la fotosntesis y cules son sus fases?
5. Qu son y como estn estructurados los fotosistemas I y II?
6. Cul es el fundamento de la prctica?.Nota busque la reaccin de Hill

CONTENIDO

En esta prctica el alumno realiza el aislamiento de cloroplastos de hojas de espinaca. Se


asegura de trabajar siempre a temperaturas fras para preservar la actividad de los
cloroplastos. Posteriormente con el uso de un colorante de xido reduccin demuestra la
capacidad reductora de los cloroplastos a diferentes condiciones de longitud de onda,
tiempo y oscuridad.

GENERALIDADES

Los cloroplastos son estructuras subcelulares que se encuentran en las algas


eucariotas y en las clulas del tejido fotosintetizador de las plantas
superiores; pertenecen a un grupo de organelos citoplasmticos denominados plstidos,
contienen entre otros, un pigmento verde: la clorofila. La fotosntesis es el proceso a travs
del cual algunos organismos captan y transforman la radiacin luminosa del sol, en

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compuestos de alto poder reductor o elevado energa qumica de enlace; esos productos
se utilizan posteriormente para la reduccin y transformacin del CO 2 a carbohidratos.
La vida en la tierra depende de la energa que suministra la luz solar, pero las clulas no
pueden emplear o almacenar la energa luminosa directamente, sino que tienen que
convertirla en energa qumica. Los electrones son moneda de uso comn en la
conversin de energa en los sistemas biolgicos: muchas de las reacciones energticas
de la clula se explican en trminos de transferencia de electrones entre molculas. Por
tanto, las clulas necesitan para vivir una fuente de electrones. Hace aproximadamente tres
mil millones de aos, algunas clulas fotosintticas aprendieron a prosperar casi en
cualquier tipo de entorno natural; sacaron electrones de una sustancia simple: el agua.
Estas clulas desarrollaron la facultad de disociar pares de molculas de agua en
electrones, protones y oxgeno molecular. Los protones y electrones resultaron
energticamente muy tiles; el oxgeno era simplemente un producto de desecho. La
fotosntesis produce todo el oxgeno de la atmsfera y se realiza en los cloroplastos.

La fotosntesis, es el proceso que transforma la luz solar en la energa que precisan las
funciones vitales de los organismos. Es sin duda, el proceso bioqumico ms importante de
la Biosfera por varios motivos:

La sntesis de materia orgnica a partir de la inorgnica se realiza principalmente


mediante la fotosntesis.
Produce la transformacin de la energa luminosa en energa qumica, necesaria y
utilizada por los seres vivos.
Libera oxgeno, que ser utilizado en la respiracin aerbica como oxidante.
Fue causante del cambio producido en la atmsfera primitiva, que era anaerobia y
reductora10.
De l depende tambin la energa almacenada en combustibles fsiles como carbn,
petrleo y gas natural.
Mantiene el equilibrio necesario entre seres auttrofos y hetertrofos.

Se puede concluir que la diversidad de la vida existente en la Tierra, depende


principalmente de la fotosntesis.

1. Etapas de la fotosntesis: En la fotosntesis se


diferencian dos fases o etapas: La luminosa y la
obscura.

Fase luminosa: se realiza en el tilacoide, en ella


se producen transferencias de electrones, se
produce oxgeno.

Fase oscura: se lleva a cabo en el estroma, en


ella se realiza la fijacin de carbono, se producen
carbohidratos.

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Fig. Visin global de la fotosntesis. Fase luminosa y Fase oscura

Los eventos de la fase luminosa, se pueden resumir en los siguientes puntos:


a) Sntesis de ATP o fotofosforilacin que puede ser: acclica o cclica.
b) Sntesis de poder reductor en forma de NADPH+.
c) Fotolisis del agua.

Descripcin de eventos de la fase luminosa

Cuando un pigmento absorbe energa, uno de tres cosas puede ocurrir: la energa es
disipada como calor; la energa puede emitirse inmediatamente como una longitud de onda
ms larga (fluorescencia) o la energa puede activar una reaccin qumica, como el caso
de la fotosntesis.

La captacin de energa radiante la realiza el cloroplasto a travs de las antenas y los CCL.
En el proceso dos fotoreacciones operan en serie para elevar electrones desde el agua, un
donador con alto potencial redox, al aceptor final NADP +, de bajo potencial redox, una y
otra reaccin se desarrollan en los fotosistemas I y II. La captacin fotnica por ambos
fotosistemas, viene facilitada y canalizada va los correspondientes CCL, e induce un
estado exitado en los centros P-700 y P-680; que ceden inmediatamente un electrn a los
aceptores primarios respectivos: un componente para el fotosistema I, y una feofitina para
el fotosistema II. A consecuencia de ello aparecen los radicales catinicos P-700+ y P-680+
, que, por su elevado potencial redox, son inmediatamente reducidos por los donadores
primarios de ambos fotosistemas, ese electrn es recogido por una sustancia aceptora de
electrones que se reduce: la Plastoquinona (PQ) y desde sta va pasando a lo largo de una
cadena transportadora de electrones, entre los que estn varios citocromos (cyt b/f) y as
llega hasta la plastocianina (PC), que se los ceder a molculas de clorofila del FSI. A su
vez, la plastocianina se ver reducida por el flujo electrnico procedente del fotosistema II,
mientras que un complejo enzimtico dependiente de manganeso, tras acumular cuatro
cargas positivas a consecuencia de cuatro fotoactos sucesivos en P-700, recupera su
situacin basal mediante los cuatro electrones que proceden de la escisin o ruptura de
dos molculas de agua, con desprendimiento simultneo de oxgeno el proceso se llama
fotlisis del H2O. De este modo se puede mantener un flujo continuo de electrones desde
el agua hacia el fotosistema II y de ste al fotosistema I. Finalmente, el flujo de electrones
procedentes del fotosistema I suministra los equivalentes de reduccin necesarios para la
sntesis del potencial reductor generado en la fotosntesis; el NADP+ por de dos electrones
y un in hidrogeno.

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Fig. Flujo electrnico durante la fotosntesis en la membrana tilacoide.

En el descenso por esta cadena, con oxidacin y reduccin en cada paso, el electrn va
liberando la energa que tena en exceso; energa que se utiliza para bombear protones de
hidrgeno desde el estroma hasta el interior de los tilacoides, generando un gradiente
electroqumico de protones. Estos protones vuelven al estroma a travs de la ATP-asa y se
originan molculas de ATP.
La sntesis de ATP en el cloroplasto se explica mediante la hiptesis quimiosmtica de
Mitchell, de forma muy semejante a como ocurre en la mitocondria. El transporte de
electrones en la cadena transportadora de la membrana tilacoidal produce el bombeo de
protones desde el estroma hacia el espacio tilacoidal a nivel del complejo citocromo b6-f,
lo que genera un gradiente electroqumico. El flujo de protones a favor del gradiente desde
el espacio tilacoidal hasta el estroma, a travs del canal de protones de la ATP sintasa,
activa la sntesis de ATP a partir de ADP y fosfato. Los electrones se emplean para reducir
el NADP+ a NADPH. El ATP y el NADPH* producidos de esta forma pueden utilizarse en
la fase oscura.

Los dos fotosistemas pueden actuar conjuntamente proceso conocido como esquema en
Z, para producir la fotofosforilacin (obtencin de ATP) o hacerlo solamente el fotosistema
I; se diferencia entonces entre fosforilacin no cclica o acclica cuando actan los dos, y
fotofosforilacin cclica, cuando acta el fotosistema I nicamente. En la fotofosforilacin
acclica se obtiene ATP y se reduce el NADP+ a NADPH, mientras que en la
fotofosforilacin cclica nicamente se obtiene ATP y no se libera oxgeno.

