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Universidad de Sonora

Unidad Regional Sur


Departamento de Ciencias
Qumico Biolgicas y
Agropecuarias
Manual

de
Laboratorio de

Qumica Analtica III

Responsable:
M.C. Liliana Ruiz
Lpez
Colaboradores:
M.C. Luis A. Zamora
lvarez
M.C. Mara Balvaneda
Arechiga Carrillo

UNIVERSIDAD DE SONORA
Divisin de Ciencias e Ingeniera
Departamento de Ciencias Qumico Biolgicas y
Agropecuarias

Manual de Prcticas
Qumica Analtica III
Responsable:
M.C. Liliana Ruiz Lpez,
Colaboradores:
M.C. Luis A. Zamora lvarez
M.C. Ma. Balvaneda Archiga Carrillo

Introduccin

Competencias
Contenido
Lista de Tablas
Lista de Figuras
seccin I SEPARACIN DE MEZCLAS POR MTODOS CLSICOS
Practica No. 1 Extraccin de Carotenos
Practica No. 2 Extraccin de Betanina
Seccin II CROMATOGRAFIA EN PAPEL Y EN CAPA FINA
Practica No. 3 Cromatografa en papel Separacin de Antocianinas

3
4
5
6

Practica No. 4 Identificacin de carbohidratos mediante cromatografa en papel


Prctica No. 5 Separacin de estndares de aminocidos en Cromatografa en Capa
Fina (CCF)
Prctica No. 6 Obtencin y separacin de aminocidos libres
Practica No. 7 Cromatografa bidimensional Betaninas
Seccin III CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
Practica No. 8 Cromatografa en columna de carotenos
Seccin IV PURIFICACIN DE PROTENAS
Practica No. 9 Purificacin de Protenas Aislamiento de Bromelina
Bibliografa

7
13
17
20
24
27
32
36
41
44

INTRODUCCIN
Fuera de los procesos clsicos de separacin de mezclas, los mtodos
cromatograficos y electroforticos en todas sus variantes han sido fundamentales para el
desarrollo de ciencias como la bioqumica, la gentica, y la biologa celular. Estas tcnicas
representan una herramienta importante tanto para los procesos de investigacin, como para
el aislamiento y purificacin de la mayora de los compuestos orgnicos y de toda clase de
biomolculas.

El presente manual est estructurado como material didctico de apoyo para actividades de
laboratorio de estudiantes que cursan la asignatura de Qumica Analtica III, de la carrera de
Qumico Bilogo Clnico de la Universidad de Sonora. Se ha diseado con la finalidad de
facilitar a los alumnos, la comprensin de los principios tericos que fundamentan los
diferentes mtodos cromatograficos, la purificacin de protenas y electroforesis en gel de
poliacrilamida. As mismo impulsar el desarrollo de habilidades y destrezas en la
manipulacin de materiales y equipo de laboratorio durante las operaciones fundamentales
en el trabajo experimental; con procedimientos analticos sencillos que no requieren de
equipamientos complejos y de alto costo.

Competencias
Las actividades que se llevan a cabo en el laboratorio de Qumica Analtica III, contribuyen
en el desarrollo de habilidades y destrezas del alumno como parte de la formacin integral
de competencias del programa de la asignatura.
El nmero de prcticas que se incluyen son especficas, para que el alumno adquiera mayor
destreza en el manejo de material, equipo y mtodos de los diferentes tipos de
cromatografa y electroforesis. As mismo; durante el desarrollo de sus prcticas fortalecen
y facilitan la comprensin de los principios tericos en las cuales estn fundamentadas.
En este manual de laboratorio tambin se incluye tratamiento de residuos; con la finalidad
de que el alumno adquiera conocimiento y ms que nada responsabilidad de cuidar el
medio ambiente; mediante la desactivacin de los residuos generados en las prcticas.
Las prcticas de laboratorio estn estructuradas para realizarse mediante trabajo
experimental, el cual servir para sembrar en el alumno el inters por la investigacin
cientfica que en algn determinado momento pudiera desarrollar como profesionista.

El nivel de desempeo del alumno estar asociado al desarrollo ptimo de actividades


como la realizacin de las prcticas en forma y tiempo, lo cual le requerir de un amplio
dominio de diferentes habilidades y conocimientos; la elaboracin sistemtica y
estructurada de informes por prctica, mediante disciplina y laboriosidad, as como el uso
eficiente de herramientas computacionales. El trabajo en el laboratorio deber ser realizado
en equipo, lo cual requiere de una participacin armnica en el trabajo conjunto. Se
utilizara pensamiento crtico para realizar los diversos pasos de la actividad prctica y sus
conclusiones en el reporte.

SECCIN

SEPARACIN DE MEZCLAS POR


MTODOS CLSICOS

Prctica
1

Extraccin de
Carotenos
Introduccin
En la mayora de los anlisis qumicos existe una parte importante llamada interferencia o
interferente que se relaciona con especies extraas que pueden atenuar la seal del analto o
producir una que no se distinga de la que produce el analto; por lo que se requiere de
mtodos generales de separacin que se utilizan para tratar las interferencias en los anlisis,
entre ellos estn el enmascaramiento, precipitacin qumica o electroltica. Destilacin,
extraccin con disolventes, intercambio inico, cromatografa y electroforesis.
La extraccin es una tcnica de separacin y purificacin para aislar una sustancia de una
mezcla slida o lquida en la que se encuentra, mediante el uso de un disolvente. Por
extraccin se aslan y se purifican numerosos productos naturales como vitaminas,
alcaloides, grasas, hormonas y colorantes.
Existen
diferentes
tcnicas
de
extraccin
de
compuestos
orgnicos:
La extraccin lquido-lquido es importante en la separacin de mezclas homogneas
lquidas. Consiste en separar una o varias sustancias disueltas en un disolvente mediante su
transferencia a otro disolvente insoluble, o parcialmente insoluble, en el primero. Para
extracciones de compuestos lquido-lquido, se utiliza el sistema de extraccin por arrastre
con
vapor
en
la
que
se
separar
dos
compuestos
lquidos.
La extraccin slido - lquido, es una operacin que se usa en procesos industriales.
Tcnicamente, es una operacin de transferencia de masa, donde un disolvente o mezcla de
stos, extraen selectivamente uno o varios solutos que se hallan dentro de una matriz slida.
Con la extraccin slido-lquido se puede extraer componentes solubles de slidos con
ayuda de un disolvente, se pude realizar mediante la extraccin continua en Soxhlet que
comprende en la extraccin repetida y exhaustiva de un slido por un lquido caliente hasta
que la extraccin es completa. As como con la extraccin discontinua mediante la
extraccin slido- lquido en fro con agitacin. La pureza y el rendimiento de los
extractos dependern de las tcnicas que se utilice para el aislamiento y las caractersticas

taxonmicas de las muestras, existen una serie de parmetros fsico - qumicos, tales como
la viscosidad del disolvente, los coeficientes de solubilidad de los solutos, los coeficientes
de difusin, las temperaturas de ebullicin, etc. que son de importancia fundamental para el
diseo del equipo y el xito del proceso de extraccin (skoog y cols, 2010).
En esta prctica los extractos de carotenos deben protegerse de la luz ya que son
compuestos que presentan una larga cadena carbonada, de 40 tomos de carbono, que
contiene dobles enlaces conjugados a los cuales se les atribuye su color y su susceptibilidad
a degradaciones por exposicin a la luz y a altas temperaturas; su extraccin debe realizarse
rpidamente, en un lugar donde no se expongan a la luz directamente, empleando solventes
no polares como ter etlico, ter de petrleo o hexano, entre otros (Gonzlez;2010), (Oliver
and Palou, 2000); (Wilberg and Rodrguez, 1995).
Objetivo
Separar mediante un proceso de particin solido-lquido y lquido-lquido los carotenos de
las xantofilas a partir de una muestra vegetal.

