“Año del Buen Servicio al Ciudadano”

UNIVERSIDAD NACIONAL
AGRARIA LA MOLINA

INFORME N°1
ACTIVIDAD DE FOSFATASA
ÁCIDA EN HÍGADO DE POLLO
CURSO: Enzimología
FECHA: Lunes 10 de Abril del 2017
PROFESORA: Kitazono Sugahara, Ana Akemi
INTEGRANTES: Morón Guerra, Laura (20150109) 25%
Maynetto Vílchez, Brenda (20150108) 25%
Ccoyllo Terrones, Edwin (20150092) 25%
Rojas Torrejón, Martín (20150114) 25%
GRUPO: B*

LIMA-PERÚ

2017-I
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 ACTIVIDAD DE FOSFATASA ÁCIDA EN HÍGADO
Laboratorio de Enzimología

I. INTRODUCCION:

Las fosfatasas ácidas son enzimas ampliamente distribuidas en casi todos los
tejidos del organismo, siendo particularmente altas las cantidades de estas
enzimas en próstata, estómago, hígado, músculo, bazo, eritrocitos y plaquetas;
y tienen la propiedad de hidrolizar fosfomonoésteres a pH 5.0, liberando como
productos de la reacción un alcohol y fosfato inorgánico (Medicentro.com.co,
2017).
Este tipo de enzima es usado para liberar grupos fosfatos adheridos a otras
moléculas. Se almacena en los lisosomas y funcionan cuando estos se unen a
los endosomas, los cuales tienen un pH ácido. De ahí que su actividad sea
óptima en pH ácidos.
Cuando se compara los valores de kcat/Km de las fosfatasas de hígado, nos
permite sugerir que estas enzimas tienen elevada afinidad por el sustrato p-
nitrofenilfosfato. Los productos que se liberan durante la catálisis por fosfatasa
ácida, muestran que el fenol o el p-nitrofenol se comportan como inhibidores de
tipo no competitivo, mientras que el fosfato inorgánico muestra una inhibición de
tipo competitiva (Haak, 1989).

II. MATERIALES Y MÉTODOS:

2.1. EQUIPOS Y MATERIALES:

 Homogenizador de tejidos,
 Espectrofotómetro
 Vortex
 Baño María (37°C)
 Pipetas
 Tubos de ensayo
 Gradillas

2.2. REACTIVOS:

 Buffer acetato 0.01M, pH: 5.0, conteniendo EDTA 0.0001M.

 P-nitrofenilfosfato 0.036M (sustrato): solo se prepara la cantidad
necesaria disolviendo el reactivo en agua destilada.
 NaOH 1M.

2.3. PREPARACIÓN DEL EXTRACTO CRUDO DE HÍGADO:

1. Poner 6g de hígado de pollo en hielo por 10 minutos (condición hipo-

osmóticas: se rompen los lisosomas que tienen la enzima y queda soluble).

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Laboratorio de Enzimología

2. Agregar 24mL de buffer acetato y utilizar el homogenizador. Se mantiene en

hielo durante la homogenización.
3. Cuando ya está homogéneo, centrifugar por 15 minutos 6000g a 4°C.
4. Separa el sobrenadante y anotar el volumen (no sedimento).

2.4. ENSAYO DE LABORATORIO:

1. Colocar en tres tubos de ensayo (blanco muestra (B), muestra (M),

repetición de muestra (RM)) 2.5mL de buffer acetato.
2. Añadir a cada uno de los tubos 0.2mL de p-nitrofenilfosfato 0.036M.
3. Pre-incubar los tubos a 37°C por 5 minutos.
4. Agregar 0.1mL de extracto crudo a los tubos M y RM, con un intervalo de 30
segundos entre tubos.
5. Incubar por 2 minutos a 37°C.
6. Terminando los 2 minutos se añade 1mL de NaOH 1M a los tubos M y RM,
intervalo de 30 segundos entre tubos.
7. Al tubo B, se agrega 1mL de NaOH 1M y después 0.1mL de extracto crudo.
8. Sacar los tubos de baño maría.
9. Se realizan las lecturas de absorbancia a 402nm, llevando el
espectrofotómetro a ‘0’ con agua destilada.

III. RESULTADOS:

Figura 1: Tubo blanco (B), tubo de muestra (M) y tubo de repetición de muestra
(RM)

Fuente: Propia

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LECTURAS DE ABSORBANCIA (=402 nm)

MESA 1 MESA 2 MESA 3 MESA 4 MESA 5 PROMEDIO

H2O “0”

B 0.204 - 0.192 0.353 0.252 0.303 0.269

M 2.483 2.279 3.068 2.014 1.896 1.191 2.131

RM 2.455 2.251 2.427 2.085 2.129 1.220 2.223

*Para el promedio se descartan las mesas 2 y 5.

