Universidad Del Valle de México-CampusCoyoacán

Práctica #2: Elaboración de células competentes de Escherichia coli con

cloruro de calcio
Carmona Gómez Lizeth, De los Santos Alcántara Diego Uriel, Glodias
Esquivel Kenia, Osornio Sánchez Alan Gerardo
Asignatura: Biotecnología
Licenciatura QFBT
Periodo 2019-02
Fecha de entrega: 5 de septiembre de 2019
Docente: Jessica Maldonado Hernández

RESUMEN

El proceso de transformación incluye la introducción de ADN exógeno (que no

pertenece a la bacteria) en las células bacterianas, y este ADN se convierte en parte
del material genético bacteriano y puede ser heredado por las nuevas células cada
vez que las bacterias se multiplican. Sin embargo, para permitir la entrada de ADN
plasmidial en las células bacterianas, las bacterias deben tener condiciones
fisiológicas especiales. Este estado fisiológico especial se llama competencia. La
competencia puede variar naturalmente o puede ocurrir a través de diferentes
técnicas. Estas técnicas incluyen el tratamiento con soluciones, como cloruro de
calcio ya que los iones metálicos alteran la permeabilidad de la pared celular, lo que
hace que estas células cambien la entrada de ADN exógeno a través de la
membrana celular. En esta práctica se utilizó la técnica de agregado de Cloruro de
Calcio para la elaboración de células competentes, la cual resultó de manera exitosa
ya que nos ayudó a facilitar la entrada de DNA exógeno al interior de la bacteria
para crear células hijas con este DNA.
Palabras clave: célula competente, DNA exógeno, cloruro de calcio.