Material
2 probetas de 50 ml

4 tubos para centrifuga

2 vasos precipitado 100 ml

Magneto

2 vasos precipitados 250 ml

1 esptula

2 pipetas graduadas 10 ml

1 agitador de vidrio

1 navaja/cuchillo pequeo

1 mortero con mano

Equipo Soxhlet

2 Papel filtro Whatman #4

2 Papel filtro Whatman #1

Parrilla elctrica/agitacin

Reactivos
20 g de zanahoria (Daucus carota)
Disolventes: ter de petrleo, etanol

Procedimiento
Extraccin de carotenos y xantofilas

1.- Cortar 20 g de zanahorias frescas en pequeos trozos y triturar en un mortero, colocarla


en un matraz E.M. de 250 ml. y agregarle 20 ml. de etanol. Agregar 5 ml. de agua destilada,
calentar la mezcla suavemente sobre una parrilla elctrica y mantenerla en agitacin por 10
minutos.
2.-Filtrar la muestra con papel filtro Whatman #1
3.- Concentrar la muestra en bao de agua a 80 C por 30 minutos. Despus de ello, tomar
una alcuota de 1 ml. en un tubo mbar, etiquetar y almacenar a 4 C.
4.- Colocar la muestra dentro de un embudo de separacin, y agregar 25 ml. de ter de
petrleo y agitar. Dejar reposar por 5 minutos hasta que se separan dos fases.
5.- Separar ambas fases, depositar cada una de ellas en un matraz E.M. de 125 ml. Tener
cuidado de no mezclar las dos fases obtenidas durante la separacin, la fase superior posee
los carotenos y la fase inferior contiene xantofilas y otros pigmentos polares
6.- Para eliminar residuos de carotenos en la fase polar (la que contiene etanol), este debe
de ser vertida nuevamente en el embudo de separacin, junto con otros 25 ml. de ter de
petrleo (repetirlo 2 veces ms).
7.- Concentrar las muestras en bao de agua a hasta reducir su volumen lo ms posible.
Nota: para ter de petrleo a 50 C por 15 minutos con agitacin constante. Y para etanol
80 C por 30 minutos. Etiquetar y guardar para siguiente practica a 4 C.
Cuestionario
1.- De acuerdo a los solventes en los que hizo su extraccin mencione que tipo de
compuestos se extrajeron.
2.- Menciona otros mtodos de extraccin que puedas utilizar para tu prctica.
Tratamiento de residuos
Los residuos del ter de petrleo depositarlos en contenedores para residuos para su
posterior eliminacin de acuerdo con las normativas vigentes. En local bien ventilado.
Alejado de fuentes de ignicin y calor. Temperatura ambiente. No almacenar en recipientes
de plstico.
Los residuos de etanol se filtran y desechan al lavabo con abundante agua, y los slidos a la
basura.

Prctica
2

Extraccin de
Betanina

Introduccin
Las betaninas pertenecen al grupo de las betalanas que son pigmentos hidrosolubles con
estructura de glucosidos, derivados de la 1, 7 diazoheptametina; las betalanas se han
dividido en dos grandes clases betacianinas y betaxantinas; las betacianinas dan el color
rojo a los frutos y la betaxantinas dan el pigmento amarillo. Son sintetizadas por un
limitado nmero de especies vegetales, entre ellas Beta vulgaris L. ssp. vulgaris (betabel o
remolacha), Beta vulgaris L. ssp. cicla (Acelga), Amaranthus sp. (Amaranto) y futas de
cactus del genero Opuntia y Hylocereus. Son compuestos de bajo peso molecular,
hidrosolubles, nitrogenados, glicosilados y/o aminados, cuya estabilidad depende factores
como el pH, la temperatura y la presencia de iones u oxgeno. La betanina o betanidin-5-O-glucosido es la principal betacianina sintetizada y a diferencia de la familia de las
antocianinas, posee un nitrgeno en su esqueleto principal por lo que tambin entra en la
categora de alcaloide. Este compuesto se encuentra en grandes cantidades en el tallo, las
hojas y la raz de Beta vulgaris, y es el responsable de su color rojo-violeta. La
vulgaxantina I y II son las principales betaxantinas presentes en betabel, al igual que la
betacianinas poseen la misma estructura base (cido betalamico) pero no poseen el anillo
cDOPA. En vez de ello, las betaxantinas se encuentran conjugadas con diferentes
aminocidos, o con aminas de diferentes cadenas (Badui, 2006).
El comportamiento espectrofotomtrico de estos pigmentos en la regin UV-Vis ya ha sido
objeto de estudio y se ha determinado que las betacianinas y betaxantinas presentan
espectros de absorciones a longitudes de onda mxima alrededor de 535-540 nm y 480 nm
respectivamente. En los ltimos aos, se han realizado numerosas investigaciones acerca de
las propiedades bioqumicas de estos compuestos. Por su carcter natural ha crecido el
inters por utilizarlos como colorantes de alimentos, o en fibras textiles, lo que ha dado
lugar a estandarizar los procesos de extraccin. Adems, algunas investigaciones han
demostrado que poseen una importante capacidad antioxidante, una propiedad asociada con
reducir el riesgo de padecer enfermedades degenerativas (Soriano y cols, 2007).

Figura. Estructura qumica de betalanas

Objetivo
Evaluar la influencia de las condiciones del proceso de extraccin en la determinacin del
contenido total de betanina en beta vulgaris.
Materiales
80 gr de raz de Betabel (Beta vulgaris)
Sistema Soxhlet
Parrilla elctrica con agitador magntico
9 Cubetas de poliestireno 1 cm de espesor
1 Tamizador de plstico para harina
150 mL Buffer Citrato pH 5.8
Procedimiento
Extraccin de Betanina
Mtodo A
1.- Cortar 15 g de raz de B. vulgaris en finas rebanadas y secar en un horno con ventilador
a 80 C por 3 horas.
2.- Triturar la muestra en un mortero hasta su pulverizacin.
3.- Colocar la muestra en un vaso de precipitados de 250 ml. y agregarle 50 ml. de buffer
citrato pH 5.8. Mantener la mezcla en agitacin constante por 10 minutos.
4.- Filtrar la muestra a travs de seis gasas para eliminar solidos insolubles. Despus filtrar
el lquido obtenido con papel Whatman # 4.