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Mientras la luz llega a los fotosistemas, se mantiene un flujo de electrones desde el agua al
fotosistema II, de ste al fotosistema I, hasta llegar el NADP+ que los recoge; sta pequea
corriente elctrica es la que mantiene el ciclo de la vida.

Fig. Flujo de electrones cclico y no


cclico

Fase obscura:
En esta fase, se va a utilizar la energa qumica obtenida en la fase luminosa, en reducir
CO2, Nitratos y Sulfatos y asimilar los elementos C, H, y S, con el fin de sintetizar
carbohidratos, aminocidos y otras sustancias.
Descripcin de eventos de la fase obscura.
Las plantas obtiene el CO2 del aire a travs de los estomas de sus hojas. El proceso de
reduccin del carbono es cclico y se conoce como Ciclo de Calvin, en honor de su
descubridor M. Calvin.

La fijacin del CO2 se produce en tres fases:

1. Carboxilativa: El CO2 se fija a una molcula de 5C, la ribulosa 1,5 difosfato,


formndose un compuesto inestable de 6C, que se divide en dos molculas de
cido 3 fosfoglicrico conocido tambin con las siglas de PGA.
2. Reductiva: El cido 3 fosfoglicrico se reduce a gliceraldehido-3-fosfato, tambin
conocido como PGAL, utilizando ATP y NADPH+.
3. Regenerativa/Sinttica: Las molculas de gliceraldehido-3-fosfato formadas siguen
diversas rutas; de cada seis molculas, cinco se utilizan para regenerar la ribulosa
1,5 difosfato y hacer que el ciclo de Calvin pueda seguir, y una ser empleada para
poder sintetizar molculas de glucosa (va de las hexosas), cidos grasos,
aminocidos, etc; y en general todas las molculas que necesita la clula.

En el ciclo para fijar el CO2, intervienen una serie de enzimas, y la ms conocida es la


enzima Rubisco (ribulosa 1,5 difosfato carboxilasa/oxidasa), que puede actuar como
carboxilasa o como oxidasa, segn la concentracin de CO2.
Si la concentracin de CO2 es baja, funciona como oxidasa, y en lugar de ayudar a la fijacin
de CO2 mediante el ciclo de Calvin, se produce la oxidacin de carbohidratos hasta CO 2 y
H2O, y al proceso se le conoce como fotorrespiracin. La fotorrespiracin no debe
confundirse con la respiracin mitocondrial, la energa se pierde y no se produce ni ATP ni
NADPH + H+; y se disminuye el rendimiento de la fotosntesis, porque slo se produce una
molcula de PGA que pasar al ciclo de Calvin; en cambio cuando funciona como
carboxilasa, se obtienen dos molculas de PGA.

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Fig. Esquema simplificado del Ciclo de Calvin.


En la mayor parte de los vegetales pluricelulares, todas las clulas que poseen cloroplastos
tienen las mismas actividades fotosintticas; incorporan en presencia de luz el anhdrido
carbnico dando molculas de tres tomos de carbono. En ciertas plantas superiores, la
mayora de las cuales vivien en regiones clidas y ridas, los primeros productos de la
incorporacin del CO2 no son molculas de 3C, sino cidos dicarboxlicos de 4C; esta
plantas son las llamadas C4. Las clulas fotosintticas de las plantas C4, son de dos tipos:
unas incorporan el CO2 del aire formando cidos dicarboxlicos, las otras descarboxilan
estos cidos e incorporan el CO2 en la ribulosa 1,5 difosfato. El desarrollo de la fotosntesis
en las plantas C4 requiere de intercambio entre dos tipos de clulas cuyas funciones estn
diferenciadas y son complementarias y este intercambio est favorecido por la organizacin
anatmica de las hojas en estos organismos. En las plantas C4, las clulas cloroflicas estn
dispuestas en dos capas concntricas alrededor de los haces de las clulas conductoras
de la savia; una capa interna o vaina perivascular y una capa externa o capa del mesfilo,
con excepcin de las clulas de los estomas, las otras clulas de la hoja no tienen
cloroplastos funcionales; en las plantas C3, todas las clulas del parenquima foliar son
cloroflicas.

(a) (b)

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Anatoma foliar de las plantas (a) C3 y (b) C4.

MATERIAL Y REACTIVOS

MATERIAL QUE DEBEN PROPORCIONAR LOS ALUMNOS

1 rollo de espinacas frescas Papel aluminio


25 mL de aceite vegetal 3 lmparas con focos de color rojo, azul y verde

MATERIAL POR EQUIPO MATERIAL POR GRUPO

1 vaso de precipitados de 500 mL 10 vasos de precipitado de plstico


2 vaso de precipitados de 100 mL 20 celdas para espectrofotmetro
10 tubos de ensaye 15 x 2.5cm 1 frasco para residuos de 500 mL
6 tubos para centrifuga 5 centrifugas
2 pipeta graduada 10 mL 5 balanza granataria de 2 platos
1 pipeta graduada de 5 mL 5 espectrofotmetros
1 pipeta graduada de 1 mL 1 gradilla
1 pipeta pasteur 1 balanza electrnica
1 propipeta 2 pipetas graduada de 10mL
1 piseta 1 pipeta graduada de 5mL
1 mortero chico con pistilo 3 vasos de precipitado de 50mL
1 gradilla
1 mechero bunsen
1 tripie
1 tela de asbesto
1 termmetro

REACTIVOS

150mL buffer fosfatos 0.02 M pH 8.0 150mL NaCl 0.35 M


450mL 2,6 diclorofenolindofenol 2x 10 5 6L agua destilada
M

METODOLOGA

1.- OBTENCION DE CLOROPLASTOS A PARTIR DE HOJAS DE ESPINACA

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Las tcnicas de aislamiento de cloroplastos no son muy sencillas; sin embargo, pueden
utilizarse tcnicas aproximadas, que permiten mantener algo de la actividad de los
cloroplastos. Para poder preservar la actividad debe asegurarse de trabajar siempre a
temperaturas fras, incluyendo las soluciones y la cristalera.
1. Mantener los extractos y los reactivos en hielo.
2. Pese 3 g de hojas de espinacas frescas y lavadas; crtelas (descartando las venas
grandes)
3. Macerar las hojas en un mortero con 15 ml de una mezcla (2:1) de una solucin
buffer de fosfatos 0.02 M pH 8.0 y una solucin de NaCl 0.35 M.
4. Centrifugue el filtrado por 2 minutos a 1500 rpm.
5. Centrifugue el sobrenadante a velocidad mxima durante 10 minutos.
6. Resuspender la pastilla en 7 ml de solucin de NaCl 0.35 M.
7. Durante todas las manipulaciones, asegrese de que el envase que contenga los
cloroplastos est sumergido en hielo.

