Garbocci, Ledesma.

3.1. Mutación: Estructura del DNA, estructura de los genes, código genético. Mutación
espontánea e inducida. Agentes mutagénicos, físicos y químicos, transposición, mecanismo
molecular de acción de cada agente mutagénico. Reparación de las lesiones provocadas por
mutágenos, mecanismos. Métodos para el aislamiento de diferentes tipos de mutantes.
Un clon es una población de células que derivan de las forma asexual de una célula parental
y son genéticamente idénticas. En ocasiones el clon recibe el nombre de cultivo puro. El término
genoma hace referencia a todos los genes presentes en una célula o un virus. Los procariotas
contienen normalmente un juego de genes, es decir, son haploides (1N). Los microorganismos
eucariotas suelen tener dos juegos de genes, es decir, son diploides (2N). El genotipo de un
microorganismo es el juego específico de genes que posee. En cambio, el fenotipo, es el conjunto de
características de un individuo que el investigador puede observar.
El trabajo inicial de F. Griffith sobre la
transferencia de virulencia en la bacteria patógena
Streptococcus pneumoniae1, realizado en 1928, sentó
las bases de la investigación que demostró por
primera vez que el DNA era el material genético.
Griffith comprobó que si hervía bacterias virulentas y
las inyectaba en ratones, estos no se veían afectados
y no era posible recuperar neumococos de dichos
animales. Cuando inyectó una combinación de
bacterias virulentas muertas (S) y una cepa de
bacterias vivas no virulentas (R), los ratones morían;
le fue posible recuperar bacterias virulentas vivas de
los ratones muertos, estas presentaban la cápsula del
tipo de las células S muertas por calor. Griffith
denominó transformación a esta conversión de
bacterias no virulentas en patógenos virulentos.
O. T. Avery, y sus colaboradores (en 1944), se
propusieron descubrir qué componente de los
neumococos virulentos muertos por calor era el
responsable de la transformación de Griffith. Estos
investigadores destruyeron de forma selectiva
componentes de extractos purificados de
neumococos virulentos, utilizando enzimas capaces
de hidrolizar el DNA, el RNA o las proteínas. A continuación, expusieron cepas de neumococos no
virulentos a los extractos tratados. La transformación de las bacterias no virulentas sólo se impedía si
se destruía el DNA, lo cual indicaba que el DNA transportaba la información necesaria para la
transformación.
Algunos años después A. D. Hershey y M. Chase (1952), llevaron a cabo diversos
experimentos que demostraron que el DNA era el material genético en el bacteriofago T2. En su
descubrimiento intervino cierta dosis de suerte, ya que el material genético de muchos virus es RNA.
La controversia en torno a la naturaleza de la información genética podría haberse prolongado
durante más tiempo del que lo hizo. Hersey y Chase marcaron radiactivamente el DNA del virus con