5.- Tomar 10 ml. del filtrado y centrifugarlo a 3000 r.p.m. por 10 minutos. Rescatar el
sobrenadante para hacer la determinacin de betanina total.
Mtodo B
1.- Cortar 15 g de raz de B. vulgaris en finos trozos y homogenizar con 50 mL de buffer
citrato en una licuadora.
2.- Filtrar la muestra a travs de seis gasas para eliminar solidos insolubles. Despus filtrar
el lquido obtenido con papel Whatman # 4.
3.- Tomar 10 ml. del filtrado y centrifugarlo a 3000 r.p.m. por 10 minutos. Rescatar el
sobrenadante para hacer la determinacin de betanina total.
Mtodo C
1.- Cortar 15 g de raz de B. vulgaris en finos trozos y envolverlos dentro de un cilindro
hecho de papel filtro Whatman # 4. Utiliza clips no. 2 para fijar el papel y evitar que se el
cilindro se abra dentro del tubo Soxhlet.
2.- Colocar el cilindro dentro del tubo Soxhlet, armar el sistema y extraer la muestra con 75
ml. de alcohol 95 %.
3.- Dejar que el lquido se enfri, de ser necesario, filtre el extracto con papel filtro
Whatman # 4
4.- Tomar 15 ml de lquido y centrifugar a 3000 r.p.m. por 10 minutos.
5.- Tomar 10 ml del sobrenadante y evaporar a bao de agua hasta sequedad (de 10 a 15
minutos). Re suspender la muestra en 10 ml. de buffer citrato pH 5.8 y centrifugar
nuevamente a 3000 r.p.m. por 10 minutos.
6.- Rescatar el sobrenadante para hacer determinacin de betanina total.
Determinacin del contenido total de betanina
Determinar de la concentracin de betanina en un espectrofotmetro aplicando la ley de
Beer. Es decir, para un compuesto dado, a una max la A=cl , la cual implica que en una
cubeta de 1 cm de espesor y de 1 mL de volumen la:

[ Betaninamg /mL ]=( A )

(1 )
( PM ) ( d ) .

donde A es la absorbancia a 538 nm, es el coeficiente de extincin molar (60,000 mol 1


cm-1), PM es el peso molecular de la betanina (550g/mol) y d representa el factor de
dilucin de la muestra.
1.- Diluir las muestras 1:200 (v/v) con buffer citrato y medir absorbancia a 538 nm. Las
muestras no deben de sobrepasar la 2.0 unidades, de ser as, diluir 1:400 (v/v).

2.- Para cada muestra realizar la determinacin de betanina total por triplicado, utilizar
buffer citrato como blanco y para todos los casos calcular el promedio y la desviacin
estndar.

Cuestionario
1.- Tomando en cuenta los resultados obtenidos Cul fue el mtodo ms eficiente para la
extraccin de betanina? Cul es su explicacin?
Argumente sus razones en base a las condiciones que usted utiliz durante todo el proceso
de extraccin como lo son: tratamiento de la muestra, medio de extraccin, temperatura,
tiempo, exposicin al oxgeno y pH.
2.- Por qu la absorbancia de las muestras no debe de ser mayor a las 2.0 unidades?
3.-En base a la ley de Lambert-Beer donde

A=cl

, cmo se llegara usted a la frmula

que utiliz para la determinacin de Betanina?

Tratamiento de residuos
Todos los residuos se filtran por separado, los residuos de buffer de citrato de sodio pH 5.8
se neutralizan y diluyen con agua desechndose al lavabo.
Los residuos de etanol se desechan al lavabo con abundante agua, y los slidos a la basura.

SECCIN

II

CROMATOGRAFIA EN PAPEL Y
EN CAPA FINA

Prctica
3

Cromatografa

en

papel
Separacin

de

Antocianinas
Introduccin
La tcnica de cromatografa en papel (CP) es extraordinariamente simple, ya que utiliza una
tira de papel de filtro, por ejemplo, Whatman No 1, como medio para las separaciones.
Actualmente, la CP no se utiliza demasiado, debido al desarrollo alcanzado por otras
tcnicas cromatogrficas, especialmente la CCF, CG y HPLC.
El mecanismo que interviene en la cromatografa en papel es fundamentalmente de reparto,
donde la fase estacionaria es al agua adsorbida sobre las molculas de celulosa del papel.
Sin embargo, la misin del papel es realmente ms compleja que actuar simplemente como
soporte de la fase estacionaria, ya que, al parecer, la adsorcin de los componentes de la
fase mvil y de los solutos, as como efectos de cambio inico, tambin toman parte en el
proceso de separacin.
El papel utilizado puede ser, en principio, papel de filtro estndar, si bien, existen en el
comercio papeles especiales para CP. Estos papeles estn fabricados con una porosidad y
espesor determinados, as como con muy bajo contenido de restos metlicos. El desarrollo
del cromatograma debe hacerse, en estos papeles, en una determinada direccin. Asimismo,
deben conservarse en condiciones de humedad controlada y en lugares exentos de humos o
vapores que puedan adsorberse sobre las fibras de celulosa y alterar las separaciones.
Las tcnicas para desarrollar el cromatograma son similares a las empleadas en CCF, esto
es, ascendente, descendente, bidimensional y radial. La muestra, disuelta en un disolvente
voltil, se aplica al papel con un capilar, una micro jeringa o una micropipeta. Su tamao
deber ser de unos 2 mm de dimetro y la cantidad de muestra comprendida entre 10 y 50
g. El disolvente se elimina por evaporacin (por ejemplo, con un secador de pelo) y si la
muestra es muy diluida se aplican varias gotas, evaporando el disolvente despus de cada
aplicacin (Scott, 2012).
La mayora de las tcnicas usadas para la localizacin de las sustancias separadas en CCF
pueden aplicarse a la cromatografa en papel, excepto, evidentemente, aquellas que
impliquen el uso de reactivos que puedan atacar al papel, como el cido sulfrico
concentrado. Sin embargo, la deteccin sobre papel es menos sensible que en capa fina,

debido a que las manchas se muestran generalmente ms difusas (Guerra y Ortega, 2006),
(Zapata, L M.; et al. 2014).

Objetivo
Aplicar los fundamentos cromatogrficos como mtodos de separacin e identificacin de
las antocianinas de arndano.

Materiales
2 Matraz E.M. 250 mL

Reactivos
20 gr. arndanos

2 Vasos precipitados de 250 ml

Etanol 85%

2 Clips

HCL 1M

1 Regla

cido ctrico (20%)

2 Capilares

Agua destilada

2 Papel filtro Whatman #1 y # 3

Etanol acidificado al 1%

1 Par de guantes

tampn a pH 1.0 de cloruro de potasio


0.025 M (ajustado con cido clorhdrico)
tampn a pH 4.5 de acetato de sodio 0.4 M
(ajustado con cido actico)

2 Pipetas serolgicas de 10 ml
2 Matraz de aforacin de 100 ml
1 Probeta de 100 ml
1 Esptula
Parrilla
Termmetro
Procedimiento:
Mtodo A

1.- Cortar 20 g de arndanos frescos en pequeos trozos y triturar en un mortero, colocarla


en un matraz E.M. de 250 ml y agregarle 60 ml de etanol conteniendo una pequea
cantidad 15 % de cido clorhdrico 1M para obtener la forma del catin flavilio, el cual es
estable en un medio altamente cido.
2.- Medir el pH y mantenerla en agitacin por 1 hora. El pH tambin ha mostrado que tiene
una influencia significante sobre el color de los extractos de antocianinas, las lecturas de
absorbancia y la recuperacin del extracto. A valores de pH ms bajos (pH < 2), mientras a
pH ms alto (pH > 4), presentan un color amarillo. Filtrar con papel filtro Whatman # 1
para hacer cromatografa