2. MEDICION DE LA ACTIVIDAD FOTOSINTTICA: REACCIN DE HILL

En esta parte de la prctica el DCPIP (2,6-diclorofenolindofenol), que es un colorante redox


que en su forma oxidada presenta color azul y en su forma reducida pierde color, se utilizar
para demostrar la capacidad reductora de los cloroplastos. El objetivo es observar el
transporte electrnico de la fase luminosa, mediante la reduccin de un colorante que
realizar la aceptacin de los electrones en lugar del NADPH.
1. Preparar una serie de tubos, perfectamente rotulados y agregar a cada uno 5 ml de
la solucin de Diclorofenolindofenol 2x 10 5 M.
2. Leer en un espectrofotmetro a X nm la absorbancia de la solucin en el tubo 1.
Nota: Investigar la longitud de onda de mxima absorcin del colorante.
3. Agregar al tubo 2, 0.5 ml de la suspensin de cloroplastos y agitar. Leer la
absorbancia del tubo 2 a las mismas condiciones indicadas en el punto anterior.
4. Agregar al tubo 3, 0.5 ml de la suspensin de cloroplastos, agitar y colocarle una
capa delgada de aceite vegetal y exponer el tubo a la luz solar durante 30 minutos.
Enseguida leer la intensidad de color. Volver a exponerlo a la luz solar por 30 minutos
y nuevamente leer la absorbancia.
5. Agregar al tubo 4, 0.5 ml de la suspensin de cloroplastos, agitar, colocar una capa
de aceite vegetal y exponer durante 30 minutos a luz roja. Transcurridos los 30
minutos leer la absorbancia.
6. Agregar al tubo 5, 0.5 ml de la suspensin de cloroplastos, agitar, colocar una capa
de aceite vegetal y exponer durante 30 minutos a luz azul. Transcurridos los 30
minutos leer la absorbancia.
7. Agregar al tubo 6, 0.5 ml de la suspensin de cloroplastos, agitar, colocar una capa
de aceite vegetal y exponer durante 30 minutos a luz verde. Transcurridos los 30
minutos leer la absorbancia.
8. Aadir al tubo 7, 0.5 ml de la suspensin de cloroplastos previamente hervidos,
durante 5 minutos y seguir la metodologa utilizada para el tubo 3.
9. Aadir al tubo 8, 0.5 ml de la suspensin de cloroplastos, cbralo con papel aluminio
durante 30 minutos. Transcurridos los 30 minutos leer la absorbancia.

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SEMESTRE 2018-1

OBSERVACIONES Y RESULTADOS

Tubo Observaciones
Absorbancia
No.

Analice cuidadosamente los resultados, busque soporte bibliogrfico y concluya.


1. La capacidad reductora de los cloroplastos es dependiente de la luz?
2. En qu medida influye la longitud de onda (color de la luz) sobre la capacidad
reductora de la suspensin de cloroplastos?
3. Cmo afecta la oscuridad sobre la capacidad reductora de la suspensin de
cloroplastos?

MANEJO DE RESIDUOS

Los residuos generados en esta prctica sern manejados de acuerdo a las indicaciones
generadas en el apartado correspondiente de este manual: los cidos o bsicos se
neutralizan y se eliminan en las tarjas con suficiente agua; los solventes y mezclas de
reactivos se guardarn, en frascos perfectamente etiquetados que permita conocer en todo
momento que tipo de residuos son, quin los gener y en que prctica. Los desechos

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SEMESTRE 2018-1

slidos se colocan en bolsas y depositan en los cestos de basura. Si tiene dudas consulte
a su asesor.

BIBLIOGRAFA

1. Alberts, B., Dennis B., Lewis J.; Raff M.; Roberts K.; Watson J. (2000). Biologa
Molecular de la Clula. (4 ed.) Barcelona, Espaa: Editorial Omega.
2. Nelson, D.L. y Cox, M.M. (2000). Principios de Bioqumica de Lehninger. (3 ed.)
Barcelona, Espaa: Omega.
3. Barn, M., Chueca, A. y Lopez, J. (1986). Inhibicin de la fotosntesis por herbicidas.
Investigacin y Ciencia, 175: 10-17.
4. Coleman, G., Coleman, M.I. (1990). How plants make oxygen. Scientific American, 262
(2): 50-8.
5. Hill, R. (1937). Oxygen envolved by isolated chloroplasts. Nature 139: 881.
6. Stryer, L. (1996). Bioqumica. (4 ed.) Barcelona, Espaa: De Revert.
7. Youvan, D. Y Marrs, B. (1988). Mecanismo molecular de la fotosntesis. Investigacin y
Ciencia, 179: 34-41

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SEMESTRE 2018-1

PRCTICA 6
CUANTIFICACION DE COLESTEROL EN SUERO SANGUNEO

OBJETIVO

1. Investigar y practicar la toma correcta de muestras sanguneas y el tratamiento que


debe hacerse para obtener el suero.
2. Realizar la cuantificacin de colesterol en el suero, a travs de un mtodo
colorimtrico.
3. Conocer los niveles normales de colesterol sanguneo y reconocer la importancia
metablica y fisiolgica de este esteroide.

CUESTIONARIO PREVIO

1. Qu es el colesterol y cul es su estructura y propiedades?


2. Cul es la importancia del colesterol?
3. Haga un diagrama general de la ruta de sntesis del colesterol. Indique frmulas, nombre
de intermediarios y enzimas participantes.
4. Cules son los niveles normales de colesterol en sangre de acuerdo con la edad.
5. Cul es la forma correcta de tomar una muestra sangunea?
6. Qu tratamiento se debe hacer a una muestra sangunea para obtener el suero?
7. Investigue el fundamento de la tcnica de determinacin de colesterol que va ud. a utilizar
en el laboratorio.
8. Qu enfermedades estn ligadas a los niveles de colesterol en sangre?

CONTENIDO

Los alumnos investigan y practican la forma correcta de obtener una muestra sangunea y
el tratamiento a seguir para obtener el suero sin provocar hemlisis. Realizan una tcnica
espectrofotomtrica y realizan una curva patrn para conocer el nivel de colesterol de su
muestra problema. Investigan tambin los niveles normales de colesterol y la importancia
metablica y fisiolgica de este esterol.

GENERALIDADES

El colesterol es un compuesto alicclico, se clasifica como lpido y pertenece al grupo de


los esteroides. Tiene como estructura bsica al ciclopentano perhidrofenantreno, presenta
adems dos grupos mtilo, un OH, una doble ligadura y una cadana lateral en el carbono
17. Es un compuesto importante para las clulas del organismo y componente esencial de

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SEMESTRE 2018-1

los lquidos que constituyen los tejidos; slo alrededor del 30 % del colesterol circulante en
sangre se presenta en forma libre el resto se encuentra en forma de steres del colesterol.

En relacin a sus propiedades fsicas, es un lpido poco soluble en agua (a 25C el lmite
de su solubilidad es 0.2 mg/100 ml). La alta solubilidad del colesterol en sangre se debe
a la presencia de lipoprotenas plasmticas que tienen la capacidad de fijar y solubilizar
grandes cantidades de colesterol por asociacin de lpidos y protenas. Sus propiedades
como alcohol dependen del grupo OH; la cadena lateral de hidrocarburo unida al tomo de
carbono 17 le da las caractersticas de lpido, como son solubilidad en ter, cloroformo, etc.

El colesterol tiene una gran importancia desde el punto de vista bioqumico, ya que es el
precursor de otros esteroides entre los que se encuentran cidos biliares, hormonas
corticosuprarrenales, hormonas sexuales, vitamina D, glucsidos cardiacos y algunos
alcaloides. Adems es un componente muy importante de las membranas celulares, su
presencia modifica la fluidez de la membrana ya que le confiere rigidez debido a su
estructura policclica. Esta ampliamente distribuido en todas las clulas del organismo, pero
en particular en el sistema nervioso.

Es sintetizado en numerosos tejidos a partir de acetil CoA y finalmente eliminado del cuerpo
en la bilis, como colesterol o como sales biliares. s un producto tpico del metabolismo
animal, por lo cual existe en los alimentos de este origen, como la yema de huevo, carne,
hgado y cerebro.

Los niveles de colesterol en sangre estn relacionados con la edad, el sexo, el peso, la
dieta y el ejercicio Es muy importante mantener al colesterol dentro de ciertos lmites porque
un exceso de esta sustancia puede provocar problemas cardiovasculares.