1
Una bacteria cuya capacidad de invasión se debe, en parte, a la presencia de una cápsula polisacárida. Se
pueden aislar mutantes que carecen de esta cápsula y que son incapaces de causar infección; tales mutantes
se llaman cepas R, porque sus colonias aparecen rugosas en las placas de agar, a diferencia de la apariencia
lisa de las cepas capsuladas (S). Un ratón inyectado con apenas unas cuantas células de una cepa lisa, muere
tras un día o dos de la infección por el neumococo, mientras que incluso grandes inóculos de las células R no
causan la muerte cuando son inyectadas.
1
Garbocci, Ledesma.
32
P y la cápside proteica viral con 35S. Mezclaron el
bacteriofago radiactivo con E. coli e incubaron la mezcla
unos pocos minutos. Agitaron violentamente la
suspensión en un homogeneizador para separar
cualquier partícula de bacteriofago adsorbida. Después
de centrifugar, determinaron la radioactividad tanto en el
sobrenadante como en el precipitado. Descubrieron que
la mayoría de la proteína radioactiva se encontraba en el
sobrenadante, mientras que el DNA marcado con 32P se
encontraba dentro de la bacteria. Como se había
producido la progenie de T2, el material genético debía
de haber sido inyectado y por lo tanto el DNA tenía que
ser el que transportara la información genética de T2.
Los biólogos conocen desde hace tiempo la existencia de una relación entre el DNA, el RNA y
las proteínas; el DNA se copia de forma precisa durante su síntesis o replicación. La expresión de la
información codificada en la secuencia de bases del DNA comienza con la síntesis de una copia de
RNA a partir de la secuencia de DNA que constituye un gen. Un gen es una secuencia de nucleótidos
que codifica para un péptido, un tRNA o un rRNA. Aunque el DNA tiene dos cadenas
complementarias, solo la cadena molde es copiada en cada punto particular a DNA. Si se
transcribieran las dos cadenas de DNA, se obtendrían dos mRNA lo cual provocaría una confusión
genética. Genes diferentes pueden ser codificados por cadenas opuestas. Este proceso de síntesis
de RNA dirigido por el DNA se llama transcripción, ya que la secuencia de bases del DNA se copia
en secuencias de bases de RNA. El RNA que lleva la información desde el DNA y que dirige la
síntesis proteica se denomina RNA mensajero (mRNA). La última fase de la expresión génica es la
traducción o síntesis proteica. La información genética en forma de una secuencia de nucleótidos del
mRNA, se traduce y dirige la síntesis de proteínas. De este modo, la secuencia de aminoácidos de
una proteína es un reflejo directo de la secuencia de bases del mRNA, la cual, a su vez, es una copia
complementaria de una porción del DNA genómico.
Tanto en el DNA como en el RNA, los nucleótidos se unen mediante grupos
fosfato para formar largas cadenas de polinucleótidos. Las diferencias en cuanto a
composición química de las cadenas reside en cuanto a la composición de los
azúcares y bases pirimídicas: el DNA tiene desoxirribosa y tiamina, mientras que el
RNA tiene ribosa y uracilo en lugar de tiamina.
Los modelos de replicación son algo diferentes entre
procariotas y eucariotas. Por ejemplo, al replicarse el
cromosoma de DNA circular de E. coli, la replicación comienza
en un solo punto, el origen. La síntesis ocurre en la horquilla de
replicación, el lugar donde la hélice de DNA se desenrolla y las
hebras individuales se replican. Dos horquillas de replicación se
dirigen hacia fuera partiendo del origen, hasta que han copiado el replicón entero,
que es la porción del genoma que contiene un origen y se replica como unidad.
En el mecanismo del círculo rodante se produce el corte de una cadena, y el
extremo 3’-hidroxilo libre se extiende mediante enzimas de replicación. A medida
que se alarga el extremo 3’ dando vueltas alrededor del molde circular, el extremo
5’ de la cadena se desplaza y forma una cola en contínuo crecimiento. La cola de
cadena sencilla (monocatenaria) puede convertirse en cadena doble mediante la
síntesis de una cadena complementaria. Este mecanismo es especialmente útil
en los virus, ya que permite la producción rápida y continua de muchas copias
genómicas a partir de un único punto de iniciación.
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Garbocci, Ledesma.
El DNA eucariótico es lineal y mucho más largo que el DNA procariótico. Es evidente que
muchas horquillas deben replicar el DNA eucariótico de forma simultánea para que la molécula
pueda replicarse en un tiempo relativamente corto. Las horquillas de replicación se desplazan hacia
fuera desde estos puntos y finalmente encuentran horquillas que están copiando el segmento de
DNA adyacente. De esta forma se copia con rapidez una molécula de gran tamaño.
La replicación del DNA es un proceso esencial para los organismos. La replicación del DNA
de E. coli es probablemente el mecanismo mejor conocido, se cree que el proceso es similar en las
células eucariotas.
La replicación comienza en el locus oriC. La proteína dnaA se une al oriC mientras hidroliza
ATP. Esto da lugar al desenrollamiento inicial de la doble cadena de DNA en el punto de iniciación. El
desenrollamiento continúa por acción de la dnaB, que es una helicasa. E. coli tiene tres enzimas DNA
polimerasas diferentes, cada una de las cuales cataliza la síntesis de DNA en dirección 5’ a 3’,
mientras que lee el DNA molde en dirección 3’ a 5’. Otras enzimas tienen papeles destacados, las
helicasas desenrollan la hélice con ayuda de las topoisomerasas, como la DNA girasa. La replicación
de la cadena rezagada es discontinua y los fragmentos se sintetizan en dirección 5’ a 3’, como ocurre
en la síntesis de cadena conductora. En primer lugar, una primasa (RNA polimerasa) sintetiza un
cebador de RNA corto complementario al DNA, el cual es eliminado, posteriormente, una vez se haya
duplicado gran parte de la cadena. Finalmente los fragmentos se unen por acción de la DNA ligasa.
El gen se ha definido de diversas formas. Actualmente se considera como una secuencia
lineal de nucleótidos o codones con un punto de inicio y un punto de terminación fijos. Inicialmente se
consideraba que un gen contenía información para la síntesis de una enzima (hipótesis <<un
gen-una enzima>>). Este concepto se ha modificado por la hipótesis de <<un gen-un polipéptido>>,
(más específicamente un polinucleótido, que codifica un polipéptido, tRNA o rRNA) ya que existen
enzimas y proteínas compuestas con dos o más cadenas polipeptídicas diferentes que están
codificadas por genes distintos. El segmento que codifica un único polipéptido se denomina cistrón.
La mayoría de los genes consisten en secuencias aisladas que se leen sólo en un sentido para
producir un solo producto; es decir, no existe solapamientos del código, y hay un único punto de inicio
con un marco de lectura en el que los nucleótidos se organizan en codones.
La estructura génica de procariotas y virus difiere de forma sustancial de los eucariotas,
algunos presentan regiones de solapamiento de genes. En los sistemas bacterianos y virales, la
información codificante contenida en un cistrón suele ser continua; en cambio, en los organismos
eucariotas, muchos de los genes contienen información codificante (exones) interrumpida
periódicamente por secuencias no codificantes (intrones).
Para que la vida pueda existir de forma estable, es esencial que la secuencia de nucleótidos
de los genes no se altere de forma sustancial. Sin embargo, el hecho de que se producen cambios
en las secuencias que a menudo tienen como consecuencia la alteración del fenotipo. Estos cambios
son principalmente perjudiciales, aunque son importantes para generar nueva variabilidad, y
contribuyen al proceso de la evolución.
Las mutaciones se definieron inicialmente como alteraciones de los fenotipos o de las
expresiones fenotípicas, mucho antes de que existieran pruebas directas de que una mutación es un
cambio estable y heredable de la secuencia de nucleótidos de DNA. Creían que las mutaciones
podían originarse a partir de la alteración de pares aislados de nucleótidos y de la adición o deleción
de uno o dos pares de nucleótidos en las regiones codificantes de un gen.
Las mutaciones condicionales son las que se expresan sólo bajo determinadas condiciones
del entorno. Por ejemplo, una mutación condicional letal en E. coli podría no expresarse en
condiciones permisivas tales como temperaturas bajas, pero se expresaría en condiciones
restrictivas, como una temperatura elevada.
Las mutaciones bioquímicas son las que provocan un cambio en la bioquímica de la célula.
Dado que estas mutaciones afectan a menudo una vía de biosíntesis, con frecuencia hacen que un
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Garbocci, Ledesma.
microorganismo sea incapaz de crecer en un medio que carece del aporte adecuado del producto
final de la vía biosintética inactivada. Es decir, el mutante es capaz de crecer en un medio mínimo y
requiere suplementos de nutrientes. Este tipo de mutantes recibe el nombre de auxótrofos, mientras
que las cepas microbianas que pueden crecer en medios mínimos se denominan prototrofos.
Un mutante resistente es un tipo particular de mutante bioquímico que adquiere resistencia
frente a un determinado patógeno, agente químico o antibiótico.
Las mutaciones pueden ser espontáneas o inducidas. Las mutaciones espontáneas pueden
surgir como consecuencia de la acción de la radiación natural que altera la estructura de las bases
del DNA. Estas pueden ocurrir durante la replicación, como resultado de errores en el apareamiento
de las bases, originando cambios en el DNA replicado.
Las mutaciones que implican un par de bases (o unos pocos pares), se conocen
generalmente como mutaciones puntuales (en el cuadro de la página 9 aparecen como directas).
Estas pueden ser el resultado de sustitución de pares de bases en el DNA o de la inserción o
deleción de un par de bases. Como en toda mutación, el cambio fenotípico derivado de una mutación
puntual depende de dónde ocurra exactamente la mutación en el gen, que cambio de nucleótido tuvo
lugar, y qué producto codifica dicho gen.
Si dentro de la región codificante de un gen que codifica para una proteína ocurre una
mutación puntual, cualquier cambio en el fenotipo de la célula es probablemente consecuencia de un
cambio en la secuencia de la proteína producida. El error en el DNA se transcribe al mRNA, y este
RNA erróneo se usa a su vez como molde en la traducción de proteínas. No hay que olvidar que el
código genético es degenerado, lo que significa que no todas las mutaciones en los genes que
codifican proteínas causan cambios en las proteínas. Aquellos cambios de base que no afectan el
resultado final (usualmente es un cambio en la tercer base del codón), se denominan mutaciones
silenciosas. Cambios en la primera o segunda base del triplete conducen con mucha más frecuencia
a cambios significativos en la proteína; esto se conoce como mutación con sentido erróneo, porque el
sentido químico del polipéptido resultante ha cambiado. Si en cambio ocurriera en una posición
crítica de la cadena polipeptídica, la proteína podría ser inactiva o tener actividad reducida. Una
mutación con sentido erróneo puede conducir a una enzima que es sensible a la temperatura
(mutación condicional letal previamente mencionada).
Otro resultado posible de la sustitución de pares de bases es la formación de un codón de
parada, causaría la terminación prematura de la traducción, originando una proteína incompleta que,
casi seguro, no será funcional. Las mutaciones de este tipo se llaman mutaciones sin sentido porque
el cambio es de un codón para un aminoácido (codón con sentido) a un codón de terminación (codón
sin sentido). A menos que la mutación sin sentido ocurra muy cerca del final del gen, la proteína
incompleta será totalmente inactiva.
Como el código genético se lee desde un extremo en bloques consecutivos de tres bases,
cualquier deleción o inserción de un par de bases origina un desfase en el marco de lectura y la
traducción del gen es completamente alterada. A menudo, puede lograrse la restauración parcial de
la función de un gen mediante la inserción de otro par de bases cerca de la delecionada (una especie
de mutación supresora). Después de la corrección, la proteína formada puede tener algo de actividad
biológica o incluso ser completamente normal dependiendo de los aminoácidos codificados por la
región defectuosa.
Las mutaciones puntuales son reversibles. Un revertiente se define operativamente como una
cepa en la que se ha restaurado el fenotipo silvestre. Los revertientes pueden ser de dos tipos: 1)
revertientes de un mismo sitio, la mutación que restaura la actividad ocurre en el mismo sitio en que
ocurrió la mutación original (si la mutación hacia atrás no sólo es en el mismo sitio sino que, además,
conduce a la secuencia silvestre, se denomina verdadero revertiente); 2) los revertientes de segundo
sitio, presentan una mutación en un sitio diferente en el DNA.

