Universidad Nacional de Quilmes

Introducción a la Biología Celular y Molecular

Trabajo Práctico No 7
Trabajo Práctico: Regulación de la expresión génica en procariotas
Regulación del operón Lac en E. coli

La regulación de los procesos celulares permite a los organismos optimizar el aprovechamiento de los recursos
disponibles en cada momento. Como la realización de estos procesos celulares depende en gran medida de la
acción de enzimas, el control de su síntesis es crucial (etapa final de la expresión génica). Si bien la expresión
génica puede ser regulada en diferentes etapas, el control del inicio de la transcripción permite el máximo ahorro de
energía evitando toda síntesis de productos no requeridos.
Los primeros organismos en los que se estudiaron estos mecanismos de regulación o control de la expresión
génica fueron las bacterias, ya que los métodos experimentales son relativamente simples y el aislamiento de
mutantes permite evaluar diferentes situaciones. A mediados del siglo pasado, Jacob y Monod realizaron los
primeros experimentos en este campo trabajando con Escherichia coli en el Instituto Pasteur. Estudiaron el sistema
que regula la expresión de genes necesarios para el metabolismo de la lactosa: un disacárido que puede ser
utilizado como fuente de carbono por las bacterias.
El sistema que regula el aprovechamiento de la lactosa como fuente de energía consta de numerosos elementos. El
primero de ellos consiste en un grupo de tres genes relacionados, llamados lacZ, lacY y lacA, que codifican
respectivamente las enzimas -galactosidasa, galactósido-permeasa y tiogalactósido-transacetilasa. La primera de
ellas hidroliza la lactosa (dando glucosa y galactosa), la segunda permite el ingreso de la lactosa a la célula y la
función de la tercera se desconoce. Para estos tres genes, llamados estructurales, existe un único promotor débil.
El producto de la transcripción de los genes estructurales es un mRNA policistrónico. Este sistema también incluye
un gen de expresión constitutiva (10 copias/célula) llamado lacI, cuyo producto proteico se une a una región del
DNA solapada con el promotor y el inicio del gen lacZ. La proteína LacI unida al DNA reprime la transcripción de los
genes estructurales al impedir la correcta unión de la RNApol. Jacob y Monod denominaron “represor” a la proteína
LacI y “operador” a la región del DNA a la que se une. Cada molécula del represor, que es tetramérico, posee un
sitio de unión para otra molécula denominada inductor (en la naturaleza, el inductor es un isómero de la lactosa). La
unión del inductor al represor produce un cambio alostérico que reduce drásticamente su afinidad por el DNA. Por
lo tanto, el complejo represor-inductor se desprende del operador dejándolo libre para la unión de la RNApol. El tipo
de control ejercido por un represor se
denomina control negativo.
Además, existe un sistema de
regulación adicional que incluye a la
proteína llamada CRP o CAP. Esta
proteína posee un sitio de unión a un
ligando (cAMP) y otro de unión al DNA.
Solamente cuando se forma el
complejo CRP-cAMP, éste se une a
una secuencia específica aumentando
la afinidad del promotor por la RNApol
y favoreciendo la transcripción de los
genes estructurales del operon lac.
Esto significa que CRP-cAMP ejerce un
control positivo y se denomina
activador.
Cuando hay transcripción de los genes
estructurales se dice que existe
inducción del sistema. La inducción
ocurre cuando se presentan las
siguientes situaciones en forma
simultánea: a) el represor no actúa
sobre el operador debido a la presencia
del inductor y b) el complejo CRP-
ligando se une a la secuencia
regulatoria específica.
 Objetivo

Estudiar las condiciones de inducción del operón lactosa en Eschericha coli.

Técnicas Experimentales

Inducción del operón Lactosa de E.coli en medios de cultivo de distinta composición

a) Cada grupo recibirá un cultivo de una cepa competente de E. coli (cultivo de E.coli salvaje crecido
en Medio Mínimo M9, glicerol 2% por 2 hs)
b) Tomar 7 tubos eppendorf y rotularlos con número de tubo y nombre de grupo
c) Preparar los medios que se describen en el siguiente protocolo:

Tubo No 1 2 3 4 5 6 7
Cultivo 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 -
Solución fisiológica 1,0 0,8 0,8 0,8 0,8 0,6 1,0
IPTG (40 mM) - 0,2 - - - - -
Lactosa (5%) - - 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Cloranfenicol(30 - - - - 0,02 - -
mg/ml)
Glucosa (10%) - - - - - 0,2 -

