Análisis Instrumental
INTRODUCCION A LA CROMATOGRAFÍA
1. Introducción
2. Clasificación de la cromatografía:
- Cromatografía de reparto
- Cromatografía de adsorción
3. Tipos de cromatografía:
- Cromatografía de papel
- Cromatografía de capa fina
- Cromatografía de columna
1. Introducción:
La importancia de las técnicas de separación es cada vez mas notoria y espectacular y su
aplicación ha contribuido con nitidez al desarrollo de la Química, aunque con especial
incidencia en la Química Analítica. Se observa un aumento importante en las técnicas
cromatográficas. La destilación por el contrario, sufre un brusco descenso debido al
auge de la cromatografía de gases que sin duda ha reducido drásticamente las ventajas
de la aplicación en Química Analítica de la primera.
La cromatografía es una técnica de separación de una mezcla de solutos, basada en la
diferente velocidad con que se mueve cada uno de los solutos a través de un medio
poroso, arrastrados por un disolvente en movimiento.
En los diversos sistemas empleados en cromatografía, la separación está basada en un
proceso de reparto múltiple o uno continuo de adsorción-desorción.
2. Clasificación de la cromatografía:
CROMATOGRAFÍA DE REPARTO:
Se basa en la separación de una mezcla de sustancias mediante el reparto existente entre
la fase móvil (disolvente) y la fase estacionaria, soportada sobre un sólido adecuado.
El disolvente puede ser un líquido (cromatografía líquido-líquido) o un gas
(cromatografía gas-líquido).
1. Cromatografía líquido- líquido:
Las técnicas mas generales de la separación líquido-líquido, se llevan a cabo sobre
celulosa o gel de sílice húmeda, pudiéndose realizar en forma de tira de papel, capa fina
o columna. El medio en cada caso actúa como soporte del agua, por lo que este tipo de
cromatografía se emplea fundamentalmente para la separación de sustancias solubles en
la misma.
En el papel la fase estacionaria son las células del mismo, y la fase móvil el disolvente.
El único factor que influye en el movimiento de un compuesto a lo largo del papel es la
solubilidad relativa de este en la fase móvil y en la estacionaria.
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Ley de reparto: soluto A, disolvente B y C
Concentración de A en B / concentración de A en C = constante = coeficiente de reparto
a temperatura constante
Recordemos que el reparto de una sustancia entre dos disolventes inmiscibles no se
afecta por la presencia de otras sustancias disueltas. El concepto de polaridad es
importante en cromatografía por dos motivos; por una parte la polaridad influye
notablemente en el comportamiento de una sustancia en disolución, y por otra, el poder
adsorbente sobre una molécula aumenta directamente con la polaridad de la misma, de
ahí su importancia para la elección de adsorbentes y disolventes.
Cromatografía de filtración sobre gel:
Es un tipo particular de cromatografía líquido-líquido, que se utiliza en la separación de
sustancias que poseen volúmenes moleculares diferentes. Se introdujo como técnica de
laboratorio con la creación del sephadex, que debido a su elevado contenido de grupos
hidroxilo, el producto tiene una afinidad por el agua, por lo que se hincha en presencia
de la misma o de una solución de electrolitos, formando un gel semitransparente.
2. Cromatografía gas-líquido:
Los principios teóricos son completamente análogos a los descritos anteriormente. Las
separaciones son función del reparto de las moléculas de soluto entre un líquido,
dispuesto sobre un sólido apropiado, y el flujo del gas del sistema:
- El líquido debe poseer muy baja volatilidad
- El soporte poseerá una gran superficie específica
- La fase estacionaria se elige con una estructura análoga a la de las sustancias que se
quieren separar
- Como la fase líquida no se elimina, las separaciones son reproducibles y como el
proceso está basado únicamente en el reparto, pueden introducirse grandes muestras
en la columna sin que existan colas. Esto hace que la técnica sea adecuada para
cromatografía preparativa y análisis de trazas.
CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN:
La adsorción es un fenómeno de superficie, que se manifiesta por un aumento de
concentración en la interfase que rodea el medio estacionario.
Es una técnica utilizada para la separación de muestras, de mezclas de compuestos,
tanto orgánicos como inorgánicos. La mezcla puede ser tanto de sustancias coloreadas
como de compuestos incoloros. Hemos de tener en cuenta: adsorbentes, disolventes y
aparatos.
Las separaciones llevadas a cabo en un disolvente líquido se denomina cromatografía
líquido-sólido, y si el disolvente es un gas se llama cromatografía gas-sólido.