Mtodo B
Cortar 20 g de arndanos y triturar en un mortero, colocarla en un matraz E.M. de 250 ml y
agregarle 60 ml de etanol acidificado al 1% con cido ctrico como solvente de extraccin,
(una proporcin materia prima / solvente de extraccin: 1:3 kg/kg) a una temperatura de
extraccin 361 C por un tiempo de 2 h. de extraccin.
2.- Decantar cada muestra y centrifugar a 3000 rpm por 3 minutos, filtrar la muestra con
papel filtro Whatman #1.
3.- Concentrar las muestras en bao de agua hasta reducir su volumen lo ms posible a 59 C
hasta reducir su volumen 6 veces. Etiquetar y guardar a 4 C.
Cromatografa en papel
4.- Cortar una hoja de papel filtro Whatman # 3, en dos tiras de 10 cm de largo por 2.5 cm
de ancho. Evtese tocar directamente el rea del papel donde se desarrollara la
cromatografa, utilice tijeras limpias.
5.- Con la ayuda de un lpiz de grafito marcar por ambos extremos del papel, una tenue
lnea a una distancia de 1.5 cm.
6.- Sobre cualquiera de estas lneas marcar con una pequea cruz la posicin inicial donde
ser depositada la muestra a analizar y las sustancias de referencia. Las marcas deben de ser
equidistantes, y lo ms alejadas posible, para evitar que las muestras se mezclen durante el
desarrollo.
7.-La tira de papel ser soportada por dos clips dispuestos en forma de gancho, uno de los
cuales debe de perforar la tira por la parte superior a 0.5 cm de distancia.
8.- Como fase mvil, se utilizaran 30 ml de una solucin de n-butanol-cido actico glacialagua, 4:1:5.
9.- Saturar la cmara cromatografa (Matraz E.M. 250 ml) con la fase mvil por 10
minutos. Asegrese de que la cmara este bien sellada.
10.- Con la ayuda de un tubo capilar de vidrio colocar una pequea porcin de la muestra
en el centro de cada cruz sobre la lnea base del papel, y esperar que se seque. Evite que las
muestras se mezclen.
11.- Despus de destapar la cmara cromatografa debe introducirse la tira de papel, de
manera tal que toque el solvente, y que los clips y el tapn monohoradado sirvan como
soporte.
12.- Esperar a que se desarrolle la cromatografa. La tira debe de retirarse de la cmara
cuando la fase mvil alcance la lnea superior.

13.- Retire el papel de la cmara cromatogrfica y deje que se seque. Con un lpiz marque
la posicin de las bandas.
12.- Deje secar el papel, y marque con un punto el centro de cada una de las bandas que
observo.
13.- Mida la distancia desde la lnea base hasta el centro de cada una de las bandas que
observo, y calcule el factor de retencin (Rf) segn:
Rf =

Distanciarecorridaporelcompuesto
Distanciarecorridaporelsolvente

14.- Compare los valores de Rf de cada una de las bandas que observo en la muestra y
realice sus conclusiones.

Cuantificacin de Antocianinas totales


La concentracin de antocianina se determin por el mtodo de pH-diferencial. Para ello,
una alcuota de extracto de antocianina se mezcl con 10 ml de tampn a pH 1.0 de cloruro
de potasio 0.025 M (ajustado con cido clorhdrico) y otra con tampn a pH 4.5 de acetato
de sodio 0.4 M (ajustado con cido actico). La diferencia en la absorbancia a la longitud
de onda de mxima absorcin (510 nanmetros) es proporcional al contenido de
antocianinas .Posteriormente y con el propsito de efectuar la correccin de la medida
debida a la presencia de compuestos degradados o sustancias interferentes, se midi la
absorbancia a 700 nanmetros. Las mediciones se realizan con un espectrofotmetro,
contra un blanco de agua ultra pura. La concentracin de las antocianinas se expres como
mg cianidina-3-glucsido/100mL de extracto de acuerdo a la expresin siguiente
Ecuaciones 1 y 2:

Dnde:
AT: Antocianinas totales
A: Cambio en la absorbancia
PM: Masa molecular para cianidina-3-glucsido, 449.2 g/mol
FD: Factor de dilucin
: Coeficiente de extincin molar para cianidina-3-glucsido, 26900

l: Longitud de paso de celda, 1cm


1000: factor de conversin de gramos a miligramos
Cuestionario
1.- En base a las condiciones, Cmo debera ser el Rf de los compuestos en el papel una
vez desarrollada la cromatografa?
2.- Cul de los dos mtodos de extraccin nos da mayor concentracin de antocianinas?
3.- Cmo afectara el pH el desarrollo cromatograficos de la mezcla problema?

Tratamiento de residuos
Todos los residuos de la extraccin y fase mvil se neutralizar el pH y diluyen para
desechar en el lavabo.
Los residuos que contienen acetato de sodio y cloruro de potasio por ser sales se diluyen
con abundante agua y se desechan al lavabo.

Prctica 4

Separacin de carbohidratos en CP
Introduccin
Ningn mtodo empleado para el anlisis qumico es especfico, por lo que la separacin
del analito es crucial para que cualquier mtodo sea exitoso. Hasta mediados del siglo XX,
las separaciones de los compuestos qumicos se realizaban mediante mtodos clsicos
(Gary, 2009). En 1903 el botnico ruso Mikhail Tswett introdujo un poderoso mtodo de
separacin denominado cromatografa, el cual tiene aplicacin en todas las ramas de las
ciencias naturales. En 1944 Consden, R., Gordon, A. H. y Martin, A. J. P. publicaron en la
revista Bioqumica sus trabajos sobre cromatografa en papel, la cual utilizaron para la
separacin de aminocidos. En todos los mtodos cromatogrficos, la separacin de los
componentes de una muestra obedece el mismo principio fisicoqumico. En trminos
generales, una muestra puede ser desplazada por una fase mvil a travs de una fase
estacionaria, y sus componentes pueden ser distribuidos de manera distinta entre ambas.
El desarrollo de la cromatografa en papel puede ser en varias modalidades o formas como
la ascendente: en este caso, el solvente se coloca en el fondo de la cuba y el papel se
suspende colocado en la parte superior de la cuba. En la forma descendente: el solvente se
coloca en un depsito inerte ubicado en la parte superior de la cuba cromatogrfica. En el
fondo de la cuba se coloca tambin un poco de solvente para asegurar la saturacin con el
vapor. La parte superior del papel se sumerge en el disolvente y se tapa hermticamente la
cuba (al igual que en la tcnica ascendente). La aplicacin de la muestra quedar en la parte
superior del papel (UNAM, 2007).
La forma bidimensional es igual a la ascendente pero, se corre el papel en una direccin y
luego del desarrollo y secado se gira 90 y se corre con otro solvente.
El revelado de molculas o iones en cromatografa de papel o de capa fina puede ser un
problema. Si las molculas son coloreadas la deteccin se hace por su observacin directa.
Sin embargo, es el caso menos frecuente. Para algunos compuestos, existen reactivos
especficos que reaccionan para dar un compuesto coloreado de observacin directa.
En la mayora de los casos, el compuesto muestra es transparente y no puede localizarse
visualmente. En esta circunstancia se utiliza un reactivo comn que es el cido sulfrico, el
cual carboniza el compuesto dejando una mancha marrn. La posicin de las manchas
indica la situacin de los distintos compuestos.
La desventaja del mtodo es que se destruye el compuesto. Se utiliza en cromatografa de
capa fina, donde el substrato es inerte frente al cido sulfrico, pero no en la de papel, que

se descompondra. Existen compuestos orgnicos cuyas molculas fluorescen bajo la luz