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Garbocci, Ledesma.
Las mutaciones en un segundo sitio pueden restaurar un fenotipo silvestre debido a varios
tipos de mutaciones supresoras que restauran el fenotipo original. Las mutaciones supresoras son
nuevas mutaciones que compensan el efecto de la mutación original. Se conocen varios tipos de
mutaciones supresoras: 1) una mutación en otra parte del mismo gen puede restaurar la función
génica (por ejemplo una mutación por desfase del marco de lectura); 2) una mutación en otro gen
puede restaurar la función del gen mutado original y la del fenotipo silvestre; y 3) una mutación en
otro gen puede originar la producción de otra enzima capaz de reemplazar a la mutada usando una
vía metabólica diferente a la usada por la enzima mutante. En este último caso no existe producción
de la enzima original, pero en los otros dos sí.
Las mutaciones por deleciones son mutaciones en las que se ha eliminado una región del
DNA. Estas deleciones pueden implicar la pérdida de varios cientos o miles de pares de bases. La
deleción de un gran segmento de DNA ocasiona la pérdida total de la función de cualquier gen
implicado. Algunas deleciones son tan grandes que afectan varios genes. Tales mutaciones no
pueden ser restauradas por otras mutaciones sino sólo mediante recombinación genética.
Las inserciones ocurren cuando se añaden nuevas bases al DNA. Las inserciones grandes
son el resultado de errores que ocurren durante la recombinación genética; inactivan el gen en el que
ocurren. Muchas de estas mutaciones son debido a inserciones de secuencias de DNA específicas
identificables de DNA (de 700 a 1400 pares de bases) llamadas secuencias de inserción, un tipo de
elemento transponible. Otros tipos de mutaciones a gran escala parecen implicar reordenamientos
causados por errores en la recombinación. Estos incluyen traslaciones, en la que largos fragmentos
de DNA cromosómico se mueven a una localización diferente, y las inversiones, en las que la
orientación de un segmento particular de DNA resulta invertida con respecto al DNA circundante.
Mientras que la frecuencia de mutación espontánea es muy baja, hay una variedad de
agentes químicos, físicos y biológicos que pueden incrementar la velocidad de mutación, y se dice
que inducen a mutaciones. Estos agentes se conocen como mutágenos.
Mutágenos químicos: son compuestos químicos capaces de alterar las estructuras del ADN
de forma brusca, como por ejemplo el ácido nitroso (agente desaminizante), brominas y algunos de
sus compuestos.
Mutágenos físicos: son radiaciones que pueden alterar la secuencia y estructura del ADN.
Son ejemplos la radiación ultravioleta que origina dímeros de pirimidina (generalmente de timina), y la
radiación gamma y la alfa que son ionizantes. También se consideran agentes físicos los
ultrasonidos,con 400.000 vibraciones por segundo,que han inducido mutaciones en Drosophila y en
algunas plantas superiores, y centrifugación, que también producen variaciones cromosómicas
estructurales.
Mutágenos biológicos: son aquellos organismos “vivos” que pueden alterar las secuencias
del material genético de su hospedador; como por ejemplo; virus, bacterias y hongos. Son ejemplo
los transposones (fragmentos autónomos de ADN).
Dentro de los mutágenos químicos podemos encontrar varias clases. Algunos son análogos
de bases ya que se parecen estructuralmente a las bases púricas y pirimídicas del DNA pero
muestran propiedades erróneas de apareamiento. Cuando uno de estos análogos se incorpora al
DNA, la replicación puede ocurrir normalmente, pero ocasionalmente ocurren errores de copia que
llevan a la incorporación de una base equivocada en la cadena copiada. La mutación se revela en la
subsiguiente segregación de esta cadena.
Algunos mutágenos químicos reaccionan directamente con la cadena de DNA, causando
cambios químicos en una u otra base, lo que ocasiona el apareamiento erróneo u otros cambios. Los
agentes alquilantes, tales como la nitrosoguanidina, son poderosos mutágenos y generalmente
inducen mutaciones con mayores frecuencias que los análogos de bases, incluso en DNA que no se
está replicando (los análogos de bases actúan solo tras su incorporación durante la replicación).
Tanto los análogos de bases como los agentes alquilantes tienden a inducir sustituciones de pares de
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Garbocci, Ledesma.
bases. Un grupo interesante de sustancias, las acridinas, son moléculas planas que actúan como
agentes intercalantes. Estos mutágenos se insertan entre dos pares de bases del DNA, separándolas
entre sí. Durante la replicación esta conformación anormal puede conducir a inserciones o deleciones
en el DNA (por ende pueden inducir mutaciones por desfase). El bromuro de etidio, utilizado
frecuentemente para visualizar DNA en geles de electroforesis es también un agente intercalante.
Varias formas de radiación son altamente mutagénicas. Podemos dividir la radiación
mutagénica en dos categorías principales, las ionizantes y no ionizantes (electromagnéticas).
Las bases púricas y pirimídicas de los ácidos nucleicos absorben intensamente radiación
ultravioleta (UV), y con un máximo de absorción para el DNA y el RNA de 260 nm. Las proteínas
también absorben radiación UV, pero tienen un máximo en 280 nm debido a la absorción de los
anillos aromáticos. Está bien establecido que la muerte de las células por radiación UV se debe
principalmente a su acción sobre el DNA, de manera que la radiación de 260 nm es la más efectiva
como agente letal. Aunque se conocen varios efectos, uno bien establecido es la inducción a la
formación de dímeros de pirimidina en el DNA, un estado en que dos bases pirimídicas adyacentes
se unen covalentemente, de manera que se incrementa en gran medida la probabilidad de que
durante la replicación del DNA, la DNA polimerasa inserte un nucleótido incorrecto en dicha posición.
La radiación ionizante es una forma de radiación más potente e incluye rayos de longitud de
onda corta, tales como rayos X, rayos cósmicos y rayos gamma. Estas radiaciones causan la
ionización del agua y otras sustancias, y los efectos mutagénicos se producen indirectamente a
causa de esta ionización. Entre las potentes especies químicas formadas por la radiación ionizante
están los radicales libres, de los cuales el más importante es el radical hidroxilo (OH⋅). Los radicales
libres reaccionan e inactivan macromoléculas celulares, siendo la más importante el DNA (no debido
a su sensibilidad frente a otras moléculas, sino debido a que los cambios inducidos en él tienen un
efecto permanente). A bajas dosis de radiación ionizante, sólo ocurren unos pocos impactos en el
DNA, pero altas dosis ocurren impactos múltiples que conducen a la muerte de las células. Tiene
una mayor penetración que la radiación UV, pero debido a que es más peligrosa de usar y está
menos disponible, se emplea poco en microorganismos.
Agentes Acción Resultado

Análogos de las bases

5-Bromouracilo Incorporado como T; falso Par AT > par GC

apareamiento ocasional con G a veces GC > AT

2-Aminopurina Incorporada como A; falso AT > CG

apareamiento con C. a veces GC > AT

Compuestos que reaccionan con DNA

Ácido nitroso Desamina A y C AT > CG y GC > AT

Hidroxilamina Reacciona con C GC > AT

Agentes alquilantes

Monofuncional: etil metano Introduce metilo en G; falso GC > AT

sulfonato apareamiento con T

Bifuncional: nitrosoguanidina Entrecruzamiento de las cadenas Mutaciones puntuales y

de DNA, región cortada por la deleciones
DNasa

Intercalantes

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Garbocci, Ledesma.
Acridinas y bromuro de etidio Inserción entre dos pares de Microinserciones y
bases microdeleciones

Radiación

Ultravioleta Formación de dímeros de La reparación puede originar

pirimidina deleción o error

Radiación ionizante Ataque de radicales libres al DNA, La reparación puede originar

rotura de cadena deleción o error
Las células cuentan con mecanismos complejos que vigilan la integridad del DNA, activando
mecanismos de reparación cuando hay deficiencias o errores durante la replicación. Una
consecuencia potencial de los daños son las alteraciones permanentes en la estructura del DNA que
pueden generar mutaciones, transformación carcinogénica y muerte celular. Estos son atribuidos a
diferentes agentes endógenos como los radicales libres de oxígeno (RLO) provenientes de la
respiración, los cuales son considerados el centro de la carcinogénesis y el envejecimiento por daño
genómico; agentes exógenos como la luz ultravioleta que inducen dímeros de pirimidina y la
radiación ionizante que produce una gran variedad de daños sobre las bases, muchos de ellos por
efecto indirecto. También se encuentran las genotoxinas presentes en los alimentos, humo de tabaco
y agentes quimioterapéuticos, con grandes cualidades para alterar la estructura de la molécula DNA
e interferir con su expresión. Los procesos de reparación del ADN reconocen, remueven y reparan
errores en la molécula, constituyendo los principales mecanismos celulares que garantizan la
estabilidad genética y, consecuentemente, la propia supervivencia de la célula. Los procesos de
reparación de DNA pueden agruparse en tres categorías: 1) reparación directa; 2) mecanismos por
sistemas de reparación indirecta; y 3) mecanismos de reparación de quiebres en doble cadena.
La reparación directa es realizada por la acción de una única enzima
capaz de reparar la lesión, sin necesidad de sustituir la base dañada. Así, la
estructura original de la molécula del DNA revierte la lesión. Existen tres
mecanismos en la reparación directa: fotorreactivación, alquiltransferencia y
desmetilación oxidativa.
Fotorreactivación: La radiación UV (longitud de onda entre 250 y 320 nm),
puede ocasionar alteraciones químicas en las bases del DNA. Los fotoproductos
de estas reacciones originan los dímeros de pirimidinas ciclobutano, pirimidina y
pirimidonina que causan efectos deletéreos como la inhibición de la replicación y
de la transcripción, el aumento en la aparición de mutaciones, la detención del
ciclo celular y la muerte celular. Los efectos mutagénicos generados por la
radiación UV son invertidos por un proceso llamado fotorreactivación, catalizado
por una fotoliasa, que posee dos cromóforos que captan un fotón, cuya energía
es utilizada para revertir el dímero, es decir quiebra el enlace covalente entre las
pirimidinas reparando el daño en el DNA.
Alquiltransferencia: Este mecanismo es reconocido por la
remoción de aductos alquilo en las bases del DNA. Generalmente
estos grupos son incorporados al DNA como agentes químicos
alquilantes o enzimáticos. Una de las alteraciones más conocidas en
el DNA es la metilación de restos de guanina para formar
O6-metilguanina para lo cual la célula utiliza enzimas “suicidas”
llamadas alquiltransferasas, que desplazan el grupo metilo desde la
guanina al centro activo de la cisteína, llevando a la inactivación
irreversible de la proteína O6-metilguanina-DNA metiltransferasa.