Las tcnicas de determinacin de colesterol se basan en la reaccin de Liebermann


Buchard. El colesterol y algunos otros esteroides en una mezcla cida, compuesta de cido
sulfrico, anhdrido actico, cido actico y sulfato de sodio producen un complejo de cido
3,3 biscolesta 3,5 dienil sulfnico( amarillo) y el cido 3-3 biscolesta 2,4 dienilsulfnico
(azul), este complejo colorido de color verde, se cuantifica a 610 nm de longitud de onda.

El colesterol es atacado por reactivos muy cidos, estos reactivos eliminan del colesterol
una molcula de agua, para despus oxidar al intermediario y formar el 3,5 colestadieno,
este a su vez es atacado para formar el bis-3,5 colestadieno y con la adicin de cido
sulfrico se obtiene el cido bis-colestadienilmonosulfnico (color verde) o cido bis-
colestadienildisulfnico (color rojo).

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SEMESTRE 2018-1

MATERIAL Y REACTIVOS

MATERIAL QUE DEBEN PROPORCIONAR LOS ALUMNOS

Lentes de seguridad Material para toma de muestra sangunea


Equipo vacutainer Tubo vacutainer de tapn amarillo o rojo

MATERIAL POR EQUIPO MATERIAL POR GRUPO


2 vaso de precipitados de 100 mL 4 celdas para espectrofotmetro de
cuarzo
12 tubos de ensaye medianos 15 x 1 frasco para residuos de 1L
1.5cm
4 tubos para centrifuga 5 espectrofotmetro
2 pipeta graduada de 1 mL 5 centrifugas
1 pipeta pasteur 5 balanzas granataria de dos platos
1 propipeta 10 vasos de precipitado de plstico
1 piseta 1 pipeta graduada de 5mL
1 gradilla 2 pipetas graduada de 1mL
1 varilla de vidrio 2 pipetas graduada de 2mL
1 vaso de preciptado de 100mL
5 vasos de preciptado de 50mL
1 bao mara c/gradilla

REACTIVOS

60 mL colesterol estndar 1 mg/ml 160 mL cido actico


160 mL cido paratoluen sulfnico 12 % 400 mL anhdrido actico
60 mL cido sulfrico 50 mL etanol
3 L agua destilada

METODOLOGIA

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I. TOMA DE MUESTRA.
Investigacin por parte del alumno

II. PREPARACION DE LA MUESTRA.


Para evitar que se produzca hemlisis, se quita la aguja de la jeringa y se vaca la sangre
lentamente a un tubo perfectamente limpio y seco. Es muy importante que el contenido de
la jeringa no se vacie a travs de la aguja, ni se empuje mucho el embolo y que no se forme
espuma. Para obtener el suero se deja coagular la sangre (30 minutos a 37C). El tubo se
somete a centrifugacin a 2500 rpm durante 10 minutos, se saca el tubo, el suero es el
sobrenadante y debe ser de un color amarillo plido, libre de coloracin roja.

III. CUANTIFICACION DE COLESTEROL

1. Prepare la siguiente serie de tubos (en material perfectamente limpio y seco) para la
curva estndar. Al mismo tiempo se deben preparar el o los tubos problema (P).
2. Siga cuidadosamente el orden de adicin de los reactivos.

NMERO DE TUBO
REACTIVO 1 2 3 4 5 6 7 8 P
Colesterol estndar 100 mg - 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.8 1.0 -
/100 ml de cido actico (mll)
Suero sanguneo (ml) - - - - - - - - 0.2
cido actico (ml) 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.2 1.0 1.8
Acido p-toluen sulfnico al 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
12% (ml)
SUMERGIR LOS TUBOS EN AGUA FRIA SIN AGITAR
Anhdrido actico (ml) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4,0 4.0 4.0 4.0
cido Sulfrico (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

AGITE VIGOROSAMENTE CADA UNO DE LOS TUBOS

4. Saque los tubos del agua y deje reposar durante 20 minutos.


4. Lea la absorbancia y transmitancia de cada uno de los tubos en un
espectrofotmetro a 620 nm, utilizando el tubo No. 1 como BLANCO de reactivos.
5. Trace la curva patrn graficando Absorbancia vs Concentracin en mg/ 100 ml y
tambin la grfica utilizando la transmitancia.
6. Interpole en la grfica respectiva el valor de Absorbancia obtenido para el
Problema. De la grfica de transmitancia contra concentracin, obtenga el dato
correspondiente al problema.
7. Compare sus resultados con los datos de concentracin normal que Ud. investig
y concluya para la realizacin de su reporte.

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OBSERVACIONES Y RESULTADOS

Tubo Absorbancia
Concentracin Unid. de Conc
No

CLCULOS

En su reporte debe dar respuesta a las siguientes preguntas


1. De acuerdo a lo que sabe acerca de las reacciones de determinacin de colesterol
diga qu tipo de reaccin se llev a cabo.
2. Estn de acuerdo sus resultados a la edad y sexo del donador de la muestra?

MANEJO DE RESIDUOS

Los residuos generados en esta prctica sern manejados de acuerdo a las indicaciones
generadas en el apartado correspondiente de este manual: los cidos o bsicos se
neutralizan y se eliminan en las tarjas con suficiente agua; los solventes y mezclas de
reactivos se guardarn, en frascos perfectamente etiquetados que permita conocer en todo
momento que tipo de residuos son, quin los gener y en que prctica. Los desechos
slidos se colocan en bolsas y depositan en los cestos de basura. Si tiene dudas consulte
a su asesor.

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MANUAL DE PRCTICAS DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA METABLICA
SEMESTRE 2018-1

BIBLIOGRAFA

1. Huang, T.C.C.P., Chem V., Wefrer and A. Raftery. (1961). A stable reagent for the
Liebermann-Buchard reaction application to rapie serum cholesterol determination.
Analytical chem, 33: 1405.
2. Murray, K. R., Granner, K.D., Mayes, A.P., Rodwell, W.V. (2001). Bioqumica de
Harper. (15 ed.) Mxico: Manual Moderno.
3. Stryer, L. (1996). Bioqumica. (4 ed.) Barcelona, Espaa: De Revert.

FES-CUAUTITLN/QUMICA 70
MANUAL DE PRCTICAS DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA METABLICA
SEMESTRE 2018-1

PRCTICA 7
CUANTIFICACION DE CREATININA EN SUERO SANGUNEO

OBJETIVO

Cuantificar la concentracin de creatinina en una muestra de suero sanguneo mediante el


mtodo colorimtrico de Jaffe con el fin de compararlo con los valores de referencia
reportados en la literatura.

CUESTIONARIO PREVIO

1. Qu es el la creatinina y cules son sus propiedades?


2. Cul es la importancia de la creatinina?
3. Cules son los niveles normales de creatinina en sangre de acuerdo con la edad?
4. Investigue el fundamento de la tcnica de cuantificacin de creatinina que utilizar en el
laboratorio.
5. Qu enfermedades estn ligadas a los niveles de creatinina en sangre?

INTRODUCCIN

La creatina es una sustancia producida en la degradacin metablica de los aminocidos


glicina, arginina y metionina, principalmente en el hgado, los riones y el pncreas; de all
es transportada en el torrente sanguneo a todas las clulas del cuerpo. Ya que la creatina
participa en todos los procesos que requieren energa, las clulas musculares, cerebrales
y nerviosas contienen mucha creatina.

La creatinina es un producto final del metabolismo muscular, se origina a partir de la creatina


por prdida de una molcula de agua. A su vez, la creatina se produce por hidrlisis del
fosfato de creatina, por accin de la creatin-fosfokinasa (CPK), apareciendo como
metabolitos de dicha reaccin el fosfato energtico y la creatina. El radical fosfato puede
aportar energa directamente por dicha reaccin o a travs de su acoplamiento a una
molcula de ADP para formar ATP y posterior hidrlisis por accin de ATPasa.