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1. Cromatografía líquido-sólido:
Muchos de los sólidos empleados como adsorbentes en cromatografía de columna o de
capa fina son óxidos metálicos, óxidos hidratados y sales. Los mas populares son la gel
de sílice y la alúmina. En determinados casos también se emplean otros adsorbentes
especiales como el carbón activo y el nylon.
En el sentido cromatográfico el término adsorción se limita a las interacciones que
implican enlaces de hidrógeno o fuerzas electrostáticas. Cuando las interacciones son
iónicas el proceso se denomina Intercambio iónico.
Se aplica a la separación de sustancias de media o baja polaridad.
Cromatografía de intercambio iónico:
Se emplea en la separación de sustancias iónicas, tanto orgánicas como inorgánicas, de
polielectrolítos, como enzimas, proteínas, hormonas, virus, ácidos nucléicos y otras
sustancias biológicamente importantes.
Uno de los aspectos más importantes de la cromatografía es que, en un sistema
cromatográfico dado, el movimiento relativo de un compuesto con respecto al frente del
disolvente es una propiedad característica y reproducible. En el caso de las
cromatografías de papel y de capa fina se expresa el movimiento de un compuesto como
un valor de Rf o Rx.
En cualquier fenómeno de adsorción influyen tres variables independientes: adsorbente;
disolvente y sustancia a cromatografiar. La regla general es elegir la polaridad del
disolvente análoga a la muestra a emplear y en la mayoría de los casos adsorbentes
poderosos (activos) para sustancias no polares y adsorbentes con menos actividad para
sustancias mas polares.
Para conseguir la forma mas activa de adsorbente, se calienta fuertemente, eliminando
todo el agua y cualquier impureza orgánica. Los grados de menos actividad se
consiguen por adicción de cantidades conocidas de agua. A este proceso se le denomina
desactivado.
La cantidad de muestra en la cromatografía de adsorción es muy importante, puesto que
el poder adsorbente de la superficie disminuye marcadamente con el incremento de la
muestra, ya que se ocupan primero los centros mas activos. El resultado es la aparición
de colas en dirección al origen. Los mejores resultados se consiguen al aumentar tanto
como se pueda la relación adsorbente-muestra.
2. Cromatografía gas-sólido:
La cromatografía de adsorción de gases se emplea principalmente para la separación de
estos y muchos de los medios empleados tienen un alcance limitado.
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Debido a que la retención de sustancias volátiles decrece al disminuir la superficie
específica, la separación de gases de líquidos de elevado punto de ebullición puede
conseguirse escogiéndose el tipo apropiado.
3. Tipos de cromatografía:
CROMATOGRAFÍA DE PAPEL:
La separación se realiza sobre tiras u hojas de papel de filtro. Según las necesidades se
pueden adquirir varios tipos de papel cromatográfico, en los que varía el espesor y la
velocidad de flujo.
Aplicación de la muestra:
Se aplican siempre sobre el papel en forma de solución. Una vez elegidos el tamaño y la
calidad del papel que se va a utilizar, se dibuja con un lapicero una línea paralela al lado
por el que va a comenzar la cromatografía. Se marca sobre la línea del papel (a
distancias iguales), las señales de cada una de las muestras que se han de aplicar, para
poderlas identificar después.
Cuando la mezcla de sustancias está muy diluida hay que hacer varias aplicaciones,
secando la mancha después de cada aplicación.
Una vez se han secado las manchas sobre el papel, ya está este listo para el desarrollo,
nombre que se da al proceso en el que un disolvente fluye a través del papel,
produciendo la separación.
Elección del disolvente:
Depende de la sustancia que hemos de preparar.
Técnicas empleadas:
El desarrollo se puede llevar a cabo permitiendo que el disolvente suba por el papel por
capilaridad, arrastrando mas arriba los componentes mas solubles (técnica ascendente)
o que descienda por él ayudado por la gravedad (técnica descendente), y circular. La
cromatografía bidimensional se emplea para una mejor separación de las manchas.
El análisis cuantitativo se puede verificar; bien aplicando un volumen conocido de la
muestra problema en un punto de la línea del cromatograma, mediante un tubo capilar o
micropipeta; después del desarrollo cromatográfico se corta el trozo de papel que
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contenga la mancha del componente que interesa y se extrae con un disolvente para
análisis por el método apropiado, o bien comparativamente, mas tamaño o peso, con la
magnitud de la mancha ocasionada por una cantidad conocida del mismo componente
en las mismas condiciones de operación.