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Garbocci, Ledesma.
Desmetilación oxidativa: Este tipo de reparación remueve daños por metilaciones en el DNA
que pueden ser citotóxicas y con frecuencia presentan acción mutagénica, causada por compuestos
nocivos que se producen de forma endógena como estrés oxidativo, inflamación, peroxidación de
lípidos, infecciones y otros procesos metabólicos naturales como la alteración de la microbiota
intestinal. Todos los organismos tienen múltiples estrategias de reparación para contrarrestar daños
al DNA, como por ejemplo las alquilaciones en E. coli, específicamente la proteína AlkB, la cual se
encarga de desmetilar oxidativamente las bases lesionadas, revertiéndolas para adenina y citosina
respectivamente, liberando el grupo metilo en formaldehído.
Los sistemas de reparación indirecta son aquellos que intervienen sobre el DNA, durante la
replicación, transcripción o sobre hebras de DNA fragmentadas. La DNA polimerasa y algunos de los
componentes moleculares del mecanismo de replicación, llevan a cabo la supervisión de la copia
recién sintetizada. Existen tres mecanismos en la reparación indirecta: reparación por escisión de
bases o BER (Base Excision Repair), reparación por escisión de nucleótidos o NER (Nucleotide
Excision Repair) y reparación por apareamiento erróneo (Mitsmach Repair). El principio de los tres
mecanismos de reparación implica: corte, empalme de la región dañada e inserción de nuevas
bases, seguido por la ligación de la cadena.
Reparación por escisión de bases (BER): Es una vía de reparación
del DNA que corrige daños oxidativos, derivados de la alquilación celular y
despurinizaciones espontáneas. Es utilizada por la célula para la protección
contra daños y pérdidas de bases generando sitios apurínicos o
apirimidínicos, más conocidos como sitios AP, los cuales pueden ser
mutagénicos y citotóxicos si no son reparados correctamente, tornándose
una amenaza para la viabilidad celular e integridad genómica puesto que
pueden bloquear la replicación o la transcripción. En la reparación BER, la
base alterada es retirada del DNA por enzimas llamadas glicosilasas, que
reconocen y remueven la escisión de bases con daños específicos.
Después de ser retirada la base por la acción de la glicosilasa específica, el
sitio AP es reconocido por una AP-endonucleasa de la clase II, una enzima
capaz de eliminar el resto del nucleótido ya sea por eliminación βeta o por
hidrólisis produciendo un corte; posteriormente, una exonucleasa degrada el
corte y deja un espacio en la cadena que es reparado por la DNA
polimerasa y finalmente sellado por la ligasa, que restaura la integridad de la
molécula.
Reparación por escisión de nucleótidos (NER): Repara
daños en DNA causados por la radiación UV, agentes
mutagénicos, quimioterapia, entre otros. En este mecanismo de
reparación participan diferentes proteínas, 4 en procariotas (UvrA,
UvrB, UvrC y UvrD). El complejo de polipéptidos (UvrABC) actúa
como endonucleasa, localizando la lesión y removiendo los
nucleótidos con daño. El mecanismo NER en eucariotas presenta
las siguientes etapas: realiza un reconocimiento del daño en el
DNA; posteriormente, reclutan complejos de reparación a través
de la acción de las helicasas, induciendo una incisión en la hebra
con daño por acción de las nucleasas, en un fragmento de 24 a 32
nucleótidos. Posteriormente, la síntesis y ligación son realizadas
por la DNA polimerasa I y la ligasa.
Reparación por apareamiento erróneo (MMR): El mecanismo de reparación de errores de
apareamiento (MMR), es responsable de remover las bases desapareadas,
causadas por daños espontáneos, desaminación de bases, oxidación,
8
Garbocci, Ledesma.
metilación y daños en los procesos de replicación o recombinación. La importancia del MMR radica
en mantener la estabilidad genómica y reducir las mutaciones durante la replicación. El MMR en
eucariotas y en la mayoría de las bacterias dirige la reparación de la hebra con error, mediante el
reconocimiento de las discontinuidades de cadena. El MMR presenta complejas reacciones que
comprometen múltiples proteínas, el reconocimiento de la lesión es realizado por un complejo
compuesto por la unión de dos proteínas homólogas que forman un dímero, el cual se une al sitio del
apareamiento erróneo. Posteriormente, el complejo MutL en presencia de ATP, reconoce la
secuencia de DNA hemimetilado generando un rompimiento de la cadena debido a su actividad de
endonucleasa. El segmento lesionado es removido por la helicasa UVrD y degradado por una
exonucleasa, finalmente la síntesis y ligación es realizada por DNA polimerasa III y la DNA ligasa.
Uno de los daños más severos al DNA, son los cortes en cadena doble, los cuales surgen
por múltiples causas, tanto endógenas como exógenas. Existen dos vías principales para la
reparación de los cortes en cadena doble, la recombinación homóloga y la recombinación de
extremos no homólogos, las cuales son libres y propensas a errores respectivamente.
Reparación por recombinación homóloga (HR): Este sistema detecta y repara daños
generados por agentes químicos, físicos y radicales libres
derivados del ciclo celular. La eficiencia de los reparos se
debe a la proximidad entre las cromátidas hermanas que
tienen información idéntica, de esta forma es activada una
cascada de reacciones junto con las proteínas de reparo que
bloquean el ciclo celular. Una de las proteínas que actúa en
este proceso es la Rad51, es homóloga a RecA en bacterias.
Durante esta etapa, se estimula a RAD51 en el alineamiento
de cadenas, de esta forma es sintetizada la cadena,
empleando como molde la secuencia homóloga que repara la
información perdida durante los cortes en cadena doble.
Finalmente, se forma una estructura de cadenas
entrecruzadas conocida como el intermediario de Holliday que
corta y liga el proceso de reparación de forma adecuada,
evitando rearreglos cromosomales.
Reparación por extremos no homólogos (NHEJ): La reparación
de quiebres de doble cadena en organismos superiores se da por
extremos no homólogos, este tipo de reparación permite la unión de
cadenas por sus extremos, y no necesita de secuencia complementaria
u homóloga para su unión. El sitio de corte es reconocido por un
complejo heterodímero de dos proteínas, que protegen el DNA de la
acción de exonucleasas y mantienen unidas las cadenas.
Posteriormente, el heterodímero es asociado por acción catalítica a la
quinasa (DNA-Pkcs) que se activa por la interacción de la cadena
sencilla con los cortes en cadena doble, se llevan a cabo la unión de las
cadenas. Finalmente, el procesamiento de las enzimas exonucleasa,
endonucleasa y helicasa terminan el proceso.
Todos los organismos pueden sufrir ataques masivos en su
material genético por diversos agentes que pueden alterar la estructura
química básica del DNA, como la luz ultravioleta, metabolitos, especies
reactivas de oxígeno, entre otras. Este tipo de daños dispara mecanismos de respuesta inmediata en
el DNA, que se caracterizan por tener niveles superiores de proteínas implicadas en reparación y
recombinación. La inducción de la respuesta celular al daño
implica la activación de los sistemas de puntos de control
9
Garbocci, Ledesma.
del ciclo celular, reparación del DNA, cambios en expresión génica, reconstrucción de la cromatina y
apoptosis. En procariotas una de estas opciones es la respuesta SOS (por la señal internacional de
auxilio “Save Our Souls”) o sistema de emergencia celular, que ante la detección de agentes
genotóxicos incrementa la expresión de un grupo de genes cuya función es la de reparar el daño en
el DNA, y conferir a la célula más oportunidades de sobreponerse y sobrevivir en condiciones de
estrés.
En el sistema regulador SOS, el daño actúa como una señal de estrés para la célula,
originando la inducción de varias funciones celulares implicadas en la reparación. Una vez que el
daño ha sido reparado, el sistema SOS se desconecta y cesa la mutagénesis. Además de su efecto
sobre la mutagénesis celular, el sistema regulador SOS juega un papel central en la regulación de la
replicación de los virus temperados.
Debe resaltarse que no toda la reparación del DNA ocurre en ausencia de las instrucciones
del DNA molde. Muchos sistemas de reparación requieren las instrucciones del molde y llevan a cabo
una reparación correcta. Parece que estos sistemas de reparación funcionan la mayor parte del
tiempo pero que no son suficientes para reparar todo el daño provocado por los agentes
mencionados anteriormente.
Cuando la replicación del DNA se estanca a causa de serios daños en el mismo, la célula
sustituye la DNA-polimerasa normal por polimerasas de reparación especiales que pueden pasar por
encima del DNA dañado, un proceso conocido como síntesis translesión. Incluso si no se dispone de
un molde para permitir la inserción de las bases correctas, es menos peligroso rellenar el hueco que
dejar el DNA roto o dañado. En consecuencia, la síntesis translesión genera muchos errores.
Todos los organismos pueden sufrir ataques masivos en su material genético por diversos
agentes que pueden alterar la estructura química básica del ADN, como la luz ultravioleta,
metabolitos, especies reactivas de oxígeno, entre otras. Este tipo de daños dispara mecanismos de
respuesta inmediata en el ADN, que se caracterizan por tener niveles superiores de proteínas
implicadas en reparación y recombinación. La inducción de la respuesta celular al daño implica la
activación de los sistemas de puntos de control del ciclo celular, reparación del ADN, cambios en
expresión génica, reconstrucción de la cromatina y apoptosis. En procariotas una de estas opciones
es la respuesta SOS (por la señal internacional de auxilio “Save Our Souls”) o sistema de emergencia
celular, que ante la detección de agentes genotóxicos incrementa la expresión de un grupo de genes
cuya función es la de reparar el daño en el ADN, y conferir a la célula más oportunidades de
sobreponerse y sobrevivir en condiciones de estrés. SOS es una respuesta de emergencia celular,
que consiste en inducir la expresión de más de 60 genes implicados en la reparación del ADN, y
mediada por el circuito RecA/LexA encargado de regular y modular importantes funciones
bacterianas en procesos de reparación, con el objetivo de restaurar la división celular y con ello
garantizar su supervivencia. La proteína LexA es un regulador negativo que reconoce una secuencia
consenso en el operador, causando una represión transcripcional de todos los genes SOS, incluido
su propio gen. El represor LexA se proteoliza induciendo la expresión génica SOS gracias a la
presencia de RecA, el regulador positivo del circuito que es activado mediante la unión de las
cadenas sencillas de ADN con ATP, después de la interacción con moléculas de señalización.
Finalmente, una vez reparados los daños, RecA se inactiva y LexA reprime nuevamente los genes
del operador.2
El Test de Ames hace uso práctico de las mutaciones bacterianas para detectar sustancias
químicamente potencialmente peligrosas en el medio.