Todos los volúmenes están especificados en ml

d) Tapar los tubos, y mezclar por inversión 3 o 4 veces

e) Colocar los tubos en el baño de 37°C durante 1 hora, agitando periódicamente
f) Tomar 0,3 ml de cada tubo y pasarlos a nuevos tubos eppendorf. El resto del cultivo reservarlo en
hielo, para posteriormente medir absorbancia a 600 nm
g) Agregar a todos los tubos 0,3 ml de buffer Z pH 7.
h) Agregar a todos los tubos, con excepción del tubo 4, 25 µl de SDS 0,1% y 50 µl de Cl3CH
i) Agitar vigorosamente los tubos durante unos 10 segundos

Medida de la actividad -galactosidasa en los distintos cultivos

j) Agregar a todos los tubos 0.125 ml de ONPG (4 mg/ml en buffer Z) y agitar. TOMAR el tiempo. El
ONPG (orto-nitrofenilgalactosa) es hidrolizado por la enzima -galactosidasa, y uno de los
productos de hidrólisis, el orto-nitrofenol, es de color amarillo (ver reacciones en el anexo)
k) Incubar a temperatura ambiente hasta aparición de una suave coloración amarillenta. Registrar el
tiempo de reacción (entre 20 a 30 minutos)
l) Centrifugar durante 1 minuto.
m) Retirar 0.3 ml del sobrenadante con ayuda de una pipeta P1000 y transferirlo a un pocillo de una
policubeta
n) Leer la absorbancia a 420 nm.

Composición del buffer Z

0.06 M Na2HPO4
0.04 M NaH2PO4
0.01 N KCI
0.001 M MgSO4
0.05 M -mercaptoetanol

Análisis de resultados
En base a los resultados obtenidos calcular las Unidades Miller (UM) para cada condición.
Proponer una hipótesis para el funcionamiento del operón lactosa.

Unidades Miller

t=tiempo de reacción en minutos

v=volumen del cultivo usado en el ensayo en ml

Preguntas (fecha de entrega 16/06/2021)

1. ¿Cuáles son las funciones del IPTG y del ONPG utilizados en la práctica?
El IPTG ( Isopropil-ß-D-tiogalactósido ) es un inductor alterno para la transcripción de los genes
del operón lac, funciona interaccionando en el sitio de unión del represor provocando al mismo un
cambio alosterico en su conformación, lo que genera que se pierda su afinidad por el operon, y
así desestabilizar la unión de ambos. El represor al desligarse deja vía libre para la actividad de la
ARN polimeraza, esto induce la síntesis de los genes estructurales y próxima conformación de las
enzimas galactósido-permeasa tiogalactósido-transacetilasa y b-galactosidasa. Se lo considera
un inductor artificial y gratuito ya que induce la conformación de la enzima b-galactosidasa y no
es un sustrato de la misma y no puede ser degradado por la enzima. Tampoco necesita se
transportado por la galactósido permeasa, otra enzima de esta transcripción.
ONPG galactósido permeasa es un sustrato de la b-galactosidasa, es decir es sintetizado por la
enzima. Es capaz de formar galactosa y o-nitrofenol al hidrolizarse. El orto-nitrofenol es un
compuesto que presenta un intenso color amarillo, por lo que se lo considera a ONPG un
indicador de la actividad de la b-galactosidasa, ya que mediante análisis colorimétricos o de
espectrofotometría se puede medir la cantidad de colorante producto de ONPG que fue
sintetizado por la enzima y así evaluar su actividad o concentración.

2. Explique por qué los pre-cultivos se realizaron en un medio conteniendo glicerol y no glucosa.
No se realizaron los pre-cultivos con glucosa ya que actúa como represora del operón lac. Esto
se debe a una relación indirecta entre la concentración de ATP y AMPc. Cuando la célula posee
mucha cantidad de glucosa tiene la suficiente energía para que su metabolismo sintetice ATP,
que es predilecto enérgicamente a diferencia del AMPc. Pero el AMPc es en este caso un ligando
del que depende una proteína CAP para regular de forma positiva a la transcripción de los genes
del operón lactosa. Cuando AMPc se une a CAP permitiendo que la proteína se fije al ADN y
colabore con la ARN polimerasa con su unión al promotor.
3. En la medida de actividad -galactosidasa Ud. toma el tiempo hasta la aparición de color y ahí para
la reacción ¿Qué controles debería efectuar para asegurar que esta medida de actividad es válida?