UV. Algunos compuestos de peso molecular elevado no fluorescen ni pueden ser detectados
con reactivos especficos. En este caso, se emplea un soporte modificado, que contiene un
material fluorescente de forma que toda la placa produzca fluorescencia al irradiarla con luz
UV. Si sobre la placa as preparada se coloca la muestra y se provoca la separacin, la
fluorescencia del material base es absorbida o bloqueada fsicamente en aquellas zonas
donde no existen compuestos fluorescentes. En definitiva, los distintos componentes de la
muestra ocuparn las zonas no fluorescentes. Un material adecuado para este fin es la 1, 2,
3 indantina monohidrato, conocido comercialmente bajo el nombre de Ninhidrina. Los
vapores de yodo sublimado: es un revelador universal, que no te destruye el papel.

Figura.
asendente (A) y
(B).

Cromatografa
Cromatografa

en
papel:
descendente

Objetivo:
Identificar los carbohidratos presentes en una mezcla problema mediante cromatografa en
papel.

Materiales
2 Matraz E.M. 250 mL
2 Vasos precipitados de 250 ml
2 Clips
1 Regla
2 Capilares
2 Papel filtro Whatman #1
1 Par de guantes
2 Pipetas serolgicas de 10 ml
5 Matraz de aforacin de 100 ml

Reactivos
Isopropanol
cido actico
Agua destilada
Glucosa al 5%
Fructosa al 5%
Lactosa al 5 %
Xilosa
Mezcla problema de carbohidratos al 5%
Reactivo p-anilaldheido-HCl p-anilaldheido-cido ftlico

1 Probeta de 100 ml
1 Esptula
Vaso de precipitados de 600 mL
4 Tubos capilar

cido actico glacial


Agua destilada

Procedimiento
1.- Recortar una hoja de papel filtro Whatman # 1 en un rectngulo de 10 cm de ancho por
7.5 cm de alto. Evite tocar directamente el rea del papel donde se desarrollara la
cromatografa, utilice tijeras limpias.
2.- Con la ayuda de un lpiz de grafito marque tenuemente las siguientes lneas: Por el lado
que mide 10 cm de largo, marcar una lnea a una distancia de 1.5 cm sobre la base, y sobre
sus extremos hacer una pequea marca a una distancia de 1 cm para ambos lados.
3.- Sobre la lnea base, a partir de la marca de 1 cm hecha de un extremo, marcar 5
posiciones con una distancia de 1.5 cm de separacin.
4.- Con la ayuda de un tubo capilar de vidrio colocar una pequea cantidad de la muestra
problema sobre la primera posicin de la lnea base y esperar a que seque. De igual manera,
los cuatro compuestos de referencia, sern de depositados en las posiciones restantes.
5.-Enrollar el papel sobre s mismo, de manera tal que forme un cilindro. Sobrepnganse
las marcas de 1 cm que se hicieron sobre los extremos de la lnea base y nalas con la
ayuda de un gancho. Evite tocar directamente el rea donde se desarrollara la
cromatografa, y evite arrugar el papel.
6.- Como fase mvil, se utilizaran 45 ml. de una solucin de isopropanol: cido actico:
agua en proporciones 3:1:1 (v/v).
7.- Saturar la cmara cromatografa (Vaso 600 ml.) con la fase mvil por 10 minutos,
coloque dentro un trozo de papel filtro. Asegrese de que la cmara este bien sellada.
8.- Introducir el cilindro de papel en la cmara para que inicie el desarrollo
cromatogrficos. Asegrese de que la cmara este bien sellada.
9.- Poco antes de que la fase mvil alcance la parte superior del papel, retirar el cilindro de
la cmara, distindalo y marque el frente del solvente. Luego deje secar.
10.- Revele la posicin de los carbohidratos rociando el papel hasta empapar una solucin
al 1% del reactivo p-anisaldehdo-HCl rociar hasta humedecer el papel con panisaldehdo-cido ftlico.
11.- Secar el papel a 105 C por 15 minutos. Marcar la posicin central de cada una de las
bandas observadas y calcule el Factor de Retencin (Rf) segn:
Rf =

Distanciarecorridaporelcompuesto
Distanciarecorridaporelsolvente

12.- Compare los valores de Rf de cada una de las bandas que observ en la muestra
problema con los de los compuestos de referencia y realice sus conclusiones.

Cuestionario
1.- Qu ventajas posee el realizar una cromatografa en papel en forma cilndrica, sobre la
hecha de manera lineal?
2.- El cido sulfrico es utilizado como agente revelador al 5% en etanol Por qu no se
puede utilizar para revelar la posicin de los compuestos separados?
3.- Si una solucin de p-anisaldehido-HCl es utilizada como agente revelador para
carbohidratos Por qu es importante utilizarlo al 1% para revelar la posicin de los
compuestos separados?
4.- Que ventaja existe en utilizar el reactivo p-anisaldehido-cido ftlico como revelador
de la posicin de los carbohidratos en el papel, con respecto al p-anisaldehido-HCl?

Tratamiento de residuos
La glucosa, fructosa, lactosa, y xilosa se pueden eliminar directamente al lavabo.
La mezcla de propanol y cido actico glacial se puede eliminar al lavabo con abundante
agua.

Prctica
5

Separacin de Estndares de aminocidos


en CCF
Introduccin
La cromatografa en capa fina (T.L.C.) antecede a los trabajos realizados sobre
cromatografa en papel, pues su desarrollo supuso la bsqueda de nuevas formas de
eliminar las limitantes que esta ltima ofreca. En 1938 los cientficos rusos Izmailiov y

Schraiber prepararon las primeras placas de vidrio con adsorbente, utilizando Al 2O3
lograron separar exitosamente pigmentos vegetales. A pesar de que la metodologa
empleada para la realizacin de una cromatografa en capa fina es igual que la utilizada
para hacerla en papel, su principal diferencia estriba en la fase estacionaria utilizada. La
TLC puede utilizar una serie de adsorbentes diferentes diseados para la separacin de casi
la totalidad de los compuestos existentes. Entre los ms comunes podemos encontrar: silica
gel, almina, celulosa y resinas intercambiadoras de iones (Scott, 2012).
Las separaciones por cromatografa de capa fina se llevan a cabo en placas de vidrio o
plstico recubiertas con una capa delgada de partculas finamente divididas que contienen
la fase estacionaria. Histricamente, el desarrollo de la CCF ha estado relacionado con el
anlisis de alimentos, si bien, se utiliza tambin ampliamente en la industria farmacutica
para la determinacin de la pureza de frmacos, as como en laboratorios clnicos y en la
propia industria qumica. Por otra parte, el hecho de que las fases mvil y estacionaria, as
como muchas de sus aplicaciones, sean similares a las de la cromatografa lquida en
columna, hace que la CCF se utilice en muchas ocasiones como gua para desarrollar las
condiciones ptimas para separaciones cromatografas en columna. La rapidez y el bajo
coste de los ensayos de capa fina representan ventajas importantes. Respecto a la
cromatografa en papel, la CCF presenta la importante ventaja de su mayor velocidad y, en
muchos casos, mejor resolucin (skoog y cols, 2010).