2
Extraído del paper “PRINCIPALES MECANISMOS DE REPARACIÓN DE DAÑOS EN LA MOLÉCULA DE
ADN” de Yaliana Tafurt Cardona y Maria Aparecida Marin Morales.

10
Garbocci, Ledesma.
No es necesariamente cierto que si un compuesto es mutágeno es también cancerígeno. La
correlación, sin embargo, es alta, y saber que un compuesto es mutágeno en bacterias es una
advertencia de posible peligro.
El método estándar para analizar sustancias químicas como posibles mutágenos es buscar
un aumento en la tasa de retromutación (reversión) de las cepas auxótrofas de las bacterias en
presencia de un presunto mutágeno. Es importante que la cepa auxótrofa contenga una mutación
puntual. Las células de este auxótrofo no crecerán en un medio que carezca del nutriente necesario.
Sin embargo, si los retromutantes están presentes, estas células formarán colonias. Así si se
extiende un preparado sobre la superficie de una sola placa, es posible detectar revertientes por las
colonias que forman. Por otra parte, si la tasa de reversión se ha incrementado por la presencia de
un mutágeno químico, el número de colonias revertantes será mayor.
Dos elementos adicionales han sido introducidos en la prueba de Ames para hacerlo más
eficaz. El primero de ellos es el uso de cepas de prueba que utilizan casi exclusivamente rutas de
reparación propensas a error para reparar el DNA dañado; por lo tanto, los mecanismos de
reparación se han minimizado. El segundo elemento es la adición de preparaciones de enzimas
hepáticas para convertir las sustancias analizadas en sus formas mutágenas activas. Está
ampliamente demostrado que muchos carcinogénicos no son directamente cancerígenos o
mutágenos por sí mismos, sino que sufren modificaciones en el cuerpo humano que los convierten
en sustancias activas; estos cambios tienen lugar principalmente en el hígado.
En la prueba de Ames se utiliza en primer lugar una preparación de enzimas de hígado de
rata para activar el compuesto que se va a analizar. El complejo activado se empapa en un disco de
papel de filtro situado en el centro de una placa en la que se ha depositado una cepa bacteriana
adecuada. Tras toda una noche de incubación, se puede detectar la mutagénesis del compuesto
buscando un halo de retromutaciones en la zona alrededor del disco de papel. Siempre hay que
realizar el ensayo con varias concentraciones del compuesto y con los correspondientes controles
positivos (mutágenos conocidos) y negativos (sin mutágenos), porque la actividad mutagénica de los
compuestos varía y puede resultar letal a concentraciones muy altas.
El experimento original empleó dos placas de petri inoculadas con un cultivo de un mutante
de Salmonella enterica auxótrofa para histidina. El medio no presentaba histidina, de modo que sólo
las células que tenían la capacidad de revertir hacia el tipo salvaje podían crecer. Aparecieron
revertantes espontáneos en ambas placas, pero el producto químico de papel de filtro de la placa
prueba (derecha) había provocado un aumento en la tasa de mutación, lo cual era observable en el
gran número de colonias que lo rodeaba. No se vieron revertantes muy cerca del disco, ya que la
concentración del mutágeno allí es muy alta. La placa de la izquierda es el control negativo, el disco
de papel de filtro sólo contenía agua.
Es relativamente fácil detectar y aislar mutantes
seleccionables escogiendo las condiciones
ambientales adecuadas. Podemos detectar estas
mutaciones sólo mediante el exámen de gran
número de colonias y buscando las
<<diferentes>>, proceso llamado rastreo
(screening).

Los mutantes nutricionales defectivos

pueden ser detectados mediante la técnica de
réplica en placa. Con ayuda de un trozo de
terciopelo estéril se hace una réplica de las

11
Garbocci, Ledesma.
colonias de una placa madre en otra placa con medio pero sin el nutriente. Las colonias progenitoras
crecerán con normalidad y las colonias mutantes, no. Así, la incapacidad de una colonia para crecer
en la placa de réplica que contiene el medio mínimo indica que se trata de una colonia mutante. La
colonia de la placa madre correspondiente a la mancha ausente en la placa réplica se puede recoger,
purificar y caracterizar.
Un método ingenioso ampliamente utilizado para aislar auxótrofos es el método de selección
por penicilina. Normalmente, los mutantes que requieren nutrientes específicos están en desventaja
respecto de las células progenitoras, de modo que no hay manera directa de aislarlos. La penicilina
es un antibiótico que mata a las células en crecimiento. Si se añade penicilina a una población de
células en un medio carente del nutriente necesario para el mutante de interés, las células
progenitoras morirán, mientras que las células mutantes que no estén creciendo, no se verán
afectadas. Así, tras una incubación preliminar, la población se lava para eliminar la penicilina y se
transfiere a placas que contienen el nutriente. Las colonias que aparezcan incluirán algunas células
del tipo salvaje que hayan escapado a la acción de la penicilina, pero también habrá algunas del
mutante de interés. Por lo tanto, la selección por penicilina es una clase de selección negativa; la
selección no es para el mutante, sino contra el tipo progenitor.

12
Garbocci, Ledesma.

3.2. Mecanismos de intercambio de material genético: conjugación, transducción y

transformación. Mecanismos de recombinación. Nociones de tecnología de DNA
recombinante.
En procariotas se conocen tres mecanismos de intercambio genético: transformación, donde
el DNA libre procedente de una célula es captado por otra; transducción, donde la transferencia
genética es mediada por un virus; y conjugación, donde la transferencia de DNA implica contacto
entre células y la presencia de un plásmido conjugativo en la célula donadora. El DNA introducido
tiene tres posibles destinos, puede ser degradado por enzimas de restricción; puede replicarse; o
bien puede recombinarse con el cromosoma del hospedador.
La recombinación genética es el intercambio físico de DNA entre elementos genéticos. La
recombinación homóloga, un proceso por el que se realiza un intercambio genético entre secuencias
homólogas de DNA de fuentes diferentes. Las secuencias homólogas de DNA son aquellas que
tienen prácticamente la misma secuencia; por tanto, las bases se pueden aparear a lo largo de una
gran longitud de las dos moléculas de DNA. Este tipo de recombinación está implicado en el proceso
denominado entrecruzamiento en la genética clásica.
El mecanismo molecular de la recombinación homóloga emplea la proteína RecA como actor
principal. El proceso comienza con una endonucleasa, que corta una de las cadenas de DNA, la cual
es desplazada de la otra cadena. A continuación se une la proteína de unión a cadena sencilla al
segmento monocatenario resultante. Después la proteína RecA se une a la región monocatenaria y
forma un complejo que facilita el apareamiento con la secuencia complementaria en el segundo
dúplex de DNA, desplazando simultáneamente la cadena residente; como consecuencia se obtiene
el apareamiento de moléculas de DNA en fragmentos largos.
Por último, las moléculas unidas se separan por la acción de resolvasas, que cortan y vuelven
a unir las segundas cadenas(previamente reparadas). Según la orientación de la unión se forman dos
tipos de productos, parches y empalmes.
La recombinación genética en procariotas se produce tras la transferencia de fragmentos de
DNA homólogo de un cromosoma donador a una célula receptora mediante transformación,
transducción o conjugación. Sólo después de la transferencia, cuando el fragmento de DNA del
hospedador está en la célula receptora, se produce la recombinación homóloga. En procariotas se

