Laboratorio Nº 1

“Preparación de soluciones”

Nombre: Nicolas Ignacio Seron Valdes

Año: 2023
Semestre: 1

Laboratorio: BIOL 261

Sección: 2
NRC: 1587
 Introducción
Las muestras de laboratorio en muy raras ocasiones se realizan en seco, comúnmente se preparan
soluciones del analito de interés para la formulación de las muestras. Las soluciones o disoluciones
corresponden a una mezcla homogénea de dos o más componentes, entre un soluto (componente
en menor proporción) y un disolvente (componente en mayor proporción). El soluto corresponde
al analito y reactivos a utilizar, mientras que el solvente puede ser de distintos tipos. Los principales
solventes utilizados son las cetonas, alcoholes, acetatos, aromáticos, alifáticos, halogenados y
glicoles. El solvente por utilizar se determina a partir de la solubilidad de los reactivos y su
composición química.

Procedimiento

Se pesaron 15,1 g de
Tris base en balanza
analítica

Se pesaron 94 g de Se mezclan los solutos Buffer Tris glicina

glicina en balanza con los solventes solución stock 1 L
analítica

Se sacaron 50 ml de
solución SDS al 10%

Observaciones: Se debió agregar NaOH 1 M para hasta alcanzar un pH de 8.3

Resultados
Masa pesada de Tris= 15,15 g

SDS= 5,01 g

50 mL de SDS al 10% = 10 𝑔 𝑑𝑒 𝑆𝐷𝑆/100 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 *50 mL= 5 g de SDS

Conclusión
En conclusión, la formulación de una correcta solución va a depender de las concentraciones de los
reactivos que la componen, una solución muy concentrada o muy diluida no dará los mismos
resultados, pudiendo producir un exceso o ausencia del efecto deseado.
 Laboratorio Nº 2

“Cuantificación de proteínas”

Nombre: Nicolas Ignacio Seron Valdes

Año: 2023

Semestre: 1
Laboratorio: BIOL 261
Sección: 2
NRC: 1587
 Introducción
Existen distintos métodos para la cuantificación de proteínas, basados en la absorbancia de las
muestras mediante el uso de un espectrofotómetro. Algunos de los métodos más utilizados para la
cuantificación de proteínas son el método de Bradford, método de Biuret, método de Lowry, ácido
bicinconínico y absorción ultravioleta.

Método de Biuret: Se basa en la formación de un complejo coloreado entre Cu2+ y los grupos NH
de los enlaces peptídicos, por lo que la intensidad de la coloración es directamente a la cantidad de
proteínas en la muestra. Se mide a 540 nm y su sensibilidad es de 1 – 20 mg de muestra.

Método de Bradford: se utiliza un reactivo azul Coomassie que se une a proteínas con carga
positiva, uniéndose principalmente a residuos aminoacídicos de arginina, histidina, triptófano,
tirosina y fenilalanina. Se mide a 595 nm y su sensibilidad es de 0 - 30 ug de muestra.

Procedimiento

Se preparó una curva de Se agrego a un tubo 1 mL de

calibración con 6 soluciones
de distintas concentraciones
de BSA, añadiendo reactivo
de biuret y midiendo su
absorbancia a 540 nm
muestra problema de
concentración desconocida y le
agregamos 4 mL del reactivo de
Biuret, se dejó desarrollar color
durante 30 min
Se midió su absorbancia a
540 nm para poder
determinar la concentración
de proteínas en la muestra

Se preparó una curva de Se tomaron 600 µg de

calibración con 7 soluciones
de distintas concentraciones
de BSA, añadiendo reactivo
de Bradford y midiendo su
absorbancia a 595 nm
muestra problema y se
colocaron en un tubo para
enrasar hasta los 0,5 mL y
agregar 5 mL del reactivo de
Bradford,
Se midió su absorbancia a
540 nm para poder
determinar la concentración
de proteínas en la muestra

Resultados
Método de Biuret
Método de Bradford

Observación: En la realización de la curva de calibrado se debió eliminar un dato en cada

método de cuantificación, eliminando la muestra Nº5 en Biuret y la muestra Nº3 en
Bradford. Esto con el objetivo de mantener el conjunto de datos mas cercanos a la
linealidad.
Conclusión

comprendimos cómo realizar una correcta cuantificación de proteínas en base a métodos

espectrofotométricos, técnica muy relevante debido al gran impacto fisiológico que producen
estas biomoléculas en cualquier organismo.
 Laboratorio Nº 3

Enzimología - Parte 1
“Determinación de condiciones de velocidad
inicial”

Nombre: Nicolas Ignacio Seron Valdes

Año: 2023
Semestre: 1

Laboratorio: BIOL 261

Sección: 2
NRC: 1587
 Introducción
Las enzimas son moléculas constituidas, en su mayoría por proteínas, que tienen como
principal función catalizar las reacciones químicas que se llevan a cabo en los organismos.
Esto lo llevan a cabo disminuyendo la energía de activación necesaria para que la reacción
se produzca.
Las fosfatasas son enzimas que catalizan la hidrolisis de mono ésteres de fosfato, liberando
fosfato inorgánico en el proceso. Estas poseen una amplia especificidad frente a sustratos
y se clasifican según su pH optimo de funcionamiento, habiendo fosfatasas acidas y
alcalinas.
El p-nitrofenilfosfato es hidrolizado mediante una fosfatasa acida a p-nitrofenol y el fosfato
inorgánico resultante. El p-nitrofenol en medio alcalino se transforma en p-nitrofenolato,
un compuesto amarillo que posee un máximo de absorción a 405 nm.
Procedimiento