INTRODUCCIÓN
DNA recombinante produce una modificación genética
El ADN recombinante, o ADN que permite la adición de una nueva
recombinado, es una molécula de secuencia de ADN al organismo,
ADN artificial formada de manera conllevando a la modificación de
deliberada in vitro por la unión de rasgos existentes o la expresión de
secuencias de ADN provenientes de nuevos rasgos.
dos organismos distintos que El proceso de producción de un ADN
normalmente no se encuentran juntos. recombinante comienza con la
Al introducirse este ADN identificación desde un organismo de
recombinante en un organismo, se una secuencia de ADN de interés con
el fin de propagarlo en otro organismo
que carece de la secuencia y, por
ende, del producto proteico de esa
secuencia de ADN.
En términos simples, el procedimiento
consiste en:
 Localización de genes y sus
funciones.
 Clonación del ADN, y su
posterior almacenamiento en
genes.
 Reacción en cadena de la
polimerasa (PCR)
 Utilización de vectores de
expresión.
Ingeniería genética utilizando la
tecnología del ADN recombinante
En la naturaleza el ADN es trasferido
entre bacterias utilizando 2 métodos:
transformación y conjugación. En la
transformación, una bacteria adquiere
DNA exógeno del ambiente. En
contraste, la conjugación requiere el
contacto directo entre dos bacterias,
un trozo de ADN es copiado en una
célula (donante) y luego es transferido
a otra célula (receptor). En ambos
casos, la bacteria adquiere nueva
información genética que es estable y
heredable.
Figura 1. Transformación Bacteriana:
incorporación del plásmido
recombinante en las bacterias.
Muchas bacterias poseen genes no
esenciales en pequeñas piezas
circulares de doble cadena de ADN,
además de su ADN cromosómico.
Estas piezas de ADN, llamadas
plásmidos, permiten a las bacterias
intercambiar beneficios. La tecnología
del ADN recombinante permite a los
científicos colocar genes de diferentes
orígenes en los plásmidos
bacterianos. Estos plásmidos
especiales reciben el nombre de
vectores y tiene las siguientes
características:
Figura 2. Elementos de un vector.
1. Origen de replicación: Secuencia
de ADN a partir de la cual la bacteria
puede iniciar la copia del plásmido.
2. Lugar Múltiple de clonación: Una
corta secuencia de ADN que contiene
diferentes lugares únicos que
reconocen los enzimas de restricción y
permiten a los científicos la
introducción de genes específicos en
los plásmidos.
3. Promotor: Una secuencia de ADN
que está típicamente localizada antes
de la secuencia que codifica el gen. El
promotor recluta la ARN polimerasa al
comienzo de la secuencia del gen
donde comienza la transcripción.
4. Marcador selectivo: Un gen que
codifica para la resistencia de un
específico antibiótico, normalmente
ampicilina, kanamicina o tetraciclina,
Cuando se utiliza un medio selectivo,
sólo las células que contienen el
marcador crecerán, de forma que
permite al investigador identificar
fácilmente las células que han sido
transformadas con éxito.
Transformación Bacteriana
El proceso de transformación incluye
la introducción de ADN exógeno (que
no pertenece a la bacteria) en las
células bacterianas, y este ADN se
convierte en parte del material
genético bacteriano y puede ser
heredado por las nuevas células cada
vez que las bacterias se multiplican, es
decir, a través de la manipulación
genética, podemos crear un carácter
presente en la bacteria que pasará a
ser hereditario. Un proceso de
transformación genética consta de
cuatro etapas que son comunes para
todas las bacterias y necesarias para
la detección exitosa de los
transformantes.
Estas etapas son:
1. El desarrollo de un estado de
competencia en la célula,
2. La unión de la molécula de ADN
a la superficie celular,
3. Su entrada y procesamiento
4. La expresión fenotípica del
nuevo genotipo resultante.
Sin embargo, para permitir la entrada
de ADN plasmidial en las células
bacterianas, las bacterias deben tener
condiciones fisiológicas
especiales. Este estado fisiológico
especial se llama competencia.
Una bacteria competente es una
bacteria que es capaz de recibir ADN
exógeno. La competencia puede
variar naturalmente o puede ocurrir a
través de diferentes técnicas. Estas
técnicas incluyen el tratamiento con
soluciones, como cloruro de calcio, y
cambios bruscos de temperatura. Los
iones metálicos y los cambios bruscos
de temperatura alteran la
permeabilidad de la pared celular, lo
que hace que estas células cambien la
entrada de ADN exógeno a través de
la membrana celular.
Usualmente se emplea el tratamiento
con sustancias químicas y la
electroporación para la
transformación artificial de E. coli.
También se han reportado otros
métodos menos comunes como la
biobalística, el tratamiento con
polietilenglicol, el ultrasonido y las
microondas. El mecanismo exacto por
el cual el cloruro de calcio media el
proceso de transformación artificial
sigue siendo una incógnita.
Resultados previos sugieren que el
calcio facilita la adsorción del ADN
sobre la superficie celular y el shock
térmico permite la entrada del ADN
adsorbido al citoplasma de la célula.
Se postulan dos modelos que explican
el mecanismo de transformación
inducida de las células bacterianas.
Según el primer modelo, el ADN libre
se une a un receptor en la membrana
celular y es transportado a través de
canales, ya sea en forma circular o
linear. Este modelo se basa en el
papel importante que representan los
canales formados por el complejo poli-
β-hidroxibutirato
(PHB)/calcio/polifosfato en la
captación y entrada de moléculas de
ADN. El segundo modelo asume que
el shock térmico desestabiliza la
membrana celular, de manera que
favorece la entrada del ADN a la célula
a través de poros temporales
formados en aquella.
El método clásico de preparación de
células competentes de E.coli con
cloruro de calcio y transformación
por shock térmico fue reportado por
Mendel y Higa en 1970.
Existen dos métodos de preparación
de células competentes, pueden ser
tratadas con disoluciones de
cloruro de calcio y cloruro de
magnesio.El método A es el método
de Sambrook y col13 con
modificaciones, el cual se utiliza para
la preparación de células
competentes. Se realiza inoculando 1
mL de un precultivo en 100 mL de LB
que se suplementó con 20 mmol/L de
disolución de MgCl2 y la densidad
óptica a 600 nm siendo seleccionada
en el intervalo de 0,4 a 0,6.
Las células son colectadas mediante
centrifugación a 8000 r/min a 4 °C
durante 10 min, el sobrenadante se
desecha y la biomasa bacteriana se
resuspenden en 20 mL de una
disolución de 50 mmol/L CaCl2
previamente colocada sobre hielo. La
suspensión se dispone en baño de
hielo durante 30 min y las células son
nuevamente colectadas por
centrifugación a 8000 r/min durante 10
min. Luego de eliminar el
sobrenadante, el precipitado celular se
resuspende en una mezcla de una
disolución de 50 mmol/L CaCl2 con
glicerol al 20 %.
Escherichia coli DH5-Alpha
E. coli son bacterias bacilo
gramnegativas. Se reproducen por
fisión binaria sucesiva con un tiempo
de generación de aproximadamente
30 minutos con un crecimiento óptimo
a 37 grados centígrados. E. coli son
bacterias aeróbicas facilitadoras y son
capaces de síntesis de ATP a través
de la respiración aeróbica y, si no hay
oxígeno, fermentación. Esta cepa
particular se puede identificar y
distinguir de otras cepas de E. coli,
examinando la secuencia genética de
su subunidad ribosómica pequeña
16s, que se ha secuenciado
completamente.
Esta cepa de E. Coli no es un
patógena, y fue desarrollada para uso
de clonación en laboratorio. Esta cepa
fue desarrollada por D. Hanahan como
una cepa de clonación con múltiples
mutaciones que permiten
transformaciones de alta eficiencia.
Las mutaciones que tiene la cepa
DH5-Alpha son:
dlacZ Delta M15 Delta (lacZYA-argF)
U169 recA1 endA1 hsdR17 (rK-mK
+) supE44 thi-1 gyrA96 relA1
Estas mutaciones corresponden a las
características distintivas que hacen
que la cepa DH5-Alpha se destaque
en los procedimientos de clonación de
laboratorio.
Mutación lacZ Delta M15: permite la
detección azul-blanca de células
recombinantes. Mutación endA1:
permite una degradación de la
endonucleasa más baja que garantiza
mayores tasas de transferencia de
plásmidos.
Mutación recA1: reduce la
recombinación homóloga para un
inserto más estable.
La estructura genómica de esta cepa
es un cromosoma circular singular que
consta de 4,686,137 nucleótidos, 4359
genes y 4128 genes que codifican
proteínas.
Esta cepa también contiene plásmidos
y tiene la capacidad de aceptar la
inserción de plásmidos
excepcionalmente bien.
Vector pUC119
Deriva de pBR322 (mantine AmpR y un sistema reportero de la -
ori pMB1), mutación de ori pMB1, tiene galactosidasa.