13
Garbocci, Ledesma.
transfiere solo un fragmento del cromosoma; por lo tanto, si la recombinación no se produce, el DNA
se perderá porque no puede replicarse de manera independiente.
Para detectar el intercambio físico de segmentos de DNA, las células resultantes de la
recombinación deben ser fenotípicamente diferentes de ambos progenitores. Los cruzamientos
genéticos dependen de que se utilicen cepas receptoras que carezcan de algún carácter
seleccionable que los recombinantes ganarán.
La enorme sensibilidad del proceso de selección permite detectar incluso un número reducido
de células recombinantes en una población grande de células, no recombinantes. El único requisito
para la detección eficaz de la recombinación es que la tasa de retromutación para la característica
seleccionada sea baja, porque los revertientes también formarán colonias. Gran parte de la habilidad
del genético bacteriano radica en escoger los mutantes y los medios de cultivo adecuados para
obtener una detección eficiente de la recombinación genética.
Modelo de Holliday para la recombinación general recíproca: este modelo propone que si
tenemos dos DNAs con secuencias homólogas, entonces se produce una ruptura en cada uno de los
dos DNA, los cortes se producen en cadenas de igual polaridad. Luego ocurre la invasión del
extremo 3’-OH de la hebra del DNA donor en el DNA aceptor, en las zonas de homología. Los
extremos rotos invaden a la doble cadena contraria, una cadena sencilla desplaza a la cadena de su
misma polaridad y recíprocamente. Por esa invasión recíproca, los dos DNAs se entrecruzan y a
continuación se sellan por ligasas. Las dos dobles cadenas entrecruzadas forman el intermediario de
Holliday. Entonces, tiene lugar una migración del punto de cruce de las cadenas con un aporte
energético mínimo, ya que el número de pares de bases que desaparean corresponde al número de
pares de bases que aparean. La horquilla de recombinación se mueve. Esta migración origina una
región de DNA heteroduplex, doble cadena de distinta procedencia.
En la transformación de algunas bacterias se produce una forma no recíproca de
recombinación general, una recombinación no homóloga. Una porción de material genético es
insertada en el cromosoma mediante la incorporación de una cadena única para formar un segmento
de DNA heteroduplex. Se asocian segmentos homólogos de un donor externo y el aceptor (huésped),
se separan las hebras y se aparean algunas bases del aceptor con algunas bases del donor. Luego,
la endonucleasa corta la cadena del dador y también corta la cadena del aceptor. Las brechas de la
cadena se rellenan y unen. De esta manera, el aceptor pierde un fragmento pero integra otro.
Recombinación sitio específico: los intercambios tienen lugar en secuencias específicas de
DNA. El material genético no presenta homología con el cromosoma al que se une, y las enzimas
responsables de este proceso suelen ser específicas de cada virus en particular y de su huésped.
Los sistemas de recombinación sitio específica requieren una recombinasa y una secuencia única de
DNA corta sobre la que actúa la recombinasa (el sitio de recombinación). Es importante en la
integración de los genomas virales en los cromosomas bacterianos.
El resultado de la recombinación depende de la localización y la orientación de los sitios. Si
los dos sitios están en la misma molécula de DNA, la reacción da lugar a la deleción o la inversión del
DNA limitado por ellos, según si los sitios tienen la misma orientación u opuesta. Si los sitios están en
moléculas de DNA diferentes, la recombinación es intermolecular; si uno de los DNA, o los dos, son
circulares se produce una inserción.
Transposición de DNA: o recombinación replicadora, acompaña a la replicación de material
genético y no depende de la homología de las secuencias. Interviene un segmento corto de DNA con
la capacidad de trasladarse de un lugar del cromosoma (sitio dador) a otro en el mismo o diferente
cromosoma (sitio receptor). Estos elementos genéticos son llamados transposones. La homología de
las secuencias de ADN no es necesaria para este movimiento, denominado transposición.
La transformación es un proceso de transferencia genética por el cual el DNA es
incorporado en una célula receptora, llevando a cabo un cambio genético. Algunos procariotas son
naturalmente transformables. Cuando la célula es lisada suavemente, el DNA sale; debido a su gran
14
Garbocci, Ledesma.
longitud, los cromosomas bacterianos se rompen con
facilidad en fragmentos que contienen 10 genes
aproximadamente, el cual es el tamaño transformable
típico.
Incluso dentro de los géneros transformables, sólo
determinadas cepas o especies pueden transformarse.
Ser competente es la capacidad de aceptar DNA y ser
transformada, y está determinada genéticamente. La competencia en las bacterias más
transformables naturalmente está regulada; proteínas específicas de la competencia son la de unión
al DNA asociada a la membrana, una autolisina de la pared y varias nucleasas; también puede estar
regulada por un sistema de quórum.
Muchas cepas o géneros no son transformables naturalmente, pero se puede realizar de
forma artificial mediante un tratamiento con altas concentraciones de iones calcio en caliente, y
después se las enfría durante unos minutos. La electroporación es una técnica física que se utiliza
para introducir DNA en organismos difíciles de transformar; en él, las células se mezclan con DNA y
después se exponen a breves pulsos eléctricos de alto voltaje. Esto hace permeable la envoltura
celular y permite la entrada de DNA. Es un proceso fácil y funciona en la mayoría de las células, la
mayoría de las bacterias, algunos miembros de Archaea e incluso levaduras y algunas células
vegetales.
El DNA transformante se une a la superficie celular mediante una proteína de unión. A
continuación se introduce el fragmento bicatenario o bien una nucleasa degrada una cadena, y se
introduce la que queda. Tras la captación, el DNA se une a una proteína específica de competencia
que lo protege del ataque de nucleasas hasta alcanzar el cromosoma, donde se integra en el
genoma del receptor por recombinación.
Las bacterias pueden transformarse con DNA extraído de un virus bacteriano, proceso
denominado transfección. Si el DNA procede de un bacteriofago lítico, la trasfección lleva a la
producción de virus.
En la transducción, un virus bacteriano
(bacteriofago) transfiere DNA de una célula a otra. Los
virus pueden transferir los genes del hospedador de dos
maneras. En la primera, llamada transducción
generalizada, el DNA derivado de prácticamente
cualquier fragmento del hospedador es empaquetado en
el interior del virión maduro en lugar del genoma vírico. En la segunda, llamada transducción
especializada, el DNA de una región específica del cromosoma del hospedador se integra
directamente en el genoma del virus. Esto ocurre sólamente con algunos virus atemperados, el
bacteriofago transductor normalmente no es infeccioso (también llamadas partículas defectivas),
porque los genes bacterianos han sustituido todos o algunos de los genes víricos necesarios.
Durante la transducción generalizada una pequeña porción de la población recibe las
partículas transductoras , que inyectan el DNA que tienen empaquetado de la bacteria hospedadora
previa. Aunque este DNA no puede replicarse, puede sufrir recombinación genética con el DNA del
nuevo hospedador; la probabilidad de que una partícula transductora determinada contenga un gen
en concreto es bastante baja. Los fagos que forman estas partículas pueden ser atemperados o
virulentos; los requisitos fundamentales son poseer un mecanismo de empaquetamiento del DNA que
acepte el DNA del hospedador, y que dicho empaquetamiento se produzca antes de que el genoma
del hospedador se encuentre completamente degradado.
La transducción especializada permite una transferencia extremadamente eficiente, pero es
selectiva y transfiere solo una pequeña región del cromosoma bacteriano. Un caso muy plásmido
estudiado es el fago lambda atemperado en E. coli. Cuando este fago convierte en lisógena una
15
Garbocci, Ledesma.
célula hospedadora, el genoma del fago se integra en el DNA del hospedador en un sitio específico,
próxima al grupo de genes que codifican las enzimas para la utilización de la galactosa. Tras la
inserción, la replicación del DNA vírico está bajo el control del cromosoma bacteriano. Por inducción,
el DNA vírico se separa del DNA del hospedador mediante un proceso que es inverso a la
integración; en ocasiones, el corte se hace incorrectamente, y algunos de los genes (el operón
galactosa) se cortan junto con el DNA del fago. Estos fagos alterados se llaman lambda dgal
(defectivo en galactosa), es defectiva porque ha perdido genes y no podrá producir un fago maduro
en la siguiente infección.
Para que un fago de lambda sea viable, hay un límite en la cantidad de DNA fágico que se
puede sustituir con DNA del hospedador.
La alteración del fenotipo de una célula hospedadora por lisogenia se denomina conversión
fágica. Hay dos casos especialmente estudiados, un cambio en la estructura de un polisacárido de la
superficie celular de Salmonella anatum; el segundo caso implica la conversión de cepas que no
producen toxinas en cepas productoras luego de la lisogenia, caso de Corynebacterium diphtheria.
Probablemente la lisogenia aporta un fuerte valor selectivo para la célula hospedadora, ya que
confiere resistencia a la infección de virus del mismo tipo.
La conjugación bacteriana (apareamiento) es un
mecanismo de transferencia genética que implica el
contacto entre células. La conjugación es un mecanismo
codificado por un plásmido; los plásmidos conjugativos
usan este mecanismo para transferir copias de sí mismos
a nuevas células hospedadoras. Por tanto, el proceso de
conjugación implica una célula donadora, que contiene el plásmido conjugativo, y una célula
receptora, que no lo contiene. Además, algunos elementos genéticos que no pueden transferirse, en
ocasiones pueden movilizarse durante la conjugación. Estos otros elementos genéticos pueden ser
otros plásmidos o el propio cromosoma del hospedador.
El plásmido F3 es la molécula de DNA circular que contiene algunos elementos transponibles
que permiten que el plásmido se integre en el cromosoma del hospedador; además tiene una región
larga de DNA, la región tra, que contiene genes que codifican las funciones de transferencia y
algunos con el apareamiento (relacionados con la síntesis del pelo sexual). Sólo las células
donadoras producen éstos pelos; el plásmido F (y los relacionados con él) codifican los pelos F.
Los pelos permiten el apareamiento específico entre las células donadoras y las receptoras.
El pelo forma un contacto con el receptor de la célula receptora y después se retrae desensamblando
sus subunidades, lo que genera que las células se atraigan entre sí.
La síntesis de DNA es necesaria para la transferencia de DNA por conjugación. Este DNA no
se sintetiza por replicación semiconservativa normal, sino por replicación del círculo rodante. La
transferencia del DNA es desencadenado por el contacto entre células, en el momento en que una
cadena del DNA circular del plásmido es cortado y transferido al receptor. A medida que se produce
esta transferencia, la síntesis de DNA por el mecanismo del círculo rodante reemplaza la cadena
transferida en el donador, mientras se sintetiza una cadena de DNA complementario en el receptor.
Así pues, al final del proceso, tanto el donador como el receptor tienen plásmidos completos.
Para la transferencia del plásmido F, si una célula donadora que contiene el F, llamada F+, se
acopla con una receptora que carece del plásmido, llamada F-, el resultado son dos F+.