Revelado de las sustancias sobre el cromatograma:
Cuando hemos realizado la separación, interesa localizar la posición de las sustancias en
el papel. Si las sustancias son coloreadas, esto no presenta dificultad, pero muchos
compuestos son incoloros, y por consiguiente invisibles, en este caso se puede hacer uso
de varios métodos. Los métodos físicos, que utilizan propiedades particulares de los
compuestos, tales como la fluorescencia y la radiactividad; son conocidos, pero de
aplicación limitada. El método generalmente mas usado es hacer reaccionar a las
sustancias a revelar con algún agente químico con el que forman algún compuesto
coloreado. Hay dos métodos para aplicar el revelador: sumergiendo el papel en una
solución de este o pulverizando la solución sobre el papel.
Los métodos físicos de detección tienen una ventaja sobre los químicos de que la
sustancia no sufre transformaciones y pueden recuperarse y estudiarse mejor.
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Concepto de la constante R:
El movimiento relativo de alguna sustancia respecto al disolvente en un sistema
cromatográfico dado es constante y característico de la sustancia.
Rf : distancia recorrida por la sustancia / distancia recorrida por el disolvente. En
algunos casos, el frente del disolvente sale fuera del papel, y por esto es mas
conveniente expresar el movimiento de una sustancia por comparación con el
movimiento de otra, que es similar químicamente (sustancia patrón). En este caso es
mejor aplicar los valores de Rx.
Rx : distancia recorrida por la sustancia / distancia recorrida por la sustancia x (patrón).
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA:
Constituye otro método para separar, y en algunos casos, identificar mezcla de dos o
mas compuestos orgánicos.
Las separaciones sobre capa se parecen en muchos aspectos a la de papel, pero es
posible la elección de muchos mas medios, ya que con esta técnica pueden realizarse
separaciones por reparto, filtración sobre gel, adsorción o intercambio iónico.
El tamaño tan fino de las partículas que constituyen los medios empleados en
cromatografía en capa fina hacen que se consigan mejores resoluciones y manchas mas
compactas.
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Se usan dos tipos de capas : capa compacta: que se adhiere a la placa de vidrio por
medio de un agente aglomerante incorporado al adsorbente o por medio de las
cualidades adherentes del propio material y capa suelta.
Elección del disolvente:
La elección del disolvente dependerá, de la naturaleza del compuesto que se va a
separar y del material en que la separación va a llevarse a cabo. Una regla general es la
comparación de la polaridad del disolvente y de la sustancia que se desea separar. Así,
para sustancias solubles en agua se elegirán capas de celulosa o gel de sílice; para
sustancias menos polares se elegirán capas de alúmina o gel de sílice activadas,
empleando un disolvente no acuoso adecuado.
Técnica empleada:
Las muestras se aplican con un capilar sobre la línea base, dejando evaporar el
disolvente. El desarrollo se lleva a cabo en cubetas por el método ascendente.
Revelado de placas:
Una de las ventajas de la cromatografía de capa fina sobre la de papel es la posibilidad
de revelado con agentes corrosivos, tal como ácidos concentrados y compuestos
fuertemente oxidantes a alta temperatura, debido a la naturaleza inorgánica de la capa.
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Otro reactivo muy empleado son los vapores de yodo. También se puede utilizar luz
UV, o algún indicador si los compuestos son incoloros.
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA:
Las separaciones pueden realizarse por reparto, adsorción o intercambio iónico. Puede
usarse cualquier medio adsorbente, siendo los mas generales la celulosa, gel de sílice,
celita (para separaciones por reparto), alúmina, óxido de magnesio, óxido de calcio y
carbón activo (para separaciones por adsorción y de intercambio iónico).
Adsorbentes:
Los adsorbentes deben ser insolubles en el disolvente que se va a utilizar para la
separación; no deben reaccionar con las sustancias que se van a separar; la composición
ha de ser uniforme y han de ser incoloros, cuando se han de localizar visualmente zonas
correspondientes a compuestos coloreados.
Cuanto mayor sea el tamaño del adsorbente, mayor será el grado de separación de la
mezcla tratada, y también menor será la velocidad con la que el disolvete o la solución
pasarán a través de la columna.
El poder adsorbente de un producto determinado depende no solo de su naturaleza, sino
también del disolvente utilizado en la preparación del cromatograma.
El estado físico del adsorbente ha de ser de tal manera que permita el empaquetamiento
uniforme de la columna y el flujo libre de disolvente a través de ella.
- Adsorbentes muy activos: alúmina con un contenido de agua pequeño; carbón
activado y arcilla
- Adsorbentes intermedios: gel de sílice, ácido salicílico; carbonato de calcio; fosfato
de calcio; magnesia (MgO) y cal apagada (Ca(OH)2)
- Adsorbentes débiles: sacarosa; inulina; almidón y talco.
Disolventes para la cromatografía en columna:
En general, se emplean tres tipos de disolventes, según sea la separación de reparto,
adsorción o intercambio iónico.