DIAGRAMA DE FLUJO

Bacteria Escherichia coli Utilizar tubos estériles

Vaciar a todos los tubos

600 RPM por 10 min

Decantar la fase acuosa

Primera centrifugación
Re suspender en 2ml de CaCl2 Centrifugar 600 rpm

Obtención de células
competentes
RESULTADOS
Figura 3. Se observa la obtención de
células competentes provenientes de la
bacteria Escherichia coli por medio de la
técnica con CaCl2.
ANÁLISIS DE RESULTADOS
Como ya sabemos una célula
competente es aquella la cual tiene la
capacidad de recibir ADN exógeno el
cual se convierte en parte del material
genético de la bacteria y este se
hereda a las nuevas células cada que
se multiplican, las técnicas empleadas
para realizar esta técnica incluye
soluciones como cloruro de calcio y
cambios bruscos de temperatura. en
esta práctica de laboratorio se
implementó el uso del cloruro de calcio
el cual ayuda que la pared celular de
nuestra bacteria cambie la
permeabilidad permitiendo la entrada
de un plásmido modificado con las
características deseadas. No obstante
la eficiencia de esta técnica puede
resultar baja, sin embargo no pudimos
corroborar realmente la eficacia de la
transformación y de la competitividad
bacteriana ya que no contaba con un
plásmido disponible para este ser
introducido, y posteriormente crear
numerosas copias, si se hubiera
realizado la inserción en plásmido,
posteriormente podríamos haber
inoculado nuestra bacteria
competente esperando que en el agar
LB suplementado con ampicilina,
IPTG y X-gal incubándolo por 16 hrs a
37°C, esperando el crecimiento de
colonias color azul indicándonos que
la bacteriarealmente fue transformada
con el plásmido recombinante con el
gen reportero -galactosidasa.
CONCLUSIÓN
El método de transformación mediante
choque térmico de células
competentes con cationes divalentes
es muy rutinario dada la facilidad de
realización del mismo y la no
necesidad de utilizar aparatos
sofisticados, a diferencia de la
electroporación o la biobalística. El
tratamiento con CaCl2 es muy
importante ya que este permite la fácil
entrada del DNA exógeno, dándonos
como resultado bacterias
competentes.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
- Madigan, M; Martinko, J;
Bender, K; Buckley, D; Stahl, D.
(2015). “Brock; Biología de los
microorganismos”. Madrid.
Pearson Educación, S.A 14ª
ed.
- Tortora, G; Funke, B; Case, C.
(2017). “Introducción a la
Microbiología”. Ciudad
Autónoma de Buenos Aires.
Médica Panamericana. 12ª ed.
- Sinha S, Redfield R J. Natural
DNA Uptake by Escherichia
 coli. P LoS ONE. 2012.
Consultado el 1 de septiembre
de 2019.
https://revista.cnic.edu.cu/revis
taCB/articulos/comparaci%C3
%B3n-de-dos-
m%C3%A9todos-para-la-
preparaci%C3%B3n-de-
c%C3%A9lulas-competentes-
en-escherichia-coli
- Sambrook J, Fritsch EF,
Maniatis T (1989) Molecular
cloning. Cold Spring Harbor
Laboratory Press. pp. 1.74-
1.84.