3
F de fertilidad.
16
Garbocci, Ledesma.

Los plásmidos se pueden perder de una célula por curación, es un proceso espontáneo que
puede llevarse a cabo en poblaciones naturales en las que no hay presión de selección para
mantener el plásmido.
El plásmido F, puede en ocasiones, movilizar el cromosoma para la transferencia durante el
contacto entre células. El plásmido F es en realidad un episoma, un plásmido que puede integrarse al
cromosoma del hospedador y, cuando se integra, se pueden transferir los genes cromosómicos.
Después de la recombinación genética entre el donador y el receptor, la transferencia genética
horizontal por este mecanismo puede ser muy grande en cuanto al número y las clases diferentes de
genes cromosómicos que se transfieren.
Las células que poseen un plásmido F no integrado en el cromosoma se llaman F+. Las que
tienen un plásmido F integrado en el cromosoma son células Hfr4. Este término se refiere a las altas
tasas de recombinación genética entre genes del cromosoma donador y del cromosoma receptor.
Tanto las células F+ como las Hfr son donadoras, pero a diferencia de lo que ocurre entre una célula
F+ y una F-, la conjugación entre un donador Hfr y un F- lleva a la transferencia de genes del
cromosoma del hospedador.
Cuando se produce la recombinación entre una célula Hfr y una célula F-, el cromosoma de la
célula HFr (con su factor F integrado) se replica y una cadena parental del cromosoma se transfiere a
la célula receptora. La replicación del cromosoma HFr comienza en la mitad del factor F integrado y
un pequeño fragmento del factor F conduce a los genes cromosómicos hasta el interior de las células
F-. Por lo general, el cromosoma se rompe antes de transferirse por completo. Una vez dentro de la
célula receptora, el ADN de la célula donante puede recombinarse con el ADN de la célula receptora.
El ADN de la célula donante que no se integra es degradado. Por consiguiente, mediante la
conjugación con una célula HFr, una célula F- puede adquirir nuevas versiones de los genes
cromosómicos (como en la transformación). Sin embargo, sigue siendo F- porque no recibe el factor F
completo. Cuando una célula donante HFr pasa una porción de su cromosoma a una célula receptora
F- se produce una célula F- transconjugante. Nunca podría dar F+ porque para ello tendría que
pasarse todo el cromosoma.

Debido a que el plásmido F es un episoma, puede abandonar el

cromosoma bacteriano en el que está integrado. Durante este
proceso, el plásmido F en ocasiones, comete un error en la

4
High frequency of recombination, alta frecuencia de recombinación.
17
Garbocci, Ledesma.
escisión, de forma que adquiere una porción del material cromosómico y se convierte en un plásmido
F’. La célula F’ conserva todos sus genes, aunque algunos de ellos se encuentran en el plásmido, y
sigue cruzándose exclusivamente con un receptor F-. La conjugación F’ x F- es prácticamente
idéntica a la F+ x F-. Se transfiere el plásmido, pero habitualmente los genes bacterianos presentes
en el cromosoma no se transfieren. En cambio, los genes bacterianos del plásmido F’ sí son
transferidos con él y no necesitan incorporarse al cromosoma receptor para expresarse. El receptor
se convierte en F’ y es un merocigoto parcialmente diploide, puesto que contiene dos juegos de
genes, uno de ellos transportado por el plásmido. Este tipo de transferencia de genes bacterianos
recibe el nombre de sexoducción.
Experimento de Lederberg y Tatum: demostraron la conjugación bacteriana. Mezclaron dos
cepas auxótrofas, incubaron el cultivo durante varias horas en medio nutritivo y lo sembraron en
placas con medio mínimo. Para reducir la probabilidad de que los resultados se debieran a una
simple reversión, utilizaron auxótrofos dobles y triples bajo la suposición de que no se producirían de
forma simultánea dos o tres reversiones. Tras la incubación, aparecieron en el medio mínimo
colonias protótrofas recombinantes. Por lo tanto, los cromosomas de los dos auxótrofos fueron
capaces de recombinarse.
Experimento de Davis: demostró que era necesario el contacto físico entre las células para
que tuviera lugar la transferencia de genes. Construyó un tubo de vidrio con forma de U con un filtro
de vidrio poroso entre las ramas (0,2 um para permitir el paso de los medios, pero no el de las
bacterias). Se llenó el tubo en U con un medio nutritivo y en cada lado del filtro se inoculó una cepa
auxótrofa diferente de E. coli. Durante la incubación, se bombeó el medio de un lado al otro a través
del filtro para asegurarse de que tenía lugar el intercambio de medio entre las dos ramas del tubo.
Después de la incubación, las bacterias se sembraron en medio mínimo. Davis descubrió que
cuando dos cepas auxótrofos se separaron la una de la otra mediante un filtro no podía producirse la
transferencia génica. Por lo tanto, era necesario el contacto directo entre las bacterias para que haya
recombinación.
La elaboración de mapas del genoma es una técnica utilizada para localizar los genes en los
cromosomas. Para detectar intercambio genético entre dos organismos hay que usar marcadores
genéticos, cuya transferencia pueda ser detectada. Se usan cepas genéticamente alteradas por
mutaciones.
En el experimento de cruce interrumpido se
rompe el puente conjugativo y se detiene la
transferencia Hfr x F- a diferentes intervalos de tiempo
después del inicio de la conjugación mezclando
vigorosamente el cultivo con un agitador o batidora. Es
posible determinar el orden y el momento de la
transferencia génica porque son un reflejo directo del
orden de los genes en el cromosoma bacteriano. La
extrapolación de las curvas al eje de abscisas (x)
proporciona el momento en el que cada gen empezó a
entrar en el receptor. El resultado es un mapa
cromosómico circular con las distancias expresadas en
términos de los minutos transcurridos hasta que se
transfiere un gen.
Las alturas de las mesetas son menores para los genes que se encuentran más alejados del
factor F (el origen de la transferencia) debido a que cada vez hay una mayor probabilidad de que el
puente conjugativo se rompa espontáneamente a medida que progresa la transferencia.
Es preciso utilizar varias cepas Hfr con el plásmido integrado en distintas localizaciones; los
mapas obtenidos de cada una se superponen entre sí para formar el mapa completo.
18
Garbocci, Ledesma.
El ligamiento génico, o la proximidad de dos genes en el cromosoma, también puede
determinarse a partir del proceso de transformación midiendo la frecuencia con la que dos o más
genes transforman de forma simultánea una célula receptora. Cuanto más cerca estén los genes,
mayor será la frecuencia con la que serán transportados en el mismo fragmento y más elevada será
la frecuencia de cotransformación.
Transposones compuestos: además de los genes necesarios para la transposición, contienen
uno o más genes adicionales. Pueden contener genes que codifican para la resistencia a antibióticos
o genes que codifican toxinas. Se componen de una región central que contiene los genes extra,
flanqueados a ambos lados por IS5.
Los transposones bacterianos tienen cortas secuencias repetitivas (IR) en cada extremo, que
sirven de lugares de unión de la transposasa. La transposasa reconoce esas 2 secuencias y allí corta
el ADN.
El proceso de transposición en los procariotas conlleva una serie de acontecimientos, entre
ellos la autorreplicación y procesos de recombinación. En las bacterias hay dos rutas para la
transposición:
-Transposición simple: el transposón es escindido del DNA dador por cortes en ambos
extremos. Este proceso deja una rotura de cadena doble en el DNA dador, que debe ser reparada.
En el sitio diana se produce un corte, el transposón es insertado en la rotura y la replicación del DNA
llena el hueco para duplicar la secuencia del sitio diana.
La transposasa moviliza un pedazo de DNA y lo inserta (cromosoma a plásmido, plásmido a
cromosoma, cromosoma a cromosoma). Es no replicativa porque no deja copia en el lugar de donde
vino.
-Transposición replicativa: se replica el transposón completo, dejando atrás una copia en el
sitio que hace de dador.
El transposón original permanece en el sitio parental del cromosoma, mientras que en el DNA
diana se inserta una copia duplicada del mismo. Los sitios diana son secuencias específicas de unos
cinco a nueve pares de bases de longitud. Cuando un transposón se inserta en un sitio diana, la
secuencia diana se duplica, de forma que las secuencias terminales de repeticiones invertidas del
transposón están flanqueados por cortas repeticiones directas. No pierde DNA porque primeramente
lo réplica.
Transposones conjugativos: comparten genes de transferencia y se pueden mover entre
bacterias por conjugación.
Consecuencias de la inserción de un transposón: Se producen diversos efectos importantes.
Los transposones pueden insertarse dentro de un gen y provocar una mutación o un corrimiento del
marco de lectura.
Algunos transposones tienen secuencias de terminación, por lo que pueden bloquear la
traducción o la transcripción. Otros transposones contienen promotores, por lo que activan la
traducción o la transcripción de genes cercanos al punto de inserción. Los genes pueden activarse y
desactivarse por la inserción de transposones.
Los transposones contienen genes de resistencias a antibióticos y desempeñan un papel
fundamental en la generación de los plásmidos R. Dado que los plásmidos pueden tener varios sitios
diana diferentes, los transposones se desplazan entre ellos; de esta forma, los plásmidos actúan a la
vez de fuente y diana de transposones de genes de resistencia. Los plásmidos de múltiples
resistencias a fármacos a menudo se originan por acumulación de transposones en un único
plásmido.