A diferencia de la urea, la eliminacin de creatinina por la orina no viene afectada por la


diuresis, al mismo tiempo que para una persona es muy constante su eliminacin diaria casi
independientemente de la dieta alimenticia, siendo la masa muscular el factor condicionante
ms directo de su excrecin total por da.

Jaff describi un mtodo en 1886 para la determinacin de creatinina el cual envolva una
protena libre filtrada y una reaccin con cido pcrico en una solucin alcalina. Aunque

FES-CUAUTITLN/QUMICA 71
MANUAL DE PRCTICAS DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA METABLICA
SEMESTRE 2018-1

desde entonces se han descrito varios mtodos, el mtodo clsico de reaccin de Jaff
sigue siendo el ms utilizado.

La creatinina reacciona con el cido pcrico en condiciones alcalinas para formar un


complejo de color amarillo anaranjado, el cual absorbe a 510 nm.
La reaccin qumica de Jaff no es especfica para la creatinina. Tambin reacciona
principalmente con las protenas, bilirrubina y hemoglobina. Es por esta razn que la
muestra debe ser desproteinizada.

MATERIAL Y REACTIVOS

MATERIAL QUE DEBEN PROPORCIONAR LOS ALUMNOS

Lentes de seguridad Material para toma de muestra sangunea


Equipo vacutainer Tubo vacutainer de tapn amarillo o rojo
Papel aluminio

MATERIAL POR EQUIPO MATERIAL POR GRUPO


2 pipetas graduadas de 1 mL 5 centrfugas
1 pipeta graduada de 2mL 5 baos mara con gradilla
5 tubos de ensaye 1.5 x 15 cm 5 balanzas granatarias de dos platos
1 pipeta Pasteur 5 espectrofotmetros
2 tubos para centrifuga Celdas de cuarzo
1 propipeta 5 termmetros
1 piseta con agua destilada 3 vasos de precipitados 50mL
1 gradilla 1 pipeta graduada 1mL
1 vaso de precipitado de 50 ml 2 pipeta graduada 2mL
1 galn de H2O destilada
10 vasos de plstico

REACTIVOS
60mL cido pcrico (en frasco mbar) 30mL solucin de creatinina estndar
17.5 mmol/L 200 mg/L
20mL Hidrxido de sodio 0.29 mol/L

METODOLOGA

I. TOMA DE MUESTRA
Investigacin por parte del alumno

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MANUAL DE PRCTICAS DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA METABLICA
SEMESTRE 2018-1

II. PREPARACION DE LA MUESTRA

1. Para evitar que se produzca hemlisis, se quita la aguja de la jeringa y se vaca la


sangre lentamente a un tubo perfectamente limpio y seco. Es muy importante que el
contenido de la jeringa no se vace a travs de la aguja, ni se empuje mucho el embolo
y que no se forme espuma. Para obtener el suero se deja coagular la sangre (entre
15 y 30 minutos) se desprende el coagulo formado con un palillo y se retira. El tubo
se somete a centrifugacin a 2500 rpm durante 10 minutos, se saca el tubo, el suero
es el sobrenadante y debe ser de un color amarillo plido, libre de coloracin roja
2. Las muestras se cubrirn con papel aluminio debido a que son sensibles a la luz

III. TRATAMIENTO DEL SUERO (SUERO DESPROTEINIZADO)

1. En un tubo de centrifuga coloque 0.30 mL de suero y 1.5 mL de cido pcrico y


mezclar
2. Deje reposar durante 10 minutos y centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos como
mnimo
3. Separe el sobrenadante (suero desproteinizado)
4. Repita el mismo procedimiento empleando ahora la solucin estndar de creatinina

IV. CUANTIFICACIN DE CREATININA

1. Rotule tres tubos de ensaye como E (estndar), MP (muestra problema) y B (blanco)


2. Prepare los sistemas al mismo tiempo de acuerdo a la siguiente tabla

TUBO B E MP
Suero
- - 1.2 mL
desproteinizado
Creatinina estndar - 1.2 mL -
cido pcrico 1.2 mL - -
Hidrxido de sodio 0.2 mL 0.2 mL 0.2 mL

5. Mezcle, espere 20min a temperatura ambiente y mida la absorbancia de E y MP a


510 nm utilizando el blanco para calibrar el equipo
6. Registre los datos en el cuadro A

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SEMESTRE 2018-1

OBSERVACIONES Y RESULTADOS

CUADRO A. Medidas de absorbancias


Muestra Absorbancia (E) Absorbancia (MP)

Problema 1

Problema 2

Para cuantificar la creatinina presente en el suero se aplicara la siguiente frmula:


( ) = 2 ( )

MANEJO DE RESIDUOS

Los residuos generados en esta prctica sern manejados de acuerdo a las indicaciones
generadas en el apartado correspondiente de este manual: los cidos o bsicos se
neutralizan y se eliminan en las tarjas con suficiente agua; los solventes y mezclas de
reactivos se guardarn, en frascos perfectamente etiquetados que permita conocer en todo
momento que tipo de residuos son, quin los gener y en que prctica. Los desechos
slidos se colocan en bolsas y depositan en los cestos de basura. Si tiene dudas consulte
a su asesor.

BIBLIOGRAFA

1. Ganong, F. (2002). Fisiologa Mdica. (18a ed.) D.F., Mxico: Manual Moderno.
2. Viniegra, P. (1994). Manual de Qumica Clnica. Estado de Mxico, Mxico:
Instituto Mexicano del Seguro Social.
3. Karp, G. (2010). Biologa celular y molecular. (6 ed.) Mxico: Mc Graw Hill.
4. Murray, K., Granner, K., Mayes, A. y Rodwell, W. (2001). Bioqumica de Harper.
(15 ed.) D.F., Mxico: Manual Moderno.

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SEMESTRE 2018-1

PRCTICA 8
CUANTIFICACIN DE CALCIO EN SUERO SANGUNEO

OBJETIVO

Cuantificar la concentracin de calcio, en una muestra de suero sanguneo, mediante el


mtodo colorimtrico azul de timol con el fin de compararlo con los valores de referencia
reportados en la literatura.

CUESTIONARIO PREVIO

1. Cul es la importancia del metabolismo del calcio?


2. Cules son los niveles normales de calcio en sangre de acuerdo con la edad?
3. Investigue el fundamento de la tcnica de cuantificacin de calcio que utilizar en el
laboratorio.
4. Qu enfermedades estn ligadas a los niveles de calcio en sangre?

INTRODUCCIN

El calcio es uno de los constituyentes inicos importantes en el organismo. Se combina con


el fsforo para formar las sales que constituyen el componente principal de los huesos y los
dientes. Tiene un rol esencial en la transmisin neuromuscular del impulso nervioso. Es un
componente clave en la cascada de la coagulacin, cofactor de muchas enzimas del
organismo, influye en la secrecin de gastrina y es partcipe sustancial en la contractilidad
muscular.

La mayor parte del calcio corporal se localiza en el hueso (98-99%), el 1-2% en los tejidos
blandos y el 0.1% en el lquido extracelular.
El calcio plasmtico representa el 0.03% del calcio total del organismo y puede dividirse en
3 fracciones:
a) 40 45% unido a protenas de la sangre, principalmente albmina, que representa
el 80% de la protena fijadora de Ca.
b) 45% forma ionizada libre: fisiolgicamente activa y regulada homeostticamente
por vitamina D.
c) 10 - 15% forma difusible no ionizada, unida a aniones orgnicos e inorgnicos como
sulfato, lactato, citrato y fosfato.

