Transformacion bacteriana

1 Dia

Qu es la transformacion bacteriana?

El proceso consiste en la introduccin de un ADN extrao

(heterlogo) a una bacteria.
Este proceso se puede dar por tres mtodos:
Transformacion con ADN desnudo en presencia de CaCl2.
Transduccin: Introduccin de DNA mediada por un bacteriofago.
Electroporacin: El DNA se introduce en las bacterias forzandolo
con una descarga elctrica (se usa en gram + y clulas eucariotas
vegetales o de hongos {que tienen pared celular}).
Para las clulas eucariotas no vegetales ni de hongos, se usa la
transfeccin, que consiste en precipitar el DNA junto con las
clulas y Ca3(PO4)2, tambin se usa la microinyeccin, donde se
introduce el DNA directamente al ncleo de la clula.
Para clulas vegetales otra forma de introducir DNA es atravs del
llamado can gnico, que impulsa con gas comprimido a gran
presin microparticulas de tungsteno u oro (metales relativamente
inertes desde el pto. de vista qumico) recubiertas con una
solucin del DNA que se quiere introducir.
El kit con el que vamos a trabajar, usa el primero de los mtodos
reseados.
Para poder tomar el DNA, las bacterias tienen que estar en un
estado llamado de competencia, que se logra tratando a las
2+
mismas con soluciones ricas en Ca de manera tal que se le abren
poros a la pared y la membrana celular por donde ingresar el
DNA.
Una vez adentro, el DNA puede integrarse al material gnetico de
la bacteria (o clula), o permanecer autnomo con respecto al
mismo (epismico)(en eucariotas es mas frecuente la integracin a
los cromosomas, pero hay ocasiones en las cuales es deseable la no
 integracin del DNA, asi que el fragmento se mantiene indepte del
DNA celular y se le llama transiente).
En nuestro caso el material introducido, se mantendr epismico.
Asi, se replicar autonomamente.
El material a utilizar se llama plsmido, y consiste en una
estructura circular de DNA dc (de entre 2600 a 6000 pb) que porta
la siguiente informacin:
1. Un origen de replicacin
2. Una secuencia de control de n de copias
3. Un gen (con su correspondiente promotor) de resistencia a un
antibiotico
4. Un promotor (gralte inducible, derivado del operon Lac)
5. Un sitio mltiple de clonado (polilinker)
Cada uno de estos elementos cumple una funcin especfica.
El 1 conocido como ORI permite la replicacin autnoma del DNA.
El 2 controla cuantas copias tendra el plsmido dentro de la
bacteria (desde ~16/bact para pET, hasta ~600/bact para pUC18).
El 3 es un gen que produce una proteina que facilita a la
bacteria resistir la accin de un antibitico y funciona como
agente de seleccin, esto es, permite distinguir en presencia del
agente selector (antibitico)a las bacterias que hayan incorporado
el DNA de aquellas que no lo hayan hecho. Antibiticos utilizados
son por ejemplo: ampicilina (BLA), kanamicina (APT) ,
tetraciclina, cloramfenicol (CAT), etc.
El 4 sirve para poder expresar, usando la maquinaria de
trancripcin y de biosintesis de proteinas de la bacteria, una
proteina de nuestro intres.
El que sea inducible me permite seleccionar el momento ms
adecuado para la expresin.
El 5 es una secuencia de DNA que tiene muchos sitio de
reconocimiento de enzimas de restriccin, donde uno puede clonar
el gen de la proteina que interesa expresar.
 sitio de Proteina
enzima de activadora
restriccion arabinosa

origen de Promotor Ara BAD

replicacion

gen de
resistencia green fluorescent protein
antibiotico

Este es el plsmido que usaremos en la experiencia.

El mismo plsmido ms detallado.

polilinker

La bacteria competente, al igual que el plsmido es provista por

el kit.
Generalmente, son cepas (strain) de E.coli tales como: HB101,
JM105, LE392, DH5, BL21DE3, etc.
Este kit hace uso del sistema de regulacin gnica del operon ARA,
promotor ARA BAD y gen de la proteina Ara C.
La proteina GFP, extraida de una medusa, tiene la propiedad de
fluorescer de color verde brillante, cuando es iluminada con luz
UV.
A este tipo de productos gnicos, se los llama genes (proteinas)
reporter, ya que permiten verificar de manera sencilla su
presencia ya que provocan algun efecto ptico o de otra naturaleza
cuando se producen.
Genes reporter son p.ej.: GFP, -galactosidasa, -glucoronico,
luciferina, etc.
El proceso concretamente, consiste en tomar 2 tubos eppendorf
rotulados () DNA y (+) DNA donde se colocar solucin de CaCl2 .
Una vez hecho esto, de una placa de petri sembrada con la bacteria
se toma una ansada y se disuelve en cada tubo.
Una vez bien disueltas las bacterias en la solucin, se tapa el
tubo (-)DNA y al (+)DNA se le agrega una ansada de plsmido pGLO.
Los dos tubos se colocan 10 en hielo, y luego de 50 a 130 a
42C. Se recuperan las bacterias transformadas 30 a 37C con
medio LB (caldo de Luria-Bertani, triptona 10 g, extracto de
levadura 5g, NaCl 10 g, H2O csp 1000 mL).
Por ltimo se plaquearn las bacterias transformadas en cajas de
petri, con agar LB (idem caldo LB + 1.5% agar) + arabinosa.
Se ponen las cajas en estufa de 37C overnight.

2 Dia

Ver si crecieron las bacterias en las placas.

Tomar la placa rotulada (+)DNA e iluminarla con luz UV, observar
el resultado.
 Como se elige donde transformar?

P R O T E IN A B L A N C O
C O N T IE N E H ID R A T O S D E C A R B O N O ?

SI NO
T IE N E N
IM P O R T A N C IA
C L IN IC A ?
B A C T E R IA S
CON
SI NO M E T IO N IN A
IN IC IA L ?

SI NO
CELULAS Y
P R O T E IN A D E F U S IO N
LEVADURAS C L O N A D O D IR E C T O