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Los elementos IS solo presentan los genes necesarios para la transposición, entre ellos el gen de la
transposasa, y secuencias invertidas en los extremos.
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Garbocci, Ledesma.
Lab - Protocolo de Conjugación Bacteriana - Objetivo: Transferir el gen marcador de
resistencia a ATB Tetraciclina y el gen que codifica para la expresión de la proteína verde
fluorescente entre dos cepas de E. coli.
Cepas utilizadas: - Donora: E. coli S17-1: portador del plásmido pMP 6 que contiene el gen
para la expresión de la proteína verde fluorescente (gfp+) y es tetraciclina resistente, kanamicina
sensible (tetR, kmS) - Aceptora: E. coli SM10: gfp-, tetS, kmR
Protocolo del ensayo:
1- Preparar 5 ml de un cultivo de 20 horas a 37ºC con agitación de las cepas donora y aceptora en
caldo LB adicionado del antibiótico respectivo (tetraciclina 6 μg/ml, kanamicina 25 μg/ml).
2- A partir de los cultivos inocular 400μl en 10 ml de caldo LB con el antibiótico correspondiente y
crecer a 37ºC con agitación hasta fase log (aprox. 3 horas).
3- Preparar en tres tubos eppendorff las mezclas descriptas
en la siguiente tabla. Centrifugar a 6000 rpm durante 5 min.
4- Descartar el sobrenadante para eliminar el antibiótico y
resuspender en 50 μl de LB.
5- Plaquear los 50 μl de cada mezcla (1, 2, 3) en el centro de placas (botón) conteniendo agar LB sin
antibiótico y crecer 24 hs a 37ºC.
6- Adicionar a la superficie de cada placa 1 ml de caldo LB sin antibiótico y transferir a un tubo
eppendorff.
7- Determinar la concentración de transconjugantes: a partir de la mezcla del tubo 1 y sus diluciones
sembrar 100 μl (dilución final -1, -2 y -3) en agar LB con tetraciclina (6 μg/ml) y kanamicina (25
μg/ml), esparcir con espátula de vidrio.
8- Sembrar como controles negativos 100 μl del tubo 2 y 3 en LB con ambos antibióticos.
9- Determinar el número inicial de UFC/ml de E. coli tets-kmr (tubo 3): realizar diluciones en solución
fisiológica y sembrar (dil final -6, -7 y -8) con espátula de vidrio en LB con kanamicina. Incubar 24
horas a 37ªC.
10- Determinar la frecuencia de conjugación.
𝐶𝑡𝑟𝑎𝑛𝑠𝑐𝑜𝑛𝑗𝑢𝑔𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑁°𝑡𝑟𝑎𝑛𝑠𝑐𝑜𝑛𝑗𝑢𝑔𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠
𝐹𝑟𝑒𝑐𝑢𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑗𝑢𝑔𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 𝐶 −
= 𝑁°𝑎𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜𝑟𝑎𝑠
𝑏𝑎𝑐𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑠 𝐹

Resultados: A partir de las placas en las que se sembraron los resuspendidos (ítem 10), se
puede calcular la concentración de transconjugantes. Estos deberían encontrarse en el tubo 1
+ −
(bacterias 𝐹 y 𝐹 ), mientras que los tubos 2 y 3 son controles y no debería observarse crecimiento
ya que se siembran en un medio mínimo (no es un medio mínimo el LB) con ambos antibióticos. En
cambio, los transconjugantes pueden crecer en este medio porque adquirieron resistencia a ambos
antibióticos, pudiendo identificarse por la expresión de la proteína verde fluorescente. Por otro lado,
se debería observar crecimiento en los tres botones (ítem 7) dado a que el agar LB carece de los
+ − +
antibióticos. En el botón 1 crecerían bacterias 𝐹 y 𝐹 ; en el botón 2 crecerían bacterias 𝐹 ; y en el
−
botón 3 crecerían bacterias 𝐹 . A partir de las siembras de las siete diluciones seriadas (las últimas
−
tres), se puede calcular la concentración de bacterias 𝐹 , necesarias para calcular la frecuencia de
conjugación.
Comentarios: En la transformación, a diferencia de en la conjugación, no hay participación de
dos bacterias (ni contacto), sino que se trata de el ingreso de material genético desnudo a la célula
que se transforma (en este caso un plásmido). En la transformación, la bacteria debe estar o ser
competente al ingreso del material genético. Esto se lleva a cabo por shock térmico (en nuestro caso)
o electroporación. La competencia de las bacterias en estado natural se da en la fase exponencial
tardia, y por esto se supone que depende de quórum sensing (expresión del gen para la competencia
dependiente de la concentración de bacterias).

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Garbocci, Ledesma.
Protocolo de Transformación Bacteriana - Objetivo: Transferir el plásmido pHKT3, portador de
la secuencia que codifica para la proteína rojo fluorescente (rfp) y del gen marcador para la
resistencia a tetraciclina, a una cepa de Escherichia coli sensible a tetraciclina y rfp negativa.
Protocolo del ensayo:
1- Disponer de células de E. coli competentes.
2- Descongelar 100 μl de bacterias competentes y agregar 2μl del plásmido, dejar las células 30 min
en contacto con el plásmido.
3- Calentar 1 min a 42° C y colocar inmediatamente en hielo durante 1 minuto.
4- Agregar 1 ml de caldo LB e incubar 1 hora a 37° C.
5- Centrifugar a baja velocidad la mezcla de transformación y
descartar la mayor parte del sobrenadante de modo de
conservar aproximadamente 100ul.
6- Sembrar sobre placas con agar LB + Tetraciclina (10ug/ml),
toda la mezcla de transformación.
7- Incubar las placas durante 24 hs a 37°C.
8- Analizar la presencia de bacterias resistentes y fluorescencia
roja. Esquema del plásmido utilizado.
Resultados: Al sembrar la mezcla de transformación en
un agar conteniendo tetraciclina, solo deberían crecer las
bacterias que fueron transformadas, las cuales a su vez
deberían expresar la proteína rojo fluorescente. La eficiencia de transformación se calcula de la
𝑁° 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 𝑡𝑟𝑎𝑛𝑠𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠
siguiente manera: 𝐸𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑡𝑟𝑎𝑛𝑠𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝐴𝐷𝑁 𝑢𝑡𝑖𝑙𝑖𝑧𝑎𝑑𝑜 [μ𝑔]
Para mejorar la eficiencia de transformación puede mejorarse el método de competencia
(electroporación – shock térmico).
Protocolo mutagénesis bacteriana - Objetivo: Evidenciar el efecto letal de la radiación UV
sobre bacterias y los mecanismos de fotorreactivación.
Inactivación por UV y fotorreactivación - Día 1
1) Sembrar 7 placas de agar nutritivo con 100 ul de un cultivo de 16 hs de la cepa Pseudomonas
aeruginosa PAO 1.
2) Colocar todas las placas sin la tapa en el flujo laminar menos el control que permanecerá con la
tapa cerrada. Las placas deben estar alineadas a 8 cm desde la lámpara UV, la cual se encuentra en
la tapa del flujo.
3) Activar la luz UV y retirar pares de placas cada 5, 10 y 15 minutos de exposición.
4) Envolver una placa de cada tiempo en papel aluminio e Incubar a 32°C por 24 hs. La otra placa de
cada tiempo debe dejarse 3 hs sin tapa dentro del flujo laminar expuesta a luz blanca para permitir la
fotorreparación. Luego incubar a 32°C durante 24 hs.
Día 2: Contar el número de colonias en cada placa y comparar los resultados entre los
distintos tiempos y entre las placas mantenidas en oscuridad y las expuestas a la luz blanca.

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