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MANUAL DE PRCTICAS DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA METABLICA
SEMESTRE 2018-1

Las hormonas directamente responsables de la regulacin del metabolismo del calcio son
la PTH (hormona paratiroidea), la calcitonina y la vitamina D, los glucocorticoides, la STH,
las hormonas tiroideas y las hormonas sexuales pueden modificar la calcemia y el
metabolismo seo.

El calcio total del organismo, resulta del balance entre la ingesta y la excrecin, tanto
intestinal como urinaria. En el equilibrio el balance es igual a cero. Esta situacin se da en
los sujetos sanos en edad adulta. En cambio los nios, adolescentes sanos y mujeres
gestantes se encuentran en balance positivo, mientras que en la vejez ocurre balance
negativo.

El raquitismo y osteoporosis son ejemplos comunes de enfermedades seas que se


caracterizan por descalcificacin o calcificacin defectuosa, se acompaan o son producto
de un balance negativo de calcio.

El calcio reacciona con el azul de timol en un medio alcalino formando un complejo azul
que absorbe a 610 nm, cuya intensidad de color es directamente proporcional a la cantidad
de calcio existente en la muestra.

MATERIAL Y REACTIVOS

MATERIAL QUE DEBEN PROPORCIONAR LOS ALUMNOS

Lentes de seguridad Material para toma de muestra sangunea


Equipo vacutainer Tubo vacutainer de tapn amarillo o rojo
Papel aluminio

MATERIAL POR EQUIPO MATERIAL POR GRUPO

1 pipetas graduadas de 1 mL 5 centrfugas


4 tubos de ensaye 1.5 x 15 cm 5 baos mara con gradilla
1 pipeta Pasteur 5 balanzas granatarias de dos platos
2 tubos para centrifuga 5 espectrofotmetros
1 propipeta 2 balanzas electrnicas
1 piseta con agua destilada 20 celdas para espectrofotmetro
1 gradilla 5 termmetros
1 vaso de precipitado de 50 mL 2 vasos de precipitados 50mL
1 pipeta graduada 1mL
1 pipeta graduada 2mL
4L de H2O destilada

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SEMESTRE 2018-1

10 vasos de precipitado de plstico


1 micropipeta 10-100 L

REACTIVOS
20mL calcio estndar (Carbonato de calcio)
100mL azul de timol 5 x10-4 %
0.2 g/L

METODOLOGA

I. TRATAMIENTO DE LA MUESTRA (OBTENCIN DE SUERO)

1. Con ayuda del sistema vacutainer obtenga una muestra de sangre


2. Coloque el tubo vacutainer en un bao mara durante 10 min a 37C y posteriormente
centrifugar a 2500 rpm durante 10 min.
3. Obtenga el suero (sobrenadante),
NOTA: se deber separar el coagulo lo antes posible, ya que las clulas rojas absorben
el calcio.

II. CUANTIFICACIN DE CALCIO

1. Rotule tres tubos de ensaye como B (blanco), P (patrn) y M (muestra).


2. Prepare los sistemas al mismo tiempo de acuerdo a la siguiente tabla

TUBO B P M
Muestra de suero - 50 L
Calcio estndar - 50 L -
Azul de timol 2 mL 2 mL 2 mL

7. Mezcle y deje reposar 3 min a temperatura ambiente y mida la absorbancia de P y


M a 610 nm, utilizando el blanco para calibrar el equipo
8. Registre los datos en la cuadro A
9. Repita el mismo procedimiento pero empleando la segunda muestra de sangre
problema.

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MANUAL DE PRCTICAS DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA METABLICA
SEMESTRE 2018-1

OBSERVACIONES Y RESULTADOS

CUADRO A. Medidas de absorbancia


Muestra Absorbancia (P) Absorbancia (M)

Problema 1

Problema 2

CLCULOS

Para cuantificar el calcio presente en el suero se aplicara la siguiente frmula:


10( ) =

MANEJO DE RESIDUOS

Los residuos generados en esta prctica sern manejados de acuerdo a las indicaciones
generadas en el apartado correspondiente de este manual: los cidos o bsicos se
neutralizan y se eliminan en las tarjas con suficiente agua; los solventes y mezclas de
reactivos se guardarn, en frascos perfectamente etiquetados que permita conocer en todo
momento que tipo de residuos son, quin los gener y en que prctica. Los desechos
slidos se colocan en bolsas y depositan en los cestos de basura. Si tiene dudas consulte
a su asesor.

BIBLIOGRAFA

1. Ganong, F. (2002). Fisiologa Mdica. (18a ed.) D.F., Mxico: El Manual


Moderno.

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MANUAL DE PRCTICAS DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA METABLICA
SEMESTRE 2018-1

2. Viniegra, P. (1994). Manual de Qumica Clnica. Estado de Mxico, Mxico:


Instituto Mexicano del Seguro Social.
3. Karp, G. (2010). Biologa celular y molecular. (6 ed.) D.F., Mxico: Mc Graw Hill.
4. Murray, K., Granner, K., Mayes, A. y Rodwell, W. (2001). Bioqumica de Harper.
(15 ed.) D.F., Mxico: El Manual Moderno.

PRCTICA 9

CUANTIFICACION DE BILIRRUBINA EN SUERO SANGUNEO

OBJETIVOS

- Determinar la presencia de bilirrubina en muestras de suero sanguneo a travs de


tres pruebas cualitativas (Fouchet y reaccin de Smith) para comprobar que realmente
est presenta en las muestras.

- Medir la absorbancia de las muestras de suero sanguneo utilizando el mtodo de


Malloy-Evelyn con el fin de cuantificar la cantidad de bilirrubina presente.

CUESTIONARIO PREVIO

1. Cul es la importancia del metabolismo de bilirrubina?


2. Cules son los niveles normales de bilirrubina en sangre de acuerdo con la edad?
3. Investigue el fundamento de las tcnicas de identificacin y cuantificacin de bilirrubina
que utilizar en el laboratorio.
4. Qu enfermedades estn ligadas a los niveles de bilirrubina en sangre?

INTRODUCCIN

La bilirrubina es un compuesto muy colorido producto de la degradacin de la hemoglobina.


En condiciones normales, la vida de los eritrocitos es de alrededor de 120 das, momento
en el cual las clulas fagociticas del sistema reticuloendotelial del bazo y el hgado los
destruyen. La hemoglobina liberada es degradada en sus componentes, uno de ellos es la
protoporfirina. Las clulas del sistema reticuloendotelial convierten la protoporfirina en
bilirrubina. sta luego se libera en la circulacin, donde se une con la albmina y es
transportada al hgado. En el hgado, la bilirrubina se conjuga con cido glucurnico por
accin de la enzima glucuroniltransferasa para formar el diglucurnido de bilirrubina
hidrosoluble (bilirrubina conjugada o directa).

FES-CUAUTITLN/QUMICA 79
MANUAL DE PRCTICAS DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA METABLICA
SEMESTRE 2018-1

La hepatitis y la cirrosis son ejemplos comunes de enfermedades que producen dao


heptico y dan como resultado la aparicin de bilirrubina.

El desarrollo de los mtodos para la deteccin de bilirrubina se inici en 1883, cuando


Ehlrich descubri que la bilirrubina reacciona con el cido sulfanlico y forma un compuesto
colorido al que llamo azobilirrubina.

La bilirrubina conjugada, muy polar, reacciona en medio acuoso con el reactivo de


diazotacin, por lo que se le llam directa, pues al poner en contacto el suero y el reactivo
apareca directamente el color. Sin embargo, la bilirrubina libre, poco polar, no da
directamente la reaccin y es preciso aadir un tercer reactivo que inicialmente fue el
metanol para que produzca la reaccin de diazotacin con la consiguiente aparicin del
color, por este motivo se llam bilirrubina indirecta.

