FOSFATASA ALCALINA I & II

Ana Lucía Sánchez Lopera 1, Daniela María Barrera Mendoza 2

1y2
Estudiantes Química Farmacéutica

Laboratorio de Bioquímica
Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Alimentarias
Departamento de Farmacia
Universidad de Antioquia
Medellín, 2022

Resumen: Las fosfatasas alcalinas (FA) son un grupo de enzimas situadas en la membrana celular que
intervienen a diferentes niveles en situación fisiológica: Precipitación del fosfato cálcico en los huesos,
absorción de fosfatos por el intestino, síntesis de proteínas hísticas e hidrólisis de los ésteres fosfáticos del riñón
y el hígado. El objetivo del presente informe es comprender la reacción básica de las fosfatasas, calcular los
parámetros cinéticos haciendo un seguimiento a la formación de producto, considerando la influencia de la
concentración del sustrato y determinar el tipo de inhibición que sufre frente a la presencia de grupos fosfatos y
un inhibidor. Los resultados del experimento sin inhibidor enzimático arrojaron un Km presentó un valor de
4,57E-04 M, y la Vmax fue de 7,03E-04 [PNP]/min. Al emplear el inhibidor Fosfato disódico (Na 2HPO4), se
presentaron cambios en los parámetros cinéticos; para el caso del Km, se obtuvo un valor de 2,14E-04 M y para
la Vmax 1,00E-03 [PNP]/min, concluyendo que se trata de una inhibición reversible no competitiva.

Palabras claves: Cinética enzimática, fosfatasa, catálisis, inhibición.

1. Introducción
La fosfatasa alcalina es una enzima que se
encuentra en casi todos los tejidos del cuerpo, pero
es mayor su presencia en huesos, hígado, placenta,
intestinos y riñón. Tiene importancia clínica tanto
en su aumento como en su disminución de los
niveles en plasma.
La enzimología es una disciplina bioquímica
entrada en el estudio y caracterización de las
enzimas, en donde la cinética enzimática se ocupa
directamente del estudio de la velocidad de las
reacciones catalizadas por las enzimas y las causas
que conllevan a su variación. El análisis enzimático
generalmente está basado en el proceso en que la
enzima actúa sobre un sustrato catalizando su
conversión a producto, en donde algún compuesto
de esta reacción tiene la capacidad de absorber luz
a una longitud de onda determinada, con lo que la
reacción puede seguirse por colorimetría o
espectrofotometría (1).
La inhibición enzimática se define como la
disminución de la velocidad de la reacción
catalizada por una enzima debido a la presencia de
un inhibidor. Los inhibidores pueden actuar
alterando los parámetros cinéticos (Km y Vmax).
Atendiendo al modo de unión a la enzima, los
inhibidores se clasifican en dos grupos:
irreversibles (se unen a la enzima covalentemente y
la inhiben permanentemente) o reversibles (se unen
a la enzima mediante enlaces no covalentes), que
pueden ser: competitivos, no competitivos o
acompetitivos (3).
La fosfatasa alcalina ejerce su acción a pH elevado,
del orden 10, requiere para su actividad iones Zn 2+,
mientras que el fosfato inhibe su actividad. El
informe que se describe a continuación tiene como
objetivo buscar e identificar la función catalítica
que cumple la fosfatasa alcalina en la reacción de
hidrólisis de fosfoésteres, liberando fosfato
inorgánico.