Uno de los controles que se efectuá al realizar esta experiencia es el control blanco. Un control blanco
indica un tubo sin actividad enzimática debido a que no es agregado cultivo al mismo, como sería en este
caso el tubo n°7 en donde se puede evaluar como luce la turbiedad de la solución fisiológica y la lactosa
que son los compuestos que no reaccionan. Como no se presentan bacterias no habrá actividad alguna
de la b-galactosidasa. Al ser de nuestro interés calcular la absorbancia de los compuestos reaccionantes,
este valor obtenido del tubo 7 sin reacción se le resta a los demás, obteniendo así una absorbancia que
dependa solo de la actividad enzimática y no de otros compuestos. Se espera que los tubos blanco
posean menor absorbancia que los tubos con actividad enzimática positiva y mayor absorbancia que
aquellos tubos con la actividad enzimática inhibida.
Y en segundo lugar, también esta el control negativo. Este tipo de controles se utiliza para medir, en el
tiempo estimado, las actividades mínimas basales de las enzimas que se busca analizar. En este caso el
control negativo viene a ser el tubo n°1, al no agregarle ningún inhibidor o inductor al cultivo se puede
medir la expresión basal del operón lactosa sin estímulos, lo que me sirve para luego diferenciarla de los
resultados que expresen los demás tubos donde se analiza y compara las absorbancias de las reacciones
mismas.

4. ¿Para qué determina la absorbancia a 600nm de los cultivos inducidos en distintas condiciones?
La absorbancia a 600-630nm, determinada por la densidad óptica de los cultivos, se utiliza como método
para determinar la cantidad de bacteria inicial en las muestras. Si bien uno espera que cada condición se
realice con la misma cantidad de E.Coli, las bacterias poseen una densidad que hace que decanten, por
lo que si no se dispersan bien por una centrifuga incorrecta puede provocar errores en los cálculos e
incoherencias en los resultados de las UM, que no estarían relacionadas a la actividad de la enzima, sino
a la diferencia en la cantidad de bacterias. Es importante este paso para poder relativizar las muestras y
así poder comparar resultados de forma correcta. Este proceso mide la dispersión de la luz en los tubos
con cultivo, a mayor valor de densidad óptica mayor cantidad de bacterias.

5. Haga un esquema que represente TODOS los elementos importantes para el funcionamiento del
operón lac.
Aplica la imagen del punto 2.
Entre los elementos importantes se reconocen la proteína CAP y su activador, el AMPc que es sintetizado
en ausencia de glucosa en el sistema. Esta proteína induce la unión de la ARNpolimerasa con la hebra de
ADN fomentando la transcripción del operón lac. Esto puede llevarse a cabo solo sí está presente la
alolactosa, un isomero de la lactosa que se une al represor lac generando que se desligue del ADN por un
cambio conformacional que produce una baja de su afinidad entre ellos.
 6. En el TP se estudió la regulación del operón lac por medidas de actividad enzimática. ¿Los resultados
obtenidos son suficientes para demostrar un control transcripcional? ¿Qué otras hipótesis, podría
formular y cómo las evaluaría?

A continuación se presentan los resultados de los procedimientos analíticos

I. Tabla de los valores de absorbancia a 570nm de los cultivos.

Abs a 570nm. G1 G2 G3 G4
Control negativo 1 0,1 0,081 0,134 0,121
2 0,083 0,089 0,121 0,125
3 0,112 0,116 0,165 0,166
4 0,113 0,115 0,176 0,163
5 0,06 0,065 0,112 0,102
6 0,165 0,18 0,216 0,214
Blanco 7 0,039 0,037 0,037 0,038

A las absorbancias obtenidas experimentalmente se les restó el valor del blanco para obtener las
absorbancias de cada muestra “limpias” es decir sin el valor de turbiedad inicial que aporta el blanco
(tubo bacterias)

II. Tabla de los valores de absorbancia a 420nm de 0,3 ml de bacterias cada tubo de los cultivos, con
agregado de 0,125ml de ONPG.