Reaccin con tira reactiva

La bilirrubina se combina con la sal de diazonio 2,4-dicloroanilina o 2,6-diclorobenceno-


diazonio-tetrafluoroborato en medio cido para producir un colorante azoico, con colores
que varan desde grados crecientes de beige a caf. Los resultados cualitativos se informan
como negativo (beige), escaso (beige fuerte), moderado (caf claro) o abundante (caf), o
bien como negativo, +1, +2 +3.

Prueba de Fouchet

Se aade al suero solucin de cloruro de bario. Se produce un precipitado de sulfato de


bario que absorbe la bilirrubina. La bilirrubina absorbida sobre el sulfato de bario se separa
y reaccione con una solucin de cloruro frrico de Fouchet. El cloruro frrico oxida la
bilirrubina a biliverdina y se produce una coloracin azul-verdosa.

Reaccin de Yodo de Smith

Se basa en la reaccin colorimtrica del yodo con la bilirrubina convirtiendo a sta en


biliverdina y bilicianina. Se aade al suero una solucin de yodo, la presencia de bilirrubina
se observa a travs de la formacin de un anillo color verde esmeralda en la interface de
ambos lquidos.

Mtodo de cuantificacin

Se basa en la reaccin de Malloy-Evelyn, que valora bilirrubina colorimtricamente por la


formacin de azobilirrubina, de color rosa a violeta, cuando a la bilirrubina se le hace
reaccionar en determinadas condiciones con el cido sulfanlico diazotado. La intensidad
del color es directamente proporcional a la cantidad de bilirrubina en la muestra.

MATERIAL Y REACTIVOS

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SEMESTRE 2018-1

MATERIAL QUE DEBEN PROPORCIONAR LOS ALUMNOS

Lentes de seguridad Material para toma de muestra sangunea


Equipo vacutainer Tubo vacutainer de tapn amarillo o rojo
Papel aluminio

MATERIAL POR EQUIPO MATERIAL POR GRUPO


1 vaso de precipitados de 50 mL 2 frascos para residuos de 100 mL
7 tubos de ensaye 2.5 x 15cm 5 espectrofotmetro
2 tubos para centrifuga 5 centrifugas
2 pipeta graduada 5 mL 5 balanza granataria de dos platos
1 pipeta graduada de 1 mL 5 termmetro
1 pipeta Pasteur 5 baos mara con gradilla
1 propipeta 2 pipetas graduadas 5mL
1 piseta 3 pipeta graduada 2mL
1 gradilla 1 pipeta graduada 1mL
1 tripie 6 vasos de precipitados de 50mL
1 triangulo de porcelana 4L de H2O destilada
1 embudo de vidrio 10 vasos de plstico
20 celdas de cuarzo

REACTIVOS

10 mL de Reactivo de Fouchet 100 mL de Cloruro de bario 10%


100 mL Reactivo sulfanlico (cido
45 mL Reactivo de Smith
sulfanlico 29 mmol/L y HCl 0.17 mol/L)
20 mL NaNO2 (0.07 mol/L) en frasco
1 pliego de papel filtro
gotero
40 mL cafena (100 mmol/L)

METODOLOGA

I. Tratamiento de la muestra (obtencin de suero)

1. Con ayuda del sistema vacutainer de tapn rojo, tome la muestra de sangre
2. Coloque el tubo vacutainer en un bao mara durante 10 min a 37C y posteriormente
centrifuge a 2500 rpm durante 10 min.
3. Separe el sobrenadante (suero) que es de color amarillo plido
4. Las muestras se cubrirn con papel aluminio debido a que son sensibles a la luz

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MANUAL DE PRCTICAS DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA METABLICA
SEMESTRE 2018-1

II. Prueba de Fouchet

1. En un tubo de ensaye coloque 5 mL de una de las muestra problema y aada 5 mL


de la solucin de cloruro de bario 10%
2. Mezcle y filtre dicha mezcla. Colocar el papel filtro extendido
3. Aada al precipitado unas gotas del reactivo de Fouchet. Si existe bilirrubina
presente aparecer un color verde o azul verdoso
4. Repita el procedimiento anterior con la otra muestra problema
5. Anote los resultados en la tabla 1 en la columna correspondiente

III. Prueba de yodo de Smith.

1. En un tubo de ensaye coloque 5 mL de muestra problema


2. Adicione lentamente por las paredes del tubo 2 mL de reactivo de yodo de Smith
3. La formacin de un anillo color verde esmeralda en la interfase de ambos lquidos
da positivo a la presencia de bilirrubina
4. Repita el procedimiento con las dems muestras
5. Registre los resultados en la columna correspondiente del cuadro A

IV. Cuantificacin de bilirrubina.

1. Rotule 3 tubos de ensaye como B1, BT y BD


2. Ajuste el espectrofotmetro
3. Prepare los sistemas, al mismo tiempo, de acuerdo a la siguiente tabla

BD BT
B1
Bilirrubina Bilirrubina
(blanco 1)
directa total
cido sulfanlico /cido
clorhdrico 1.5 1.5 1.5
(mL)
Nitrito de sodio
-- 2 2
(gotas)
Cafena
-- -- 2
(mL)
Muestra
0.2 0.2 0.2
(mL)
Agua destilada
2 2 --
(mL)

4. Mezcle e incube 5 min a 20C


5. Lea la absorbancia de los tubos a 530 nm utilizando agua destilada para calibrar el
equipo.

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SEMESTRE 2018-1

6. Registre los datos en el cuadro B.


7. Repita el mismo procedimiento pero empleando segunda muestra de sangre
problema.

OBSERVACIONES Y RESULTADOS

CUADRO A. Resultados de observaciones de pruebas cualitativas

Muestra Prueba de Prueba de


Fouchet Smith
Problema 1
Problema 2

CUADRO B. Medidas de absorbancias

Muestra BD
BT
B Bilirrubina
Bilirrubina
(blanco) directa
total
Problema 1

Problema 2

CALCULOS

((A) Muestra (A) Blanco Muestra) x Factor* : mg/ dL bilirrubina en la muestra

*Factor terico : Bilirrubina (T): 19.1 Bilirrubina (D): 14


Factor de conversin: mg/dL x 17.1: mol/L

Para cuantificar la bilirrubina directa (conjugada) o total (no congujada) presente en el suero
se aplicar las frmulas anteriores

FES-CUAUTITLN/QUMICA 83
MANUAL DE PRCTICAS DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA METABLICA
SEMESTRE 2018-1

BIBLIOGRAFA

1. Wiener lab. (2000). Bilirrubina. Mtodo colorimtrico para la determinacin de


bilirrubina directa y total en suero. Argentina.
2. Ganong, F. (2002). Fisiologa Mdica. (18a ed.) Mxico: Manual Moderno.
3. Wein, K. (2008). Campbell-Walash: Urologa. (9a ed.) Mxico: Editorial mdica
panamericana.
4. Fischbach, T. (1997). Manual de procesos diagnsticos. (2 ed.) D.F., Mxico: Mc-
GrawHill.
5. Lynch, J. (1997). Mtodos de laboratorio. (2 ed.) D.F., Mxico: Editorial
interamericana.
6. Graff, L. (2007). Anlisis de orina. (2 ed.) Mxico: Editorial mdica panamericana.
PRCTICA 10

CUANTIFICACIN DE UROBILINGENO EN ORINA

OBJETIVO

Cuantificar la concentracin de urobilingeno en una muestra de orina mediante el mtodo


colorimtrico de Ehrlich con el fin de compararlo con los valores de referencia reportados
en la literatura.

CUESTIONARIO PREVIO

1. Cul es la va metablica de formacin de urobilingeno?


2. Cul es la funcin del urobilingeno?
3. Cules son los niveles normales de urobilingeno en orina de acuerdo con la edad?
4. Investigue el fundamento de las tcnicas de identificacin y cuantificacin de
urobilingeno que utilizar en el laboratorio.
5. Qu enfermedades estn ligadas a los niveles de urobilingeno en orina?

