CINTICA ENZIMTICA DE LA INVERTASA MEDIANTE LA DETERMINACIN DE LA

VELOCIDAD INCIAL DE REACCIN

Laura Buitrago*, Mara C. Prada**, Luz A. Velsquez***
*Ingeniera Qumica/ Fundacin universidad de Amrica, Bogot, Colombia
**Ingeniera Qumica/ Fundacin universidad de Amrica, Bogot, Colombia
***Ingeniera Qumica/ Fundacin universidad de Amrica, Bogot, Colombia
Email: lauriss_155@hotmail.com*, camilapg95@hotmail.com**, luanvego10@hotmail.com***

RESUMEN: En esta prctica de laboratorio, estudiamos la cintica enzimtica de la invertasa, determinando as sus
parmetros cinticos a partir de la velocidad de reaccin; para esto, se midi la absorbancia de soluciones de glucosa a
diferentes concentraciones, con el objetivo de desarrollar la curva de calibracin de la glucosa, como se ver desarrollado en
este informe. Posteriormente, buscamos determinar el efecto de concentracin del sustrato (sacarosa) sobre la actividad
enzimtica, midiendo la absorbancia a diferentes concentraciones.
PALABRAS CLAVES: Cintica enzimtica, invertasa, glucosa, sacarosa, y velocidad de la reaccin.
ABSTRACT: In this practice, we worked the kinetic enzymatical of the invertasa, determining this way the kinetic
parameters of this one from the speed of reaction; for this, we measured up the absorbance of solutions of glucose to
different concentrations, with the aim to develop the curve of calibration of the glucose, since one will see developed in this
report. Then, we sought to determine the effect of substrate concentration (sucrose) for enzyme activity by measuring the
absorbance at different concentrations.
KEYWORDS: Kinetic enzymatical, invertasa, glucose, saccharose and speed of reaction.
INTRODUCCIN:
La sacarosa, es un disacrido compuesto por una
molcula de alfa-D-glucosa y una de beta-D-fructosa,
unidas mediante un enlace glicosidico-alfa-1,4; Cuando
este enlace es desintegrado en una reaccin de hidrolisis,
se genera una mezcla de igual de igual nmero de
molculas de glucosa y fructosa. Esta mezcla es llamada
azcar invertido, ya que la sacarosa hace rotar el plano de
una luz polarizada hacia la derecha. Por el contrario la
hidrolisis del producto rota el plano de la luz polarizada
hacia la izquierda. La sacarosa puede ser hidrolizada en
presencia de una enzima llamada invertasa. El nombre
oficial de la invertasa es beta-fructofruransico. La
invertasa es usada en la industria de alimentos donde la
fructosa es preferida por encima de la sacarosa, debido a
que es ms dulce y no cristaliza tan fcilmente. Sin
embargo, el uso de la invertasa en esta industria es
limitada, debido a la existencia de otra enzima (glucosa
ismerasa), lo cual puede ser utilizada en convertir la
glucosa en fructosa disminuyendo los costos de
produccin. (1)
Un amplio rango de microorganismos producen invertasa
y de esta manera pueden utilizar la sacarosa como
nutriente. Comercialmente, la invertasa es producida por
saccharomyces
cereviciae
o
saccharomyces
carlsbergensis. Pueden existir, incluso en el mismo
cultivo diferentes formas de la invertasa. Por ejemplo,
una invertasa intracelular con peso molecular de 135.000

Daltons, por el contrario una extracelular con peso

molecular de 270.000 Daltons (1)
La invertasa puede exhibir una actividad relativamente
alta sobre un rango amplio de pH (3,5- 5.5) con el ptimo
en 4,5. La actividad enzimtica alcanza una velocidad
mxima a 55 C. Los valores de varias enzimas pueden
variar ampliamente, pero para la mayora de enzimas Km
se encuentra entre 2mM y 5 mM. El valor de la
constante de Michaelis- Menten para la enzima libre es
aproximadamente de 30mM (1)
En este experimento, la cintica de la invertasa es
investigada con el mtodo de las velocidades iniciales.
En este, la velocidad de reaccin puede ser
correlacionada con las condiciones existentes al inicio de
la reaccin, ya que uno tiene control sobre las
condiciones iniciales del experimento. La mezcla enzima
sustrato se hace reaccionar por determinado tiempo. La
velocidad de la reaccin puede ser calculada midiendo el
contenido de los productos de reaccin en una mezcla
equimolar de glucosa y fructosa. El contenido de
azucares reductores producidos, son determinados
colorimtricamente con el reactivo de DNS incluido en la
reaccin. El trabajo se hace sencillo, ya que el reactivo
no reacciona con la enzima. (1)
METODOS PARA LADETERMINACION DE LA
CONTRACION DE GLUCOSA EN UNA SOLUCION
ACUOSA.