Abs a 420nm. G1 G2 G3 G4
Control negativo 1 0,523 0,488 0,598 0,421
2 0,623 0,484 0,512 0,419
3 0,503 0,525 0,513 0,443
4 0,32 0,339 0,404 0,306
5 0,446 0,532 0,353 0,399
6 0,564 0,244 0,301 0,388
Blanco 7 0,078 0,067 0,061 0,056

Se procedió de la misma manera restando el valor de absorbancia del blanco al resto de los tubos para
obtener resultados exactos acerca de la actividad de la b-galactosidasa.

III. Tabla con los cálculos de la actividad de la enzima b-galactosidasa en UM calculadas a partir de su
formula con los valores de las absorbancias de las tablas anteriores.

Actividad enzimática

UM Muestras de cultivo
Tubos G1 G2 G3 G4
1 581,111111111111 669,410150891633 495,854063018242 386,593204775023
2 834,002677376171 604,244694132335 470,156106519743 372,444444444444
3 499,007936507936 502,873563218391 345,454545454545 296,519410977242
4 314,650934119961 327,536231884058 255,050505050505 208,588957055215
5 825,925925925926 909,40170940171 350,198412698413 434,640522875817
6 379,79797979798 150,617283950617 154,835390946502 201,453790238837
7 No posee enzima alguna
IV. Tabla de cálculos del promedio de las unidades de miller de cada cultivo y sus respectivos desvíos
estándar.

Tubos PROMEDIO DESVIO ESTANDAR

1 533,242132449002 120,743452670574
2 570,211980618173 199,889080568062
3 410,963864039529 105,811396925797
4 276,456657027435 55,1729819511105
5 630,041642725466 278,631495162089
6 221,676111233484 107,901971573024
7 192,587324166272 24,9858416228183

El desvío estándar es la medida que se utiliza para evaluar la posibilidad de errores en las mediciones y/o
en las metodologías. Por lo que se establece un rango de variabilidad aceptable para las absorbancias en
UM de cada condición.

Tabla V.

Rango posible de abs.

desde hasta
1 412,5 654
2 370 770
3 305 517
4 221 332
5 351 909
6 114 329,5
7 168 217,5

A continuación una representación grafica del promedio de la absorvancia medida en UM para cada
muestra.

Absorvancia en UM para cada condición experimental

promedio de los valores de cada muestra

700

600

500

400

300

200

100

0
1 2 3 4 5 6 7
Ya con todos estos datos obtenidos experimentalmente es posible señalar algunas conclusiones acerca
de las condiciones de cada muestra y la relación con los resultados esperados en cada una de ellas.

Tubo 1 (contiene cultivo y sc. fisiológica): En estas condiciones se esperarían obtener resultados
basales acerca de la transcripción del operón lactosa, la cantidad de absorbancia medida correspondería
directamente con la cantidad de enzimas transcriptas de forma natural, sin relación a la intervención de
ningún inductor ni ningún inhibidor. Se midió una actividad de 553UM. Por lo que este valor corresponde a
la medida de la actividad basal del operón en el medio utilizado.

Tubo 2 (contiene cultivo, sc. fisiológica e IPTG): Tal como se menciona anteriormente en este informe,
el IPTG funciona como un inductor artificial de la transcripción del operón lactosa, por lo cual se esperaría
teóricamente un aumento en la actividad transcripcional y por ende enzimática. Se observó una actividad
de 570UM, el valor es efectivamente mayor, esto indica una cantidad mayor de enzimas en el medio
desprendiendo la sustancia colorante, por lo que coincide con lo esperado.

Tubo 3 (contiene cultivo, sc. fisiológica y lactosa): Se esperaría de este tubo una actividad mayor que
la del blanco, ya que al igual que el IPTG la lactosa actúa como inductor de la transcripción del operón
lactosa, la diferencia radica en que este es un inductor natural. Se observó una actividad de 410UM.
El valor obtenido ni siquiera es mayor que el blanco por lo que el resultado experimental sugiere un
comportamiento opuesto.
Suponiendo que no se debe a un problema de agregado de cultivo.
La hipótesis es que la cantidad de lactosa agregada no haya sido suficiente para producir una inducción
efectiva. Cuando se dispone de lactosa en un medio algunas moléculas de la misma sufren
transformaciones conformacionales convirtiéndolas en alolactosa, un represor del operón lactosa. Esto
explicaría la reducción de la actividad en comparación con el tubo blanco y el tubo 2.