Los disolventes empleados en la cromatografía de reparto son similares a los que usan
en la cromatografía de papel.
Para las separaciones por adsorción es fundamental que los disolventes empleados en la
elución sean muy puros, pues las impurezas podrían alterar el curso completo del
desarrollo. Con adsorbentes del tipo de alúmina y gel de sílice la intensidad de la
adsorción aumenta al crecer la naturaleza polar de material adsorbido por lo que en
estos casos se emplea normalmente un disolvente apolar. Los grupos polares, tal como
los OH del agua y etanol, causaría la desorción de la sustancia. Según este, la elución de
la columna puede llevarse a cabo empleando una serie de disolvente en los que vaya
aumentando la polaridad. El efecto contrario, ocurre cuando se emplea como adsorbente
el carbón activo.
Las separaciones basadas en el intercambio iónico se realizan, normalmente, pasando
la muestra en solución acuosa por una columna que contiene una resina de intercambio
iónico. En esta los compuestos se adsorben por fuerzas electrostáticas. Variando el pH o
la concentración salina del eluyente puede conseguirse una desorción selectiva.
Se pueden emplear diferentes disolventes atendiendo a las operaciones siguientes:
- Para llevar el soluto a la columna : poco polar
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- Para desarrollar el cromatograma: algo polar
- Para eluir el producto adsorbido: mas polar
Los disolventes mas frecuentes se pueden ordenar según su polaridad creciente, en el
siguiente orden aproximado: Éter de petróleo, tetracloruro de carbono; éter; acetona;
benceno; ésteres de ácidos orgánicos; mezclas de ácidos o bases con agua.
Material:
Columna: tubo de vidrio largo terminado en su parte interior en un tubo mas estrecho,
en el que se pone un poco de algodón para retener el adsorbente dentro del tubo.
Un quitasato o erlenmeyer
Uno de los aspectos mas importantes de la cromatografía en columna es el relleno de
esta. Para obtener resultados satisfactorios, el adsorbente se debe distribuir
uniformemente en la columna, debiendo quedar rigurosamente excluidos los canales y
las burbujas de aire.
Existen varios procedimientos para llenar satisfactoriamente las columnas
cromatográficas:
- Vía húmeda: consiste en llenar la columna con disolvente y espolvorear sobre esta
el adsorbente, que se dejará depositar por su propio peso sobre el fondo,
interrumpiéndose la adición cuando se ha alcanzado la altura conveniente. Antes de
iniciarse este proceso, el copo de lana de vidrio (o algodón), debe mojarse con el
disolvente totalmente; sino se hace esto, quedarán en la columna burbujas de aire.
Otro método húmedo consiste en la preparación de una papilla con el disolvente y el
adsorbente; en la columna se pone un poco de disolvente y la papilla se vierte sobre
este, dejando después que el adsobente se sedimente. Si la columna tiene una llave
en la parte inferior, se dejará un poco abierta durante el proceso de sedimentacióm.
El flujo lento de disolvente a través de la columna ayuda a la formación de un
depósito de adsorbente mas uniforme.
Otra forma de conseguir una columna uniforme, consiste en golpear suavemente las
paredes de la columna cromatográfica, mientras dura la sedimentación del
adsorbente, con un tubo de goma que pueda sujetarse al extremo de una varilla
maciza.
- Vía seca: consiste en la adición del adsorbente suficiente para llenar 1 o 2cm de la
columna, y apretar bien este antes de una nueva adición de adsorbente
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aproximadamente igual a la anterior. Para apretar o aprisionar el adsorbente puede
servir un tapón de corcho con un diámetro ligeramente inferior al diámetro interior
de la columna. Este tapón se unirá a una varilla de vidrio un poco mas larga que la
longitud total de la columna, se puede conseguir una distribución uniforme,
golpeando igual que en el caso anterior. Es importante que la superficie superior de
la columna de adsorbente formada quede nivelada horizontalmente durante el
desarrollo del cromatograma. Una vez que la columna se ha mojado con el
disolvente no deberá dejarse secar de nuevo, pues el adsorbente se contrae, se separa
de las paredes de vidrio de la columna y se forman canales.
BIBLIOGRAFÍA:
- “Introducción a la cromatografía”. David Abbott y R.S. Andrews. C Exedra nº 6.
Ed. Alambra
- “Cromatografía sobre papel y capa fina. Electroforesis”.I Smith y J.G.Feiuberg.
Colección Exedra nº 128. Ed. Alambra.
- “Curso práctico de Química Orgánica”. R.Q.Brewster; C.A.Vauder Werf;
W.E.McEven. Ed. Alhambra.
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