Los mtodos para determinar la concentracin de glucosa

se clasifican en dos grandes grupos (2) :
a) Mtodos basados en el poder reductor de los hidratos
de carbono (reaccin de Benedict, mtodo de la otoluidina) (2)
b) Mtodos enzimticos: son los ms utilizados,
utilizan enzimas como reactivos (ej. glucosa oxidasa,
hexoquinasa) a fin de aumentar la especificidad. (2)
Los dos mtodos que SE VAN a citar se pueden
utilizar para determinar la glucosa en muestras de
suero, orina y lquido cefalorraqudeo

MATERIALES Y MTODOS

Para la determinacin de la curva de calibracin de

la glucosa equivalente, se prepararon 5 soluciones,
cada una en los tubos de ensayo, agregando un
volumen de solucin glucosa 2mg/ml, volumen de
agua destilada y concentracin de la glucosa, como
indica la tabla 1. Luego de eso se agitaron los 5
tubos y se extrajo 1ml a cada tubo, despus se
adiciono 1 ml de DNS, nuevamente se agitaron y se
incubaron en agua a 95C por 5 min; pasado este
tiempo los tubos de ensayo fueron colocados en un
vaso de precipitado con hielo y agua fra, luego de
esto se determin la absorbancia de cada tubo a 540
nm

Para el efecto de la concentracin del sustrato

inicial sobre la actividad enzimtica, se prepararon
5 soluciones, una en cada tubo adicionando solucin
de invertasa a 0.04 g/L, agua destilada y sacarosa
como indica la tabla 2. Luego de preparar las
soluciones se dej reaccionar por 15 min en el bao
termostatado a 60C. durante los 15 min se
prepararon 5 tubos de ensayo agregando a estos 1
ml de DNS. Al finalizar los 15 min de reaccin, se
colocaron los tubos en agua fra con hielo, luego se
agitaron uno por uno y se extrajo 1 ml a cada tubo,
agregndoselos a los tubos con DNS. Despus
fueron agitados y nuevamente incubados en agua a
95C durante 5 min, pasado este tiempo, se
colocaron los tubos en agua fra y despus se midi
la absorbancia de cada uno a 540nm. All se
determin la concentracin del azcar usando el
mtodo colorimtrico de DNS.

Mtodo de la hexoquinasa: Es el mtodo de

referencia y consiste en dos reacciones.

En la primera reaccin (especfica), catalizada

por la enzima hexoquinasa, se fosforila la
glucosa formndose glucosa 6-fosfato. La
glucosa 6-fosfato, en una reaccin posterior
(reaccin indicadora), se transforma en 6fosfogluconato producindose NADPH (1 mol
por cada molcula de glucosa). La produccin
de NADPH origina un aumento de absorbancia a
340nm. El incremento de absorbancia a esta
longitud de onda ser directamente proporcional
a la concentracin de glucosa. (2)

primera reaccin y evaluando la cantidad de

oxgeno consumido Mediante un electrodo de
oxgeno. La cantidad de glucosa en la muestra
es directamente proporcional a la cantidad de
oxgeno consumido. (2)

Mtodo de la glucosa oxidasa: Al igual que el

anterior consiste en dos reacciones acopladas En
la primera reaccin (reaccin especfica),
catalizada por la enzima glucosa oxidasa
(GOD), se oxida la glucosa y se genera H2O2.
En la segunda reaccin (reaccin indicadora), la
enzima peroxidasa (POD)
cataliza la
descomposicin del H2O2 lo que provoca
oxidacin de un cromgeno que pasa de su
forma reducida (incolora) a su forma oxidada
(coloreada). La aparicin del cromgeno
oxidado
se
evala
mediante
un
espectrofotmetro
y
ser
directamente
proporcional a la concentracin de glucosa en la
muestra. Este mtodo (GOD/POD) presenta
como desventaja que muchos compuestos
presentes en el suero u orina (bilirrubina, cido
ascrbico ycido rico) pueden ser oxidados por
el H2O2 producido en la reaccin catalizada por
la enzima GOD y por tanto interfieren en el
resultado (se da un resultado superior al real).
Tambin se puede cuantificar la concentracin
de glucosa de la muestra utilizando slo la

DATOS
Tabla 1. Soluciones para la curva de calibracin
Volumen
Tubo solucin
de
glucosa
ensayo 2 mg/mL
(mL)
1
0
2
1
3
2
4
3
5
4

Volumen
de agua
destilada
(mL)