Objetivo
Separar e identificar los componentes de una mezcla de aminocidos mediante
cromatografa en capa fina.

Materiales

Reactivos

2 Matraz E.M. 250 mL


3 Vasos precipitados de 500 ml
3 Clips
1 Regla
10 Capilares
2 Papel filtro Whatman #1
1 Par de guantes
2 Pipetas serolgicas de 10 ml
1 Lpiz
1 Probeta de 100 ml

n- butanol
cido actico
Ninhidrina 0.2% (Seguir metodologa)
Cistena clorhidrato anhidro 30.44 %
Lisina monoclorhidrato 31.69 %
D L-fenilalanina, L-tirosina 39.6 %
L-cido asprtico, treonina, valina39.6 % (m/v)
L-alanina, L- leucina 39.6 %
L-prolina,L-serina y L- triptfano,L-glicina 39.6 %
L- asparagina, L-histidina y DL-metionina 39.6 %

3 Cromatofolios de 20 x 20 mm

L-cido glutmico, arginina, 39.6 % (m/v)

1 Par de guantes

Procedimiento.
Preparacin de la solucin de aminocidos patrones
Se preparan las soluciones de los siguientes 18 aminocidos patrones, todos de 99 % de
pureza, suspendiendo 1 mg (0,99) de cada aminocido/2.5 mL de solucin metanol:agua
(50:50, v/v) a pH 1.7: L(+)-cido glutmico (Fisher Scientific); L-cido asprtico, Lalanina, DL-fenilalanina, L(+)-glicina, lisina monoclorhidrato y L-tirosina (Merck); L(+)leucina, L(-)-treonina y L(+)-valina (Riedel-de Han); L-arginina y L-cistena clorhidrato
anhidro (Scharlau); L-prolina, L-serina y DL- triptfano (Sigma); monohidrato de Lasparagina, L-histidina y DL-metionina (Prolabo). Estimndose cada solucin de
aminocido patrn en 39,6 % (m/v), salvo las soluciones de lisina 31,69 % y de cistena
30,44 %. Se guardan en refrigeracin (4 C) hasta el momento de su aplicacin en los
cromatofolios.
1.- Recortar cuidadosamente una lmina para TLC (lminas de aluminio cubiertas con
slica gel) en un rectngulo de 5 cm de ancho por 10 cm de largo. Aydese de un cortador
de precisin.

2.- Por cualquiera de los dos extremos, marque una lnea tenue a una distancia de 1.5 cm de
la base. Sobre la lnea trazada, marque cuatro posiciones equidistantes con una pequea
cruz.
3.- Con la ayuda de un capilar coloque sobre la primera posicin una pequea cantidad de
la muestra problema. De igual manera coloque una pequea cantidad de cada una de las
soluciones de los compuestos de referencia en las posiciones restantes.

4.-Como fase mvil se utilizaran 45 ml. de una solucin de n-Butanol: cido actico: agua
destilada en proporciones 4:1:1 (v/v).

5.- Saturar la cmara cromatografa (Vaso 600 ml.) con la fase mvil por 10 minutos,
coloque dentro un trozo de papel filtro. Asegrese de que la cmara este bien sellada.

6.- Introducir la lmina para TLC en la cmara para que inicie el desarrollo cromatogrfico.
Asegrese de que la cmara este bien sellada.

7.- Poco antes de que la fase mvil alcance la parte superior de la lmina, detenga el
desarrollo de la cromatografa, retire la lmina, marque el frente del solvente y deje secar.

8.- Observe la lmina de TLC bajo luz UV dentro de una cabina, primero a 365 nm y luego
a 254 nm. Realice sus observaciones

9.- Roci la lmina con una solucin reveladora de ninhidrina, evite el exceso.

10.-Hornear la lmina entre 105 C y 120 C, de 5 a 15 minutos hasta que aparezcan las
bandas. Marcar la posicin central de cada una de las bandas observadas y calcule el factor
de retencin (Rf) para la muestra problema y para los compuestos de referencia segn:
Rf =

Distanciarecorridaporelcompuesto
Distanciarecorridaporelsolvente

Repita el proceso cromatogrfico de separacin de aminocidos (pasos del 1 al 7), dos


veces ms.

11.- En el primer caso revele la posicin de los compuestos utilizando p-anisaldehdoH2SO4. Para ello roci el cromatograma con el reactivo y hornear la lmina entre 105 C y
120 C, de 5 a 15 minutos hasta que aparezcan las bandas.
12.- Marcar la posicin central de cada una de las bandas observadas y calcule el factor de
retencin (Rf) para la muestra problema y para los compuestos de referencia.

13.- En el segundo caso revele la posicin de los compuestos utilizando H 2SO4 al 5% en


etanol o con yodo resublimado.
a) Para el caso del H2SO4, roci el cromatograma con el reactivo y hornee la lmina entre
105 C y 120 C, de 5 a 15 minutos hasta que aparezcan las bandas.
b) En el caso del yodo resublimado, coloque unas perlas dentro de un frasco mbar y
mantngalo cerrado por 5 minutos. Despus introduzca el cromatograma y cierre el frasco
entre 10 a 15 segundos, inmediatamente retirar la lmina del frasco.

4.- Marcar la posicin central de cada una de las bandas observadas y calcule el factor de
retencin (Rf) para la muestra problema y para los compuestos de referencia.

Cuestionario

Porque la reaccin entre la prolina y la ninhidrina no conduce a la formacin de un


complejo de color violeta?
A qu se debe que en ciertas ocasiones, la separacin de compuestos conocidos mediante
TLC conduzca a la obtencin de cromatogramas con bandas difusas o con un corrimiento
de barrido desde el punto de aplicacin de la muestra?
Porque la utilizacin de cido sulfrico o de yodo para la revelacin de compuestos
separados mediante TLC en placas con indicador fluorescente introduce mucho fondo?

Tratamiento de residuos
La mezcla de n-Butanol: cido actico se puede desechar en el lavabo con abundante agua.
Los residuos de ninhidrina mandar a confinamiento.
El cido sulfrico al 5% se va a neutralizar con hidrxido de sodio hasta PH 7 y se puede
desechar al lavabo. Los cristales de yodo utilizado se envan a confinamiento.

