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Instituto Politécnico

Nacional
Escuela Nacional de Ciencias
Biológicas
Laboratorio de Genética Microbiana
Práctica No. 4 Aislamiento de bacteriófagos
de fuentes naturales

Grupo: 5QV1

Secc. I Eq. 3

Integrantes: Chávez Góngora Ayla Anilú


Cevada Santiago Karen Jazmin

Fecha de entrega: 07 - Nov - 17


Práctica No. 4 Aislamiento de bacteriófagos de fuentes naturales

Objetivos

a) Conocer algunos aspectos de la metodología empleada en el trabajo con bacteriófagos.


b) Establecer algunas de las propiedades de las partículas fágicas que permiten su
identificación.
c) Aislar bacteriófagos a partir de muestras de agua negras.
d) Determinar el título y ciclo de multiplicación de los fagos presentes en la muestra de agua, con
base en su morfología de placa.

Introducción

Los virus son moléculas de DNA o RNA rodeadas por una envoltura proteica que necesitan células
viables para poder replicarse. Los virus utilizan la maquinaria metabólica de las células para
sintetizar su material genético y proteínas de la envoltura. Existen distintos tipos de virus que pueden
infectar células procariontes o células eucariontes. Los bacteriófagos o fagos son virus que se
reproducen en células procariontes.

El genoma de los fagos puede ser RNA de cadena simple (MS2, Qß), RNA de doble cadena (φ6),
DNA de cadena simple (φ X174, M13) o DNA de doble cadena (T3, T7, λ, T5, μ, T2, T4). Estos
ácidos nucleicos pueden contener bases inusuales que son sintetizadas por proteínas del fago. En
los T-pares el genoma no contiene citosina sino 5'- hidroximetilcitosina, mientras que en otros tipos
de fago alguna de las bases está parcialmente sustituida.

Los fagos son usualmente identificados por las placas, que forman en las colonias de las bacterias
sensibles a la infección. Una placa puede formarse cuando un fago es mezclado con un gran número
de bacterias susceptibles y la mezcla es colocada en un medio de agar. Puesto que la bacteria se
multiplica, eventualmente una será infectada por el fago, que se multiplica y termina lisando a la
bacteria, liberando más fagos. Al infectarse las bacterias que la rodean, el fago se esparce a través
de la multiplicación de la bacteria, que formaba el césped bacteriano. Tal que el fago original infecta
la primera bacteria, la placa interrumpe el césped, formando un punto claro en el agar. A pesar que
parecería una zona vacía, ese punto contiene millones de fagos.

De acuerdo al ciclo de multiplicación del fago pueden clasificarse en temperados, líticos o virulentos
y virulentos no citocidas.

Los fagos lisogénicos o temperados son aquellos que bien pueden multiplicarse vía ciclo lítico o
entran en un estado latente en la célula. En este estado latente la mayoría de los genes del fago no
se transcriben; el genoma del fago existe en un estado reprimido. Al DNA del fago en este estado
reprimido se le conoce como profago porque no es un fago, pero posee el potencial para producir
fagos. En la mayoría de los casos el DNA de fago realmente se integra en el cromosoma del
huésped y se replica junto con el cromosoma del huésped y se transmite a las células hijas. La célula
que alberga un profago no se ve negativamente afectada por la presencia del profago y el estado
lisogénico puede persistir indefinidamente. A la célula que alberga un profago se le conoce como
lisógena.
Los fagos líticos o virulentos son fagos que matan a la célula debido a la lisis al término del ciclo de
replicación del virus, mientras que los fagos virulentos no citocidas generan vesículas en la bacteria,
con ellas se liberan miles de fagos sin lisar a la bacteria.

Infectar células permisivas con un fago es suficientemente simple en principio. El fago y la bacteria
potencialmente hospedera sólo necesitan mezclarse juntos, y alguna bacteria y fago colisionarán
aleatoriamente, llevando a la infección del fago. Sin embargo, el porcentaje de las células que son
infectadas dependen de la concentración del fago y la bacteria. Si ambos se encuentran en mayor
concentración chocarán entre ellos e iniciarán la infección en mayor proporción que si están más
diluidos. La eficiencia de infección es afectada no sólo por la concentración del fago y la bacteria,
sino también por la proporción del fago en relación a la bacteria, la multiplicidad de infección (MOI).
Si el número de fagos excede el número de células a infectar se habla de una MOI alta.
Inversamente una baja MOI indica que las células sobrepasan el número de fagos.

Bacteriófago T4

Tipo de material genético: DNA doble cadena lineal


de 169kb

Ciclo de multiplicación: lítico

Morfología de placa: placas circulares, claras de 1-


2mm de diámetro con bordes regulares.

Tipo de receptor: lipopolilisacáridos (LPS) de la


bacteria.

Morfología del fago: cabeza icosaédrica, cuello y


cola como se muestra en la siguiente figura 

Libera alrededor de 100-200 virones.

Ciclo de multiplicación del bacteriófago T4

El ciclo de multiplicación de un bacteriófago T4 se puede dividir esquemáticamente en distintas


etapas, las que son comunes a otros virus líticos.

1. Adsorción: El virus se fija o adsorbe a componentes de la superficie celular que actúan como
receptores específicos. La zona de adsorción del virus es complementaria al receptor celular, por lo
tanto un determinado virus sólo puede infectar un número limitado de cepas celulares que contengan
a un determinado receptor.