La ecuación Michaelis-Menten (V = Vmax S / (Km 2. Métodos

+ S)) define el comportamiento cinético de estas
enzimas. La constante de Michaelis Km se define
como la concentración de sustrato a la que la
velocidad de la reacción enzimática es la mitad de
la Vmax. El valor de Km no sólo es variable en
función de la naturaleza de la enzima y del sustrato,
sino que también depende de las condiciones de
temperatura y pH de la reacción (2).
Se empleó como sustrato una sustancia éster de
fosfato artificial llamada p-Nitrofenol fosfato
(PNPP), que por la acción de la enzima y la
presencia de Zinc se hidroliza a p-Nitrofenol (PNP)
erradicando el fosfato que antes estaba unido a
PNPP. El PNP se colorea amarillo a medios
alcalinos lo cual permite seguir el proceso
enzimático de la reacción mediante análisis
espectrofotométrico a una longitud de onda de 410
nm (4).
Con el fin de preparar los estándares a partir de las
soluciones madre de p-Nitrofenol (PNP) 5x10-3 M
y p-Nitrofenilfosfato (PNPP) 5x10-3 M, se empleó
una ecuación que relaciona las concentraciones y
volúmenes, esta expresión permite encontrar la
concentración final de las diferentes diluciones
(dobles sucesivas, hasta 1/32)). La cual viene dada
por la siguiente ecuación:
C 1V 1
C1V1=C2V2 ; 𝐶2 =
V2
Para efectuar adecuadamente el proceso de las
diluciones es de suma importancia emplear el
instrumento adecuado para medir los volúmenes de
forma rápida y precisa. La pipeta utilizada en este
experimento se conoce como micropipeta y se
suelen utilizar para tareas de dosificación con
exigencias altas de precisión
Se empleó como diluyente buffer Glicina 0.05 M,
además se adicionó de a 1 mL de Fosfato de sodio
0.5M y 0.5 mL de ZnCl2 a cada tubo de ensayo.
2.1. Curva de calibración con el producto de la
reacción
Este procedimiento se realizó al medir la
absorbancia de las diferentes soluciones preparadas
de PNP a una longitud de onda de 410 nm, a la cual
el producto coloreado presenta la mayor capacidad
de absorber luz (máxima absorbancia). Transversal
a todo el proceso, el estudio se fundamentó en la
Ley de Beer, donde se establece que la absorbancia
está relacionada linealmente con la concentración
de la especie (solución) absorbente. Con base en
esto, se desarrolló un modelo de regresión lineal
por el método de mínimos cuadrados que es
homólogo a la Ley mencionada, el cual permitió
conocer la concentración del PNP producido en la
reacción del PNPP con la muestra enzimática
(suero fetal bovino).
2.1.1. Regresión para muestra problema
Considerando la ecuación de la Ley de Beer, en
donde se relaciona la absorbancia no solo con la
concentración, sino también con la absortividad
molar de la sustancia (ε) y la longitud del paso
óptico (b), con base en la siguiente expresión se
puede hacer una comparación directa con la
ecuación de la recta obtenida.
Abs = εbc
Como la longitud del paso óptico (b) es constante y
para las celdas utilizadas corresponde a 1 cm, se
puede decir que el término de la absortividad molar
corresponde a la pendiente m en una ecuación
lineal y la concentración (c) a la variable
independiente X.
y=m∗X+b
Así, la expresión final vendría dada por:
Abs = m ∗ Concentración + b
A partir de esta ecuación se realizó el despeje
necesario para hallar la concentración de la muestra
problema, de la siguiente manera:
|−b|
Concentración = * factor de dilución
m
2.2. Determinación de parámetros cinéticos Km
y Vm
A cada una de las diluciones de PNPP, se agregó
0,5 mL de solución de cloruro de zinc, se dejó
reposar por 5 minutos, seguidamente se incubó a 37
ºC por 5 minutos, se realizó una adición de 0,5 mL
de suero fetal bovino (solución enzimática) y se
dejó reaccionar por 15 minutos. Después de este
tiempo, detener la reacción con 1 mL de Na 2HPO4
0,5 M. Se realizó la medición de las absorbancias y
con la ayuda de la ecuación de la curva de
calibración, se calcularon los valores de PNP
producido.
2.3. Determinación del tipo de inhibición
Para la determinación de la actividad inhibitoria, se
siguió el mismo proceso descrito en el literal 2.2,
con la única diferencia de que se agregó 0,5 mL del
inhibidor 0,5x10-2, antes de dejar reposar la
solución, es decir en el momento inicial.
2.4. Lineweaver-Burk
A partir de los inversos (concentración de PNPP y
Vo) con la teoría de linealización de Lineweaver-
Burk se calcularon los parámetros cinéticos: Km y
Vm, empleando la siguiente ecuación:
Km
∗1
y=mx+b ; 1 Vmax 1
= +
Vo [S] Vmax
2.5. Preparación del blanco
Se elaboraron soluciones blanco, para cada uno de
los experimentos anteriores, bajo las mismas
condiciones que la muestra a excepción del PNP.
Se adiciona la misma cantidad de buffer glicina,
fosfato y ZnCl2 para un volumen final de 3.5 mL en Se ajustó el espectrofotómetro a una longitud de
cada caso. onda de 410 nm y se marcó el cero de absorbancia
con las soluciones blanco, según cada muestra.
3. Resultados