Prctica
6

Cromatografa

en

Capa Fina
Identificacin de aminocidos libres en jugo fresco de
naranja
Introduccin
Desde el punto de vista de la estabilidad en el almacenamiento de los jugos de naranjas
procesados, los aminocidos intervienen en las reacciones de oscurecimiento no enzimtico

y no deseables que suceden durante su almacenamiento a temperatura ambiental. La


cromatografa de capa fina es una de las tcnicas aplicadas en la separacin e identificacin
de aminocidos libres en frutos. Ventajas es procedimiento sencillo, rpido, econmico,
buena resolucin, las reacciones colorimtricas reveladas son compactas y se pueden
separar con facilidad de la cromatoplaca para recuperar el analito en cantidades inferiores al
g; puede ser empleada en laboratorios de baja complejidad como ensayo orientador, y la
resolucin puede aumentarse empleando tcnicas bidireccionales. La capa fina es
recomendada por los cromatografistas como procedimiento previo a las separaciones por
cromatografa lquida en columna (Scott, 2012). Proporciona una idea rpida de los
aminocidos predominantes en la muestra, lo que permite estimar su concentracin
favoreciendo la instauracin de las condiciones ptimas para las separaciones por columna.
Los resultados obtenidos con la cromatografa de capa fina aportan informacin al conjunto
de caractersticas de jugos, concentrados y cremogenados de naranjas, informacin que se
puede evaluar con el objeto de tipificar el carcter genuino de los productos y se puede usar
como paso previo a la cuantificacin por intercambio inico o por cromatografa lquida de
alta resolucin. Los autores recomiendan la tcnica monodireccional, ya que si la
resolucin es buena, adems del ahorro de tiempo y de solventes, se pueden minimizar los
efectos ambientales sobre el ensayo al correr simultneamente sobre una placa la muestra y
los patrones (Medina y Gallo, 2013).
Objetivo
Extraccin e identificacin de aminocidos libres por Cromatografa de Capa Fina (TLC)
en jugo fresco de naranja

Materiales

Reactivos

1 Centrifuga
5 Tubos para centrifuga
3 Vaso precipitado 50 ml
5 Pipetas serolgicas 1 ml
20 Tubos capilares
1 Extractor de Jugo
Papel pH
2 Probeta 100 ml
4 Matraz de aforacin 100ml
8 Tubos de centrifuga

Etanol 95%
Etanol- Agua 50:50(v/v)
Cloroformo, metanol, amoniaco al 25%(40:40:20)
Fenol - Agua 80:20 (/v)
Ninhidrina 0.2% (Seguir metodologa)
5 Naranjas maduras
cido actico al 10% (v/v)
NH3 al 0.88% v/v)
L-prolina,L-serina y L- triptfano,L-glicina 39.6 %
L- asparagina, L-histidina y DL-metionina 39.6 %

20 Tubos de ensaye 13 x 150

L-cido glutmico, arginina, 39.6 % (m/v)

2 Matraz E.M con Tapn 250 ml

L-alanina, L- leucina 39.6 %

Cromatofolios de 20 x 20 mm
1 Par de guantes

L-cido asprtico, treonina, valina39.6 % (m/v)


D L-fenilalanina, L-tirosina 39.6 %

Cmara cromatogrfica
1 Probeta de 100 ml

Lisina monoclorhidrato 31.69 %


Cistena clorhidrato anhidro 30.44 %

Procedimiento
1.- Se obtiene el jugo de 5 naranjas directamente por extraccin mecnica con un extractor
de jugos ctricos, casero. Se mide el pH.
2.- Separacin de las fases del jugo: el jugo se centrifuga a 2800-3500 rpm (15 min) en una
centrfuga. Se recupera el sobrenadante.
3.-Desproteinizacin: A 30 ml del sobrenadante se homogenizan agitando con los dedos
(como vortex) por 3 segundos con igual volumen de etanol 95 % (v/v), se deja reposar 10
segundos y se centrifuga nuevamente (15 min)
4.- Se recupera el sobrenadante y se le ajusta el pH a 1.7 para que los aminocidos libres en
solucin se encuentren en forma catinica, considerando que el pK1 del aminocido
histidina (1,82) es el menor de los aminocidos proteicos.
5.- Preparacin de la solucin de aminocidos patrones
Se preparan las soluciones de los siguientes 18 aminocidos patrones, todos de 99 % de
pureza, suspendiendo 1 mg (0,99) de cada aminocido/2.5 ml de solucin metanol:agua
(50:50, v/v) a pH 1.7: L(+)-cido glutmico (Fisher Scientific); L-cido asprtico, Lalanina, DL-fenilalanina, L(+)-glicina, lisina monoclorhidrato y L-tirosina (Merck); L(+)leucina, L(-)-treonina y L(+)-valina (Riedel-de Han); L-arginina y L-cistena clorhidrato
anhidro (Scharlau); L-prolina, L-serina y DL- triptfano (Sigma); monohidrato de Lasparagina, L-histidina y DL-metionina (Prolabo). Estimndose cada solucin de
aminocido patrn en 39,6 % (m/v), salvo las soluciones de lisina 31,69 % y de cistena
30,44 %. Se guardan en refrigeracin (4 C) hasta el momento de su aplicacin en los
cromatofolios.
6.- Preparacin de las combinaciones de solventes y el revelador de aminocidos
Solvente I: cloroformo: metanol: amonaco 25 % (v/v) (40:40:20)

Solvente II: fenol: agua 80:20 (m/v). A un recipiente de 500 g de fenol, se le aade
lentamente 125 ml de agua destilada. Se cierra y se deja en reposo toda la noche. La
solucin es estable indefinidamente en envase opaco a la luz.
Revelador de aminocidos: solucin de ninhidrina (Riedel-de Han) al 0,2 % (m/v):
0,2000 g de ninhidrina (Riedel-de Han) en 95 ml de n-butanol. Se afora a 100 ml con
cido actico al 10 % (v/v) (5 ml). Se conserva indefinidamente en refrigeracin.
7.-Preparacin de las cubetas cromatogrficas de vidrio (28 x 13 x 10 cm): Se vierten
50 mL de cada una de las soluciones de solventes en una cubeta destinada a esa solucin.
En el caso de la combinacin de solventes II, fenol: agua 80:20 (m/v), una vez decantados
los 50 mL de la solucin, en la cubeta correspondiente, se le aaden 0,25 ml de NH3 0,880
% (v/v). Las cubetas se tapan y se espera la saturacin de la atmsfera antes de introducir
en ellas los cromatofolios correspondientes a la corrida cromatogrfica con esa
combinacin de solventes. Temperatura promedio durante la ejecucin de las
cromatografas 23 C 2 C.
8.-Preparacin de las cromatofolios de slica gel 60 (Merck) 20 x 20 cm, espesor 0,25
mm, sin indicador No se activaran por calor, por lo cual el gel de slice contiene humedad
suficiente para que el mecanismo de reparto de los aminocidos sea similar al de la
cromatografa en papel.