En base a las absorbancias obtenidas en la tabla superior y a los cálculos hechos en
la siguiente sección, podemos decir que la fosfatasa ácida tiene una activad
enzimática de 1.97 U/mL de extracto crudo.

IV. CÁLCULOS:

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V. DISCUCIONES:

La fosfatasa ácida (término referido a la fosfatasa ácida de bajo peso molecular) es una
enzima fosfohidrolasa de ésteres ortomonofosfóricos con nomenclatura EC 3.1.3.2, que
actúa sobre monoésteres de fosfato produciendo un alcohol y un anión ortomonofosfato
(fosfato inorgánico). También cataliza reacciones de transfosforilación (Union
Internacional de Bioquímica y Biología Molecular - IUBMB, en ingles)
Para la experiencia de laboratorio se usó el buffer Acetato 0.01 M pH 5.0 y se trabajó a
una temperatura promedio de 37°C con el fin de propiciar las condiciones óptimas a las
que la fosfatasa ácida de bajo peso molecular de hígado de pollo (Gallus gallus
domesticus) cataliza las reacciones de hidrolisis. Se usó como sustrato artificial p-
nitrofenilfosfato, aprovechando la amplia especificidad de la enzima (IUBMB). La
reacción se describe en la figura 2.
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Figura 2: Reacción de p-nitrofenil fosfato con la Fosfatasa ácida de bajo peso

molecular

Guija, Soberón, & Haak-Mares, 1989, 1993, 1995, 2007, quienes han realizado diversos
trabajos de investigación sobre las fosfatasas ácidas de bajo peso molecular
demuestran que a las condiciones de ensayo (buffer acetato o maleato 0.05M pH 5.0)
estas enzimas muestran una alta afinidad por el sustrato artificial p-nitrofenilfosfato
comparando los valores de Km así como los de kcat/Km, que vincula la velocidad de
reacción en función de la concentración de enzima libre. Así mismo indican que el Km
es muy similar para fosfatasas acidas de otras fuentes como hígado de alpaca, bovino,
porcino, rata y cerebro de bovino.

Luego de procesar los datos de Absorbancias del p-nitrofenolato medidas a =402nm

en el espectrofotómetro y correlacionarlos con la cantidad obtenida de producto (p-
nitrofenol), la actividad enzimática para la Fosfatasa ácida de bajo peso molecular de
hígado de pollo fue de 1.97 U/mL de extracto crudo.
Según la base de datos BRENDA de la Universidad Técnica de Braunschweig la
fosfatasa ácida para el organismo Gallus gallus presenta un pH óptimo de 5.3, actividad
específica de 18 μmol/min/mg y puede ser extraída de tejido de hígado y del musculo
pectoral.
Haak Mares, Guija Poma, & Soberon, 1989 indican que la Fosfatasa ácida de bajo peso
molecular presenta un pH óptimo de 5.0, en el cual los parámetros cinéticos de la
reacción con el sustrato artificial p-nitrofenilfosfato son: Km = 8.66 x 10 -5 M y Vmáx =
0.04 μmoles/min.
Según Khan, Naz, Hassan, & Saeed, 1996 una fosfatasa ácida de bajo peso molecular
de hígado de oveja (Ovis orientalis aries) presenta una actividad enzimática de 1.56
U/mg. Comparando este valor con el obtenido en la experiencia de Laboratorio de
hígado de pollo, se tiene una variación +26.3% de con respecto al valor citado. Se debe
tener en cuenta que los resultados pueden verse afectados por la inadecuada
preparación de los materiales como por ejemplo el correcto congelamiento del hígado
de pollo para evitar la contaminación, putrefacción y accionar de otras enzimas
hidrolíticas que pudiesen variar el resultado del experimento. Además las mediciones
de actividad enzimática deben hacerse considerando los periodos de incubación
midiéndolos con especial cuidado y precisión para evitar errores.

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Figura 3: Purificación de Fosfatasas ácidas de bajo peso molecular Relativo de

hígado de oveja

Fuente: The Low and High Molecular Weight Acid Phosphatases in Sheep Liver.
Khan, Naz, Hassan & Saeed (1996)

Según Guija, Soberón, & Haak-Mares, 2007 el uso de sustratos de origen biológico
permite observar que las fosfatasa acidas de bajo peso molecular purificadas de
diversas fuentes exhiben muy poca acción hidrolítica sobre estos en las condiciones de
ensayo utilizadas (buffer Acetato o Maleato pH 5.0) por lo que podemos afirmar que en
condiciones fisiológicas la fosfatasa ácida de bajo peso molecular presenta un pH
óptimo distinto al del ensayo.
La Guía de Laboratorio de Bioquímica de la Universidad Nacional del Rosario-UNR
propone que debido al pH óptimo de las fosfatasas acidas (alrededor de 5.0) no se
podría realizar una medida de actividad enzimática con aparición de p-nitrofenol pues
se vería la interferencia del p-nitrofenilfosfato, como se observa en la figura 2. Por ello
las medidas se realizan a pH 6.5, no se ve la actividad máxima de la enzima (no es su
pH óptimo de catálisis), pero se puede detectar casi sin interferencias la aparición de p-
nitrofenol a 405 nm.