Tabla 1. Datos para la construcción de la curva de calibración Fosfatasa alcalina

TUBO 1 2 3 4 5 6

[PNP] (mol/L) 5x10-3 2.5x10-3 1.25x10-3 6.25x10-4 3.125x10-4 1.56x10-4

Absorbancia 1,100 0,547 0,266 0,114 0,050 0.019

Gráfico 1. Curva de calibración - Fosfatasa alcalina

Tabla 2. Datos determinación de parámetros cinéticos Km y Vm.

Vo=[PNP]/
[PNPP] (mol/L) Absorbancia [PNP] 1/[PNPP] 1/Vo
min
5,00E-03 1,226 5,50E-03 3,67E-04 2,00E+02 2,73E+03
1,165 (0,575
2,50E-03 5,24E-03 3,49E-04 4,00E+02 2,86E+03
dilución 1/2)
1,25E-03 1,002 4,50E-03 3,00E-04 8,00E+02 3,33E+03
6,25E-04 0,754 3,40E-03 2,27E-04 1,60E+03 4,41E+03
3,13E-04 0,5 2,20E-03 1,47E-04 3,20E+03 6,82E+03
1,56E-04 0,264 1,20E-03 8,00E-05 6,41E+03 1,25E+04
7,80E-05 0,141 6,90E-04 4,60E-05 1,28E+04 2,17E+04

Tabla 3. Datos para la determinación del tipo de inhibición

Vo=[PNP]/
[PNPP] (mol/L) Absorbancia [PNP] 1/[PNPP] 1/Vo
min
5,00E-03 0,739 3,35E-03 2,23E-04 2,00E+02 4,48E+03
2,50E-03 0,593 2,70E-03 1,80E-04 4,00E+02 5,55E+03
1,25E-03 0,425 1,96E-03 1,30E-04 8,00E+02 7,67E+03
 6,25E-04 0,262 1,23E-03 8,22E-05 1,60E+03 1,22E+04
3,13E-04 0,138 6,84E-04 4,56E-05 3,20E+03 2,19E+04
1,56E-04 0,074 4,00E-04 2,67E-05 6,41E+03 3,75E+04
7,80E-05 0,038 2,40E-04 1,60E-05 1,28E+04 6,24E+04

Parámetros cinéticos y efecto del inhibidor

1.40E+04
1.20E+04 f(x) = 0.65062233047929 x − x1422.58024678382
f(x) = 0.213683750761231 − 999.301598707482
R²R²
= 0.998537667624363
= 0.992368937508219
1.00E+04 Sin
1/Vo

8.00E+03 in-
hi-
6.00E+03 bid
or
4.00E+03
2.00E+03
0.00E+00
0.00E+00 1.00E+04 2.00E+04 3.00E+04 4.00E+04 5.00E+04 6.00E+04 7.00E+04
1/[PNPP]

Gráfico 2. Parámetros cinéticos y efecto de inhibición enzimática - Fosfatasa alcalina

Tabla 4. Resultados parámetros cinéticos con y sin inhibición.