Tubo 4 (contiene cultivo, sc. fisiológica, lactosa; sin SDS ni Cl3CH). Al no contener SDS ni Cl3CH, no
se produce la lisis de la bacteria, por lo tanto la lactosa agregada al medio y la ß-galactosidasa dentro de
la bacteria no lograran entrar en contacto. Por lo que, no se da la hidrólisis del ONPG por la enzima y no
libera el compuesto orto-nitrofenol que provoca el color y aporta el sustrato para la medición de la
absorbancia.
Se observó una actividad de 276UM. Este resultado coincide con lo previamente expuesto, ya que la
actividad es menor que en las condiciones anteriores, incluso comparado al Tubo 1.

Tubo 5 (contiene cultivo, sc. fisiológica, lactosa, cloranfenicol): Este tubo a diferencia de los otros
posee cloranfenicol que es un antibiótico que inhibe el proceso de traducción. De esta manera
directamente no se produciría la conformación de las enzimas y la actividad enzimática se vería reducida
ya que solo se estaría produciendo orto-nitrofenol a partir de las enzimas previamente traducidas, por lo
que aun con lactosa en el medio que trabaja induciendo la transcripción la traducción se vería inhibida.
Se observó una actividad de 630UM. Este resultado presenta cierto error, si bien es de alguna manera el
resultado es afín al tubo 1, donde la actividad operón es la basal, poseen un rango de diferencia notable,
esto se puede atribuir a un error experimental o de cantidad de cultivo. O mismo se atribuye a los valores
del desvío estándar.

Tubo 6 (contiene cultivo, sc. fisiológica, lactosa y glucosa): El medio se encuentra en presencia de
glucosa, por lo que se espera que no se produzca inducción en la transcripción del gen. Esto se
comprueba ya que la actividad medida fue de 221UM.
Este resultado coincide la condición de la actividad de la glucosa como inhibidora indirecta de la
transcripción. Al ser el sustrato por excelencia para la producción de energía en forma de ATP esto
desplaza la producción de AMPc que posee características de activador. E. coli. metaboliza glucosa frente
a la lactosa.
Pero si bien el valor reducido explica lo anterior, no explica la razón de que el valor de absorbancia sea
incluso menor que en el blanco. Por lo que también se sospecha un error en la cantidad de bacterias en el
tubo. Mismo la actividad en G1 difiere mucho de las otras muestras.

Tubo 7 (contiene sc. fisiológica + lactosa): Este es el tubo del control negativo, no se agrega cultivo en
un principio, por lo que los resultados evidencian si hubiese algún compuesto ajeno al cultivo que esté
reaccionando y arruinando las medidas experimentales. Al no tener de E. coli, la medida la actividad
enzimática en esta condición es nula.
La medida de absorbancia de este tubo se debe a la absorbancia de la sc. fisiológica y la lactosa, sería la
absorbancia basal del experimento por lo que se resta de los demás tubos para poder medir la
absorbancia y actividad enzimática unicamente.

Conclusiones.
Según las experiencias realizadas es difícil determinar una hipótesis con respecto al funcionamiento del
operón lactosa.
Si bien en casos donde se esperaba que la actividad enzimática se vea reducida como lo es la condición
del tubo 5 o 6, ya sea por inhibición de la traducción o por glucosa en el medio, los resultados demuestran
errores en la metodología, provenientes de errores experimentales con respecto al pipeteo y mezcla de
cultivo o cualquier otro error no considerado.
Los resultados obtenidos son muy interesantes a nivel experimental, ya que obviando los errores por
desvío estándar se puede deducir y confirmas ciertos comportamientos de inductores e inhibidores en el
operón lactosa, pero no poseen la rigurosidad suficiente como para generar una hipótesis a partir de ellos.
Si bien los valores experimentales no son los más fiables, se puede observar que la diferencia de
actividad de la ß-glicosidasa entre el estado basal del operón (Tubo blanco) y el inducido por IPTG (Tubo
2) denota que el compuesto del tubo 2 aporta cierto comportamiento inductivo.
Sumado a esto, las medidas de absorbancia a 420nm y 570nm no son específicas, eso es debido a que
las enzimas se encuentran libres en el tubo por la lisis bacteriana, esto provoca que las enzimas estén
dispersas y propensas a reaccionar no solo con el ONPG de forma eficiente, sino que con todo aquello
que puedan reaccionar en solución con los diferentes compuestos de cada condición y el buffer.
Por ultimo, es recomendable que las mediciones y experiencias las realice una sola persona, con el fin de
minimizar el error experimental aleatorio y así aportar valores más fieles.