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Figura 2: Espectro de Absorción de p-nitrofenol y p-nitrofenil fosfato a pH de

2.28 y 9.18

Fuente: Guía de Laboratorio de Bioquímica - UNR

El medio en el que se dio la reacción contenía además EDTA 0.0001 M, según la Guía
de Laboratorio de Bioquímica de la Universidad Nacional del Rosario (UNR) el EDTA es
un agente quelante que secuestra metales pesados que potencialmente podrían inhibir
la actividad enzimática. El Instituto Nacional del Cáncer de los Estados Unidos (NCI, en
ingles) define al Ácido etilendiaminotetraacético – EDTA como agente quelante con
propiedades anti-hipercalcémicas y anticoagulantes, que se une al calcio e iones de
metales pesados, formado complejos estables solubles que son fácilmente excretados
por los riñones reduciendo los niveles de calcio en suero.

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Laboratorio de Enzimología

VI. BIBLIOGRAFÍA:

Guía de Laboratorio de Bioquímica . (s.f.). Santa Fe: Facultad de Ciencias Bioquímicas

y Farmaceutica-Universidad Nacional del Rosario.
Guija, E., Soberón, M., & Haak-Mares, H. (2007). Mecanismo de acción de las fosfatasas
ácidas de bajo peso molecular. Anales de la Facultad de Medicina Universidad
Nacional Mayor de San Marcos, 68(4), 356 - 362.
Haak Mares, H., Guija Poma, E., & Soberon L., M. (Diciembre de 1989). Mecanismo de
accion de la fosfatasa acida de higado de bovino. Boletín de la Sociedad Química
del Perú, 55(4), 209-219.
Haak Mares, H., Guija Poma, E., & Soberon L., M. (Septiembre de 1993). Purificación y
propiedades de la Fosfatsa ácida de bajo peso molecular de hígado de pollo.
Boletín de la Sociedad Química del Perú, 59(3), 149-157.
Haak Mares, H., Guija Poma, E., & Soberon L., M. (Marzo de 1995). Influencia del pH
sobre la hidrolisis de fosfomonoestres catalizada por fosfatsa acida de higado de
porcino. Boletin de la Sociedad Química del Perú, 61(3), 13-19.
Haak Mares, H., Guija Poma, E., & Soberon L., M. (2007). Mecanismo de acción de las
fosfatasas ácidas de bajo peso molecular. Anales de la Facultad de Medicina
Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 68(4), 356 - 362.
Haak Mares, H., Guija Poma, E., & Soberon, M. (Diciembre de 1989). Mecanismo de
accion de la fosfatasa acida de higado de bovino. Boletín de la Sociedad Química
del Perú, 55(4), 209-219.
IUBMB. (13 de Abril de 2017). Enzyme Database. Obtenido de http://www.enzyme-
database.org: http://www.enzyme-
database.org/query.php?name=acid+phosphatase
Khan, A., Naz, R., Hassan, M., & Saeed, A. (10 de Octubre de 1996). The Low and High
Molecular Weight Acid Phosphatases in Sheep Liver. Obtenido de
http://jcsp.org.pk/ArticleUpload/1907-8530-1-PB.pdf
Medicentro.com.co. (13 de abril de 2017). FOSFATASA ACIDA. Obtenido de:
http://www.medicentro.com.co/lab-clinico/analisis/a_f/FOSFATASA_ACIDA.html
NCI. (13 de Abril de 2017). NCIthesaurus. Obtenido de
https://ncit.nci.nih.gov/ncitbrowser/:
https://ncit.nci.nih.gov/ncitbrowser/ConceptReport.jsp?dictionary=NCI_Thesaur
us&ns=NCI_Thesaurus&code=C61742
TUBraunschweig. (13 de Abril de 2017). BRENDA. Obtenido de http://www.brenda-
enzymes.info: http://www.brenda-
enzymes.info/enzyme.php?ecno=3.1.3.2&Suchword=&reference=&UniProtAcc
=&organism%5B%5D=Gallus+gallus&show_tm=0