Concentracin
glucosa (g/L)

Abs

6
5
4
3
2

0
0,030
0,061
0,091
0,121

0
0,024
0,298
0,629
0,997

g
* 1 mL
L
C2 =

(1 mL + 5 mL)

Tabla 2. Datos para la determinacin del efecto de

concentracin de sustrato (sacarosa)
Tubo
de
ensay
o
1

Soluci
Solucin
n
Agua invertas Concentraci
sacarosa desti.
a
n de sacarosa
140 g/L (mL) 0,04 g/L inicial (g/L)
(mL)
(mL)
0
3
3
0

23,3

46,7

70

0,182

Abs

0
0,00
5
0,01
4
0,01
4

C 1 * V1 = C 2 * V 2

g
* 2 mL
L
C2 =

(2 mL + 4 mL)

C2 =

C1 * V1
V2

C2 = 0,061

g
L

Tubo 4:

C 1 * V1 = C 2 * V 2

Se realiz una dilucin de 10 mL de solucin de glucosa

a 2 mg/mL en 100 mL de agua destilada dando como
resultado las siguientes concentraciones de glucosa:

C1 =

g
* 3 mL
L
C2 =

(3 mL + 3 mL)

C2 * V2
V1

Determinacin concentracin de glucosa en los

diferentes tubos
Tubo 1:

g
* 0 mL
L
C2 =

(0 mL + 6 mL)

C * V1
C2 = 1
V2

0,182

C2 = 0

C2 =

C1 * V1
V2

C2 = 0,091

g
L

Tubo 2:

C 1 * V1 = C 2 * V 2

g
L g
0,182
* 4 mL
L
C2 =

(4 mL + 2 mL)

C2 =

C1 * V1
V2

C1 = 0,182

C2 = 0,121

Grfica curva de calibracin

1.2
1
0.8
Absorbancia 0.6
0.4
0.2
0

f(x) = 8.54x - 0.13

R = 0.94

0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14

Concentracin de glucosa (g/L)

C2 =

g
L

Tubo 5:

mg 1000 mL 1 g
2
*
*
* 10 mL
mL 1 L
1000 mg
C1 =

110 mL

0,182

Determinacin concentracin inicial

C1 * V 1 = C2 * V 2

0,182

CURVA DE CALIBRACIN

C1 * V 1 = C2 * V 2

g
L

Tubo 3:

CLCULOS Y RESULTADOS

C1 * V 1 = C2 * V 2

C2 = 0,030

C1 * V1
V2

Figura 1. Curva de calibracin

EFECTO CONCENTRACIN DE SUSTRATO

g
L

 Calculo de concentracin de sacarosa inicial en g/L

(Ci - C1)
UA
MM glucosa
=
* D
L
t

Tubo 1 (blanco)

C2 =

Calculo de actividad enzimtica

0 mL * 140 g/L
= 0 g/L
6mL

Tubo 2:

Tubo 1:

( 0,015161057 - 0 )

1mL * 140 g/L

C2 =
= 23,3 g/L
6mL

180,16

C2 =

UA
=
L
15 min

Tubo 3:

2mL*140 g/L
= 46,7 g/L
6mL

g
L

g
mol

*1=0

Tubo 2:

Tubo 4:

C2 =

( 0,015744175 -

3mL * 140 g/L

= 70 g/L
6mL

g
180,16
UA
mol
=
L
15 min

Calculo de la concentracin de glucosa en g/L por

medio de la absorbancia

y = 8,5746 x - 0,13 x=

y + 0,13
8,5746

Tubo 3:

( 0,016793786 - 0 )
Donde y = absorbancia y x= concentracin de glucosa
en g/L

mol
L*min

g
L

g
180,16
UA
mol
=
L
15 min

Tubo 1 (blanco):

* 1 = 6,2144E-06

mol
L*m

* 1 = 6,2144E-06

mol
L*m

X = 0 g/L

Tubo 2:

0,005 + 0,13
g
X =
= 0,015744175
8,5746
L

X =

X =

Tubo 3:

0,014 + 0,13
g
= 0,016793786
8,5746
L
Tubo 4:

0,014 + 0,13
g
= 0,016793786
8,5746
L

Tubo 4:

( 0,016793786 - 0 )
180,16

UA
=
L
15 min

g
mol

g
L

Grfica concentracin sustrato inicial vs actividad enzimtica

0
0
0
0
Actividad enzimatica 0
0
0
0

Vmax = 6,4969 E-06

mol
min

Km

Km
= 403469 Km = 403469* V max
V max
0

Km = 403469* ( 6,4969 E-06 ) Km = 2,621307 M

10 20 30 40 50 60 70 80
Concentracin sustrato inicial (g/L)