2. Inyección del material genético viral: Después de la adsorción, se produce un cambio


configuracional en las proteínas de la placa basal, alguna de las cuales tienen actividad enzimática y
producen un poro en la membrana citoplasmática de la célula. La vaina del fago se contrae y el
material genético viral ingresa en la célula, mientras que la envoltura proteica queda en el exterior.

3. Replicación del material genético viral: El material genético viral que ingresa en una célula
contiene bases modificadas que evitan la degradación por nucleasas bacterianas. Esta modificación
consiste en la glicosilación y/o metilación de algunas determinadas bases. En el caso del fago T4 se
glucosila la base 5'-hidroximetilcitosina. Para lograr una efectiva replicación del genoma viral se
deben sintetizar algunas proteínas cuando el material genético ingresa en la célula. Estas proteínas
tempranas reparan el poro de la membrana citoplasmática por donde ingresó el genoma viral,
degradan el DNA bacteriano lo que proporciona una fuente de precursores, evita la síntesis de RNA
y proteínas bacterianas, y proporciona ribosomas para la síntesis de proteínas del fago. Además
algunas de estas proteínas tempranas participan en la síntesis de las bases inusuales. La forma de
replicación del genoma viral es dependiente del tipo de material genético (si es RNA o DNA, si es
simple o doble cadena). En el caso del fago T4, las moléculas replicadas se aparean en los extremos
y formando una molécula de DNA más larga denominada concatámero. Después una enzima corta
esta larga molécula lineal en moléculas más pequeñas de igual longitud.

4. Síntesis de las envolturas proteicas y empaquetamiento del DNA: Las proteínas de la envoltura
(cápside, vaina, fibras, etc.) son proteínas tardías que se sintetizan después de iniciada la replicación
del material genético. La síntesis de cada componente proteico se realiza separadamente, el material
genético es encapsidado antes del ensamble del resto de los componentes.

5. Ensamblaje de las envolturas: Todas las proteínas de la envoltura se ensamblan para formar
una partícula viral madura capaz de infectar a otra célula cuando sea liberada.

6. Lisis y liberación de las partículas virales: La lisis celular se debe a la síntesis de proteínas
tardías codificadas en el genoma del fago. En el fago T4, estas proteínas son enzimas que lesionan
la membrana citoplasmática y la pared celular se rompe permitiendo la salida de las partículas
virales, para seguir con el proceso de infección y su ciclo de multiplicación.

Bacteriófago λ lambda

Tipo de material genético: DNA lineal de doble


cadena de 50kb, que posee extremos
cohesivos.

Ciclo de multiplicación: temperado

Morfología de placa: placas circulares, claras de


2-4mm de diámetro con bordes regulares, y
formación de microcolonias dentro de la placa
lítica.

Tipo de receptor: proteína lamb transportadora


de maltosa.

Morfología del virus: cabeza icosaédrica, cuello


y cola como se muestra en la siguiente figura

Ciclo de multiplicación del bacteriófago λ lambda

En este caso el bacteriófago puede seguir dos vías de multiplicación la lisogénica o la lítica.
En primer lugar deben ocurrir los dos primerosprocesos de cualquiera de los ciclos de multiplicación
(que ya han sido explicados con anterioridad en T4)
1. Adsorción
2. inyección del material genético
Seguido de los procesos de cada una de las vías que siga. En el caso de la vía lisogénica ocurre lo
siguiente:
3. Integración del DNA viral al DNAl cromosomal: El material genético del fago se une con el d
e la célula huésped por medio de una recombinación sitio específico y así para comenzare
ciclo lisogénico.
4. Replicación del DNA viral: En este caso, la bacteria sigue su propio proceso de multiplicació
n por lo cual al estar el DNA integrado al DNA cromosomal, ambos DNA se replican juntos s
in consecuencias obvias. El DNA del fago que se integró dentro del cromosoma bacteriano
se denomina profago y las bacterias que contienen profagos se denominan bacterias lisogé
nicas.
Posteriormente el bacteriófago pude cambiar de ciclo pasando al lítico. Para ello primero se requiere
de una escisión del DNA viral del DNA cromosomal para inicial el ciclo lítico que ya ha sido
explicado con anterioridad. Ocurriendo los siguientes procesos:
1. Replicación del material genético viral
2. Síntesis de las envolturas proteicas y empaquetamiento del DNA
3. Ensamblaje de las envolturas
4. Lisis y liberación de las partículas virales

O bien desde un principio puede llevar a cabo la vía lítica.

Bacteriófago M13 / Ciclo de multiplicación del bacteriófago M13

Tipo de material genético: DNA


circular monocatenario de 3.5kb

Ciclo de multiplicación: no lítico.

Morfología de placa: placas


circulares, opacas de 1-2.2 mm de
diámetro con bordes difusos,

Tipo de receptor: reconoce al pili de


las bacterias con carácter de
donadora.

Morfología del virus: estructura


filamentosa figura. 

En este tipo de multiplicación ocurre lo siguiente.


1. Adsorción
2. inyección del material genético
3. síntesis de la cadena complementaria a la original
4. replicación del DNA viral: por círculo rotador usando como molde la cadena complementaría
para crear copias idénticas a la original.
5. Liberándose las partículas virales por extrucción.

Bibliografía

 http://www.microbiologybook.org/Spanish/chapter7.htm. BACTERIOLOGÍA – CAPÍTULO


SIETE: BACTERIÓFAGOS. Dr Gene Mayer. University of South Carolina School of Medicine.

 Klug, W.S., Cummings, M.R., Spencer, C.A., (2006).. Conceptos de Genética. Madrid:

PEARSON EDUCACIÓN. (8a edición).