INTRODUCCIN

La bilirrubina se forma a partir de la degradacin de la hemoglobina en el sistema


reticuloendotelial; unida a la albmina, es transportada por la sangre hasta el hgado.
En el intestino, las enzimas bacterianas convierten la bilirrubina, pasando por un grupo de
compuestos intermedios, en diversos compuestos relacionados que se denominan en forma
colectiva urobilingeno. La mayor parte del urobilingeno (pigmento incoloro) y su
variante oxidada, la urobilina (pigmento marrn), se pierde con las heces.
Aproximadamente el 10 al 15 % del urobilingeno es reabsorbido, pasa al torrente

FES-CUAUTITLN/QUMICA 84
MANUAL DE PRCTICAS DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA METABLICA
SEMESTRE 2018-1

sanguneo, retorna al hgado y es reexcretado hacia el intestino. Una pequea cantidad de


este urobilingeno se excreta tambin por los riones, y a diferencia de la bilirrubina, existe
urobilingeno en la orina en un nivel normal de aproximadamente 1-4 mg/24h.

Se pueden presentar resultados falsos negativos cuando el paciente recibe antibiticos,


cuando hay suspensin de la produccin de bilis en el hgado por ejemplo en hepatitis viral
severa o cuando hay una obstruccin de los conductos biliares, debido a que en este caso
la bilirrubina no pasara al tracto digestivo. Tambin se presentan resultados falsos
negativos cuando la muestra se procesa ms all del tiempo ptimo, debido a que el
urobilingeno se oxida convirtindose en urobilina cuando la orina es expuesta a la luz y al
aire.

El urobilingeno en orina es estable durante 8 horas a temperatura ambiente protegido de


la luz y aire y 5 das a 2-8 C.
El pico de la excrecin de urobilingeno se produce entre las 14 y 16 horas, de modo que
es aconsejable recolectar la orina en ese momento del da.

El urobilingeno reacciona con el p-dimetilaminobenzaldehdo en un medio fuertemente


cido, produciendo una coloracin rojo cereza, el cual absorbe a 500 nm. La intensidad del
color es proporcional a la cantidad de urobilingeno presente en la muestra.

La reaccin qumica de Ehrilich no es especfica para el urobilingeno, con este mtodo


tambin se detecta porfobilingeno. Al agregar una solucin saturada de acetato de sodio
produce la intensificacin del color si ste se debe a la presencia de urobilingeno, pero el
color no se modifica si se debe a porfobilingeno.

MATERIAL Y REACTIVOS

MATERIAL QUE DEBEN PROPORCIONAR LOS ALUMNOS

Lentes de seguridad Muestra de orina


Papel aluminio

MATERIAL POR EQUIPO MATERIAL POR GRUPO

1 vaso de precipitados de 100 mL 5 espectrofotmetros


4 tubos de ensaye 15 x 1.5cm 5 centrifugas
4 tubos para centrifuga 5 balanzas granataria de dos platos
1 pipeta graduada 2 mL 2 pipetas graduadas 1mL
2 pipeta graduada de 5 mL 1 pipeta graduada 2mL
1 pipeta pasteur 2 pipeta graduada 10mL
1 propipeta 1 pipeta graduada 5mL
1 piseta 5 vasos de precipitados de 50mL

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SEMESTRE 2018-1

1 gradilla 1 galn de H2O destilada


10 vasos de precipitado de plstico
4 celdas para espectrofotmetro de
cuarzo
1 frasco de residuos de 50mL

REACTIVOS
40 mL de p-dimetilaminobenzaldehdo
50 mL carbonato de sodio 15%
(R. Erlich)
40 mL HCl 6N 10 mL fenolftalena 0.1%
200 mL acetato de sodio

METODOLOGA

I. TRATAMIENTO DE LA MUESTRA

1. Las muestras estarn guardadas en frascos mbar debido a que son sensibles a la
luz o bien se cubrirn con papel aluminio.
2. En dos tubos para centrfuga verter 10 mL de muestra de orina, etiquetar como
problema 1.
3. En otros dos tubos para centrfuga colocar 10mL de muestra de orina, etiquetar como
problema 2.
4. Centrifugar durante 5 min a 2000 rpm.
5. Recuperar el sobrenadante.

II. PRUEBA CUALITATIVA DE UROBILINGENO

1. Colocar en un tubo de ensaye 5 mL de orina.


2. Agregar 1 mL del reactivo de Ehrlich y mezclar.
3. Dejar en reposo durante 5 minutos.
4. Comprobar el cambio de color. Si la reaccin es positiva la muestra virar a un tono
rojo cereza.
5. Agregar 2.5 mL de solucin saturada de acetato de sodio. Si la coloracin se
intensifica es positivo para urobilingeno, si el color no se modifica es positivo para
porfobilingeno.
6. Repetir el mismo procedimiento empleando la otra muestra problema de orina.

III. CUANTIFICACIN DE UROBILINGENO

1. Rotular tres tubos de ensaye como B (blanco), p (patrn) y P (problema).


2. Preparar los sistemas al mismo tiempo de acuerdo a la siguiente tabla

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TUBO B patrn Problema


Muestra de orina 2.0mL - 2.0 mL
Sol. fenolftalena - 1.0 mL -
Reactivo de Ehrlich - - 2.0 mL
HCl 2.0mL
Deje reposar 10mn
Solucin de acetato
6.0mL 6.0mL -
de sodio
Carbonato de sodio
- 5.0mL -
15%
Agua destilada 7mL 3mL 9mL

10. Mezclar y esperar exactamente 5 min a temperatura ambiente y medir la absorbancia


de p y P a 500 nm utilizando el blanco para calibrar el equipo.
11. Registrar los datos en el cuadro A.
12. Repetir el mismo procedimiento pero empleando diferente muestra de orina.
Registrar datos en cuadro A

OBSERVACIONES Y RESULTADOS

CUADRO A. Medidas de absorbancias


Muestra Absorbancia (p) Absorbancia (P)
Problema 1
Problema 2

CLCULOS

Para cuantificar el urobilingeno presente en la orina se aplicar la siguiente frmula:


( )=( ) ( )

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SEMESTRE 2018-1

BIBLIOGRAFA

1. Graff, L. (2007). Anlisis de orina. (2 ed.) Mxico: Editorial mdica panamericana.


2. Silva, C. y Garca, J. (2006). Laboratorio de Bioqumica. (1 ed.) Espaa: Editorial
MAD.
3. Ganong, F. (2002). Fisiologa Mdica. (18a ed.) Mxico: Manual Moderno.
4. Wein, K. (2008). Campbell-Walash: Urologa. (9 ed.) Mxico: Editorial mdica
panamericana.
5. Fischbach, T. (1997). Manual de procesos diagnsticos. (2 ed.) Mxico: Mc-
GrawHill.

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Seminario 1/Prctica 1: Cuantificacin de DNA

GRUPO __________ Q FECHA _______________ EQUIPO __________

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Seminario 2: Metabolismo energtico. Parte 1

GRUPO __________ Q FECHA _______________ EQUIPO __________

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Seminario 3: Metabolismo energtico. Parte 2

GRUPO __________ Q FECHA _______________ EQUIPO __________

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Seminario 4: Metabolismo no energtico. Parte 1

GRUPO __________ Q FECHA _______________ EQUIPO __________

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Seminario 5: Metabolismo no energtico. Parte 2

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Seminario 6/ Prctica 10: Cuantificacin de Urobilingeno

GRUPO __________ Q FECHA _______________ EQUIPO __________

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