Figura 2. Concentracin de sustrato inicial contra

actividad enzimtica

Calculo eficiencias:

Tubo 1 :

0g mol sacarosa
1 mol de glucosa 180,15
*
*
*
L 342,29 g sacarosa 1 mol de sacarosa 1 mol

Grfica 1/S vs 1/V

175000
170000

concentracin terica de glucosa=0

f(x) = 403469.3x + 153919.34

R = 0.94

1/V 165000

160000
155000
0.01

0.02

0.02

0.03

0.03

0.04

0.04

g
L

Tubo2:

23,3g mol sacarosa

1 mol de glucosa 180
*
*
*
L
342,29 g sacarosa 1 mol de sacarosa 1 m

0.05

1/S

g
L

Figura 3. 1/S contra 1/V

concentracin terica de glucosa=12,26

Tabla 3. Concentraciones de sustrato inicial y actividades

enzimticas

concentracin real de glucosa= 0,015744175 g/L

S
(Concen.
sustrato
inicial)
0
23,3
46,7
70

1/S

V
(Actividad
enzimtica)

1/V

0,04291845
0,02141328
0,01428571

0
5,826E-06
6,2144E-06
6,2144E-06

171644,4373
160916,66
160916,66

Y = 403469 x + 153919 de la forma:

1 1
Km
1
=
+
*
v v max v max s

= 153919

%eficiencia=

concentracin real
*100
concentracin terica
0,015744175
*100=0,128%
g
12,26
L

Tubo3:

46,7g mol sacarosa

1 mol de glucosa 180
*
*
*
L
342,29 g sacarosa 1 mol de sacarosa 1 m

V max

1
Vmax

% eficiencia=

concentracin terica de glucosa=24,58

1
= Vmax
153919

g
L

concentracin real de glucosa= 0,016793786g/L

% eficiencia=

%eficiencia=

concentracin real
*100
concentracin terica
0,016793786
*100=0,068%
g
24,58
L

es la menos diluida, por lo cual, disperso una menor

cantidad de luz. Adicionalmente, la tabla 1 muestra el
clculo de las concentraciones de glucosa debido a que se
realiz una dilucin de 10 mL de solucin de glucosa en
100 mL de agua destilada; con este clculo se puede
concluir que a mayor concentracin de glucosa, mayor
absorbancia se registrar.

Al graficar la curva de calibracin, la cual presenta

tendencia lineal, es evidente una recta con pendiente
positiva que responde a la ecuacin Y = 8,5397 X 0,129
70g mol sacarosa
1 mol de glucosa 180,15
g de glucosa
*
*
* y presenta un R2 de 0,9382
= que indica un gran ajuste de
L
342,29 g sacarosa 1 mol de sacarosa 1los
mol
de glucosa
datos.
Esta ecuacin modelar el comportamiento de
la concentracin de glucosa la cual fue utilizada para
g
concentracin te rica de glucosa=36,84
calcular la actividad enzimtica, en este caso de la
L
enzima invertasa, la figura 2 muestra que el mayor valor
de actividad enzimtica se presenta a una concentracin
concentracin real de glucosa= 0,016793786 g/L
de sustrato de 23,3 g/L (tal como est registrado en la
tabla 2) y que luego presenta un valor constante de a los
diferentes valores de concentracin de sustrato inicial
concentracin real
% eficiencia=
*100
hallados. La actividad de la invertasa puede verse
concentracin terica
afectada por el valor de pH manejado en la prctica el
cual fue de 4.5, siendo el ptimo en 4.6 (1) pero teniendo
0,016793786
un rango de funcionalidad entre 3.5 y 5.5.
%eficiencia=
*100=0,0455%
Adicionalmente, en la prctica se manej una
g
36,84
temperatura entre 55 C y 60 C, la cual fue buena
L
temperatura debido que la actividad enzimtica de esta
enzima alcanza una velocidad mxima a 55 C, (1)

Tubo4:

DISCUSIN: ANLISIS DE RESULTADOS

El mtodo de velocidades iniciales utilizado para esta
prctica de laboratorio permite calcular la cintica de la
enzima, consiste en tomar la velocidad al inicio de la
reaccin, donde los reactivos no se han consumido en
gran proporcin y as correlacionar la velocidad con las
condiciones existentes al inicio de la reaccin ya que
estas son de fcil control (1). Para el desarrollo de este
laboratorio se utiliz una curva de calibracin para la
determinacin de la concentracin de glucosa mediante
las absorbancias medidas utilizando la tcnica de
espectrofotometra; esta tcnica utiliza un rayo de luz que
incide en una muestra, parte del rayo es reflejado y otra
parte absorbido, a mayor concentracin de azcar o
partculas en suspensin, mayor ser la luz absorbida. (3)
En la prctica se estableci un valor de 540 nm para la
medida de las absorbancias tanto en la curva de
calibracin como para la concentracin de sustrato, para
la primera se leyeron cinco muestras tal como indica la
tabla 1, utilizando como blanco (muestra de todos los
componentes menos el que se desea medir (4)) el primer
tubo, es decir, el que no posea solucin de glucosa. En la
toma de las absorbancias de la curva de calibracin se
obtuvo que el mayor valor perteneca a la muestra con
mayor cantidad de solucin de glucosa, esto debido a que

La ecuacin de la grfica 3 (1/S contra 1/V), permite

calcular la velocidad mxima alcanzada as como la
constante de Michaleis-Menten, que se define como la
concentracin de sustrato en la cual la velocidad de la
reaccin es la mitad de la velocidad mxima (5), tambin
puede indicar la afinidad de la enzima por el sustrato,
valores bajos de Km indican una alta afinidad, mientras
que los valores altos representan una baja afinidad. (6)
De acuerdo a los clculos realizados, se encuentra que la
velocidad mxima es: 6,4969 x 10 -6 mol/min y que la
constante de Michaelis-Menten (Km) es de 2,621307
Mmol, de acuerdo a la literatura se tiene que para la
mayora de las enzimas este ltimo valor vara entre 2
Mmol y 5 Mmol, por lo cual la invertasa cumplira y
estara dentro del rango ptimo propuesto, aunque, existe
un valor adicional con el cual se podra realizar un
anlisis, en la etapa de enzima libre, el cual es un estado
que alcanza la enzima cuando el complejo sustratoenzima se descompone (6), tal como se puede apreciar en
la figura 4; para este estado el valor de la Km oscila
alrededor de 30 Mmoles, valor al que la enzima tratada
en el laboratorio no pudo llegar ya que como se analiza
en los clculos, arroja valores pequeos; esto puede
ocurrir por una falta de actividad de la enzima que se ve
reflejada en el bajo valor de a constante de MichaelisMenten.

enzimtica de la invertasa mediante la

determinacin de la velocidad inicial de
reaccin. Bogot : s.n., 2014.

Figura 4. Enzima libre. Tomada de:

http://www.bionova.org.es/biocast/tema14.htm
Por ltimo, podemos decir que los porcentajes de
eficiencias de las muestras son muy bajas puesto que las
concentraciones reales son mucho menores que las
esperadas tericamente, lo que indicara que la invertasa
como enzima no logro convertir toda la sacarosa en una
mezcla equimolar de glucosa y fructosa sino solo una
pequea parte del total.
CONCLUSIONES

La espectrofotometra es una tcnica precisa en la

medicin de la concentracin.
A mayor concentracin de glucosa, mayor valor de
absorbancia.
Las variables que pueden afectar la actividad
enzimtica son el pH y la temperatura.
Las condiciones ptimas para el proceso son pH de
4.6 y temperatura a 55 C.
La constante de Michealis-Menten analiza la
concentracin de sustrato en la cual la velocidad de
la reaccin es la mitad de la velocidad mxima.
La velocidad mxima de la invertasa en este
laboratorio fue de 6,4969 x 10 -6 mol/min.
La constante de Michaelis-Menten para este
laboratorio fue de 2,621307 Mmol

REFERENCIAS

1. Facultad de ingenierias,
Universidad de Amrica. Cintica

2. Relacionados, Anlisis glucosa y

parmetros. Mtodos de determinacin
de la concentracin de glucosa. [En lnea]
2010. [Citado el: 3 de Noviembre de
2015.]
http://www4.ujaen.es/~esiles/TEMA
%202.pdf.
3. Caballero, Manuel Arturo.
Slideshare. [En lnea] 23 de Diciembre de
2013.
http://es.slideshare.net/arturo.caballero/e
spectrofotometra-29439943.
4. Coto, Celia. Curso de Introduccin al
conocimiento cientfico experimental. [En
lnea] 2003.
http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/co
ntratapa/aprendiendo/capitulo2.htm.
5. Contreras, Edgar Vzquez.
Bioqumica y biologa molecular en lnea.
[En lnea] 01 de Octubre de 2003.
http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazque
z/0403/ecuacion%20de
%20michaelis3.html.
6. Portn, Alejandro. Curso de biologa,
Enzimas. [En lnea] 2013.
http://www.bionova.org.es/biocast/tema1
4.htm.