Se realizo una curva de calibración a Se llevaron las 5 muestras Fueron retiradas a

partir 5 muestras que contenían 2 a un baño termorregulado tiempo 0,5,10,15 y
ml de buffer citrato, 200 uL de NPP a 37ºC por 5 min, 30 min, deteniendo
10mM posteriormente se les la reacción con 2 ml
añadió 70 uL de enzima de NaOH

Se midieron las muestras en el

espectrofotómetro a 406 nm

Resultados

[S] uM ABS
2,50E+01 0,015
5,00E+01 0,025
1,00E+02 0,044
5,00E+02 0,231
 Conclusión
En este proceso se investigó la acción de la enzima fosfatasa acida sobre pNPP. Se
realizaron dos curvas, una de calibración y otra de actividad enzimática, lo que permitió
determinar las condiciones de Vo.
 Laboratorio Nº 4

Enzimología - Parte 2
“Determinación de parámetros cinéticos”

Nombre: Nicolas Ignacio Seron Valdes

Año: 2023

Semestre: 1
Laboratorio: BIOL 261
Sección: 2
NRC: 1587
 Introducción
Las enzimas poseen dos parámetros cinéticos que determinan el grado de afinidad de la
enzima por el sustrato y la velocidad con la que el complejo enzima-sustrato es capaz de
generar producto. Estos parámetros cinéticos son la Km y la Vmax. La Km (constante de
Michaelis-Menten) se define como la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la
reacción es ½ de la Vmax. La Vmax se define como la velocidad máxima a la que la enzima
puede formar producto estando saturada con sustrato.
Procedimiento
Ensayo Enzimático

Se añade 1 ml de enzima
Se incuban las muestras
Se prepararon 5 tubos con (fosfatasa acida) y se
en un baño
buffer citrato-EDTA + NPP extraen 1 mL de alícuota a
termorregulado a 37ºC
2,5 mM tiempos 0, 5, 10, 15, y 30
durante 5 min
min.

La muestra de alícuota
Se midió su absorbancia a
extraída se vierte un 5 ml
405 nm
de NaOH 20 mM

Resultados

[S] uM V 1/S 1/V

0 0 0,04 294,11
2,50E+01 3,40E-03 0,02 340,14
5,00E+01 2,94E-03 0,01 119,04
1,00E+02 8,40E-03 4,00E-03 77,52
2,50E+02 0,0129
5,00E+02 3,80E-02
 Conclusión
Los parámetros cinéticos obtenidos proporcionan información valiosa sobre la eficacia y
velocidad de la enzima. Además, los resultados obtenidos fueron coherentes con la
bibliografía vista.
 Laboratorio Nº 5

Enzimología - Parte 3
“Efecto de la temperatura en la reacción”

Nombre: Nicolas Ignacio Seron Valdes

Año: 2023

Semestre: 1
Laboratorio: BIOL 261
Sección: 2
NRC: 1587
 Introducción
La acción enzimática se ve mermada por varios factores externos, entre ellos encontramos
el pH, que afecta su efectividad al cambiar las cargas de los residuos aminoacídicos que
componen a la enzima, los inhibidores, que afectan los parámetros cinéticos de la enzima
(Km y Vmax) y por último, la temperatura, que es la variante estudiada en este laboratorio.
La temperatura afecta la actividad enzimática fuera de su rango optimo, disminuyéndola si
la temperatura disminuye o aumenta, en el caso de que la temperatura aumente
demasiado la enzima puede desnaturalizarse, perdiendo completamente su funcionalidad.
Procedimiento

Se prepararon 5 muestras Se diluyo la

Se incubaron a
con 2 ml de buffer citrato y enzima stock a
25ºC por 5 min
“x” ml de pNPP 2,5 mM 10 ml con
albumina

Pasados 15 min se removió

Pasados los 5 min se Se midio su
1 ml de alícuota,
añadió 1 ml de absorbancia a
añadiéndolos a un tubo con
enzima a cada tubo 405 nm
5 ml de NaOH

Resultados

[S] uM ABS
2,50E+01 0,015
5,00E+01 0,025
1,00E+02 0,044
5,00E+02 0,231

Conclusión
En conclusión, este laboratorio permitió estudiar cómo diversos parámetros afectan la
actividad enzimática, incluyendo la presencia de inhibidores cinéticos y cambios en la
temperatura de reacción. Los resultados obtenidos fueron coherentes con los
 conocimientos teóricos previos y demostraron que el cambio en la temperatura sí influye
en los parámetros cinéticos de la enzima. Este hallazgo destaca la importancia de controlar
cuidadosamente las condiciones de reacción y cómo los cambios en la temperatura
pueden afectar significativamente la actividad enzimática y los resultados obtenidos.