Vmax
Ecuación Km ([PNP])
([PNP]/min)
Parámetros
cinéticos sin y = 0,6506x - 1422,6 7,03E-04 4,57E-04
inhibidor
Parámetros
cinéticos con y = 0,2137x - 999,3 1,00E-03 2,14E-04
inhibidor

actividad, mientras que el fosfato inhibe su

4. Análisis de Resultado actividad (5).

Las enzimas son generalmente moléculas proteicas
que tienen la capacidad de catalizar reacciones
químicas. Por su naturaleza proteica son inestables
y pueden ser desnaturalizadas por cambios en el
medio. Como la desnaturalización altera las
propiedades biológicas de las proteínas, la
actividad de las enzimas se afecta por muchas
variables, como temperatura, pH, concentración de
sustrato y de enzima y la presencia de inhibidores.
Los datos cinéticos disponibles para la fosfatasa
alcalina son difíciles de comparar, ya que los
valores de Vm y Km son función de la pureza de la
enzima, de la concentración en la mezcla de
reacción, del tipo de buffer empleado, del pH de la
mezcla de reacción y de la naturaleza y
concentración del metal activador. La fosfatasa
alcalina ejerce su acción a un pH elevado de 10. La
presencia de iones de Zn^2+ es necesaria para su
Mediante la elaboración de la curva de calibración
(gráfica 1), se pudo cuantificar la cantidad de
producto formado por acción de la enzima y la
velocidad de la reacción mediada por esta misma.
La curva de calibración muestra claramente que la
concentración de producto es directamente
proporcional a la absorbancia registrada. Es
importante destacar que las nuevas concentraciones
obtenidas a partir de la ecuación de la regresión
lineal y la ley de Beer, deben estar en el rango de la
curva de calibración, valores por fuera no se puede
garantizar que tenga un comportamiento lineal.
Con el fin de facilitar los cálculos de los parámetros
Km y Vmax, fue necesario linealizar con los
inversos de Lineweaver Burk. Para el caso del Km,
arrojó un valor de 4,57E-04 M, lo que representa.
La Vmax fue de 7,03E-04 [PNP]/min.
Ahora bien, la inhibición se define como la
disminución de la velocidad de la reacción
catalizada por una enzima, provocada por la
presencia de determinadas sustancias denominadas
inhibidores. Las enzimas pueden inhibirse
reversiblemente de manera competitiva y no
competitiva. En la inhibición competitiva, la unión
del sustrato y del inhibidor de la enzima son
mutuamente excluyentes. La inhibición competitiva
se caracteriza porque en presencia del inhibidor
cambia la Km pero no la Vmax. Por el contrario,
los inhibidores no competitivos cambian la Vmax
pero no la Km (6).
El fosfato inorgánico que se libera y el PNP, son
productos de la hidrólisis del PNPP por acción de
la fosfatasa alcalina, sin embargo estos también
pueden inhibir competitivamente la enzima. Al
tratarse de una inhibición competitiva, se dice que
la molécula inhibidora (Pi o el PNP), se une de
forma reversible al sitio de unión del sustrato en la
enzima, lo cual impide que el sustrato se una. Estos
inhibidores son muy semejantes al sustrato (PNPP)
y disminuyen la afinidad de la fosfatasa alcalina
con el PNPP (7).
En la sesión experimental, el inhibidor empleado
fue el Na2HPO4, ocasionando cambios en los
parámetros cinéticos. Para el caso del Km, se
obtuvo un valor de 2,14E-04M y para la Vmax
1,00E-03 [PNP]/min. Aquí, aunque los ds
parámetros se vieron modificados en presencia del
inhibidor, se puede observar un cambio más
drástico en la Vmax, concluyendo entonces que se
trata de una inhibición reversible no competitiva.
El objetivo del presente informe es comprender la
reacción básica de las fosfatasas, calcular los
parámetros cinéticos haciendo un seguimiento a la
formación de producto, considerando la influencia
de la concentración del sustrato y determinar el tipo
de inhibición que sufre frente a la presencia de
grupos fosfatos.
5. Conclusiones
● Se determinaron los parámetros cinéticos
de la fosfatasa alcalina, empleando un
método espectrofotométrico al seguir la
absorbancia arrojada por el producto
formado en la reacción que dicha enzima
cataliza.
● Todas las enzimas tienen sus condiciones
óptimas propias de cada una, bajo las
cuales se desarrolla la mayor actividad
catalítica, por lo que al estar presencia de
sustancias inhibitorias se ve afectada su
función y los parámetros cinéticos de la
reacción cambian en su valor.
● A partir de los cambios en los parámetros
cinéticos de una reacción es posible
identificar si existe inhibición y de qué
tipo se trata, pudiendo ser reversible o no.
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