9.- Cromatografa monodireccional


Se aplica en un extremo, de cada uno de 4 cromatofolios, una muestra de 10 l del residuo
seco del jugo de naranja recin extrado y suspendido en metanol: agua. En cada par de
cromatofolios, adems se distribuyen, cantidades de 10 L de cada una de las soluciones de
9 aminocidos de referencia y 9 diferentes aminocidos en el otro cromatofolio. Dos
cromatofolios para la cromatografa monodireccional I (con la combinacin de solventes I)
y 2 para la cromatografa monodireccional II (con la combinacin de solventes II).
10.- Cromatografa bidireccional: se aplica, en un extremo de cada uno de 2
cromatofolios, una muestra de 5 l del residuo seco de la muestra del jugo de naranja recin
extrado y suspendido en metanol: agua.
Se aplican los volmenes de muestras con un tubo capilar. Se secan con corriente de aire
caliente, y una vez secos, se colocan 2 cromatofolios con las superficies de trabajo
contrapuestas para la corrida monodireccional en la cubeta con la combinacin de solventes
I y 2 en la cubeta con la combinacin de solventes II. Se deja ascender el solvente de ambas
cubetas sobre los cromatofolios, hasta que el frente del mismo alcanza una distancia de 150

mm en cada una. Se sacan los cromatofolios y se dejan expuestos al aire bajo campana y a
temperatura ambiental hasta evaporacin completa del solvente. Se revelan los
aminocidos.
11.- Se colocan 2 cromatofolios, ya preparados en la cubeta con la combinacin de
solventes I con las superficies de trabajo contrapuestas. Una vez el frente recorre los 150
mm, se sacan, se deja evaporar el solvente completamente bajo campana, se gira cada placa
90 en el sentido de las agujas del reloj y se colocan en la cubeta para el desarrollo con la
combinacin de solventes II. Una vez que el frente recorri los 150 mm, se sacan y se deja
evaporar el solvente completamente bajo campana. Se revelan los aminocidos.
12.- Revelado de los aminocidos
Se roca cada cromatofolio con el revelador y se deja evaporar el solvente, en corriente de
aire, bajo campana y a temperatura ambiental. Luego se colocan las lminas en estufa a 100
C x 5 min hasta el desarrollo del color azul caracterstico de la reaccin de condensacin
entre la ninhidrina y cada aminocido. Si la reaccin ocurri entre el revelador y los aminocidos el color se desarrolla en fro, mientras que los aminocidos heterocclicos no
aromticos y los alifticos, desarrollan el color en caliente.

13.- Identificacin de los aminocidos separados en la capa fina


Una vez revelados los aminocidos, se delinea el borde de cada uno de ellos y se marca el
centro respectivo con lpiz de grafito. Se obtiene el Factor de Retardo (Rf) para cada
reaccin revelada midiendo la distancia recorrida por cada aminocido en cada
combinacin de solventes, desde el punto de origen en la lnea base del cromatofolio, donde
se sembr la muestra, y el centro de cada una de las reacciones reveladas. Luego se calcula
el cociente de cada una de las distancias con respecto al recorrido del frente del
solvente (150 mm). Se expresa en porcentaje del desplazamiento (Rf %). Ese cociente es
caracterstico para cada uno de los aminocidos en iguales condiciones de trabajo. Con la
intencin de controlar algunas de las variables que afectan al Factor de Retencin (Rf):
humedad de las fases mvil y estacionaria, temperatura, grado de saturacin de la cmara
de desarrollo con los vapores de la fase mvil, se obtiene el Factor de Retencin Relativo
(Rx) para cada aminocido libre revelado con respecto al del aminocido de referencia
asociado, o cociente entre las distancias recorridas por el aminocido a identificar y el
patrn asociado en igualdad de condiciones. Si bien no es posible un dominio absoluto de
las mismas se minimiza el efecto.

14.-. Marcar la posicin central de cada una de las bandas observadas y calcule el factor de
retencin para ambas dimensiones (Rf) segn:
Rf =

Distanciarecorridaporelcompuesto
Distanciarecorridaporelsolvente

La identificacin se realiza comparando: 1, los Rf % de cada una de las reacciones


positivas a la ninhidrina desarrollada a partir de cada muestra de jugo, con los Rf %
obtenidos de las muestras de las soluciones patrones de cada uno de los 18 aminocidos. 2,
superponiendo la reaccin a identificar con el patrn asociado. 3, considerando el color de
las reacciones desarrolladas frente a la ninhidrina por los aminocidos libres en cada una de
las muestras con el color desarrollado por los aminocidos patrones en igualdad de
condiciones. 4, considerando el Rx entre el aminocido libre revelado con respecto al del
aminocido de referencia asociado. 5, considerando las ubicaciones relativas de los
aminocidos revelados y los patrones durante esta experiencia con las sealadas por
Medina y Gallo, 2013.
Cuestionario
1.- Qu aminocidos se pudieron identificar en la muestra de jugo con respecto a los
valores de Rf obtenidos de los aminocidos de referencia?
2.- Por qu se debe aplicar calentamiento en el revelado de esta prctica para
identificacin de aminocidos?

Tratamiento de residuos Los residuos del solvente I: cloroformo: metanol: amonaco se


etiquetan y se mandan a confinamiento. Los cromatofolios con ninhidrina se etiquetan y se
mandan a confinamiento. Los dems residuos se pueden desechar directamente al lavado.

Prctica 7

Cromatografa bidimensional Extracto de


betalanas
Introduccin
La cromatografa bidireccional se utiliza cuando se tiene una mezcla compleja o de
compuestos con caractersticas fisicoqumicas muy semejantes que no se separa por
completo en un solo cromatograma y se utiliza una adaptacin; en esta tcnica se realiza un
cromatograma en forma normal, salvo que la muestra se aplica en una esquina de la placa y
el cromatograma se corre en forma paralela a uno de los bordes de dicha placa. Luego de
que se haya corrido la muestra y ya seco, se rota la placa a 90 grados y se realiza una
cromatografa paralela al segundo borde, utilizando otro sistema de solventes o fase mvil.
Dado que cada compuesto migra a una velocidad caracterstica en un sistema de solventes
determinado, la segunda cromatografa debera incrementar en forma sustancial la
separacin de la mezcla o muestra en sus componentes (Skoog, 2001).

Figura. Cromatografa bidireccional


Objetivo
Separar mediante cromatografa en capa fina de dos dimensiones una mezcla de
compuestos con caractersticas fisicoqumicas semejantes

Materiales

Reactivos

1 Lamina para TLC


1 Cutter

Extracto de betalainas de la practica 2


Acetato de etilo

2 Vaso de precipitados de 250 ml.

Metanol

1 Papel filtro
1 Probeta 100 ml

cido actico glacial


Agua destilada

Regla
Procedimiento
1.- Con ayuda de un cortador de precisin, recortar cuidadosamente una lmina para TLC
(lminas de aluminio cubiertas con slica gel) en un cuadrado de 5 cm de longitud por lado.
2.- Por cualquiera de los lados marque con un lpiz una tenue lnea a una distancia de 1 cm
de la base de la lmina.
3.- Rote la lmina 90 y trace nuevamente sobre el otro extremo una lnea tenue a una
distancia de 1 cm de la base.
4.- Con la ayuda de un capilar colocar sobre la interseccin de las dos lneas marcadas una
pequea cantidad de extracto de betalanas, dejar que se seque.

5.-Como fase mvil para desarrollar la primera dimensin, se utilizaran 10 ml. de una
solucin de Acetato de etilo: Metanol: cido actico: agua destilada en proporciones
2:4.8:0.2:3 (v/v).
6.- Saturar la cmara cromatografa (Vaso precipitado 250 ml.) con la fase mvil por 10
minutos, coloque dentro un trozo de papel filtro. Asegrese de que la cmara este bien
sellada.
7.- Introducir la lmina para TLC en la cmara para que inicie el desarrollo cromatogrfico.
Asegrese de que la cmara este bien sellada.
8.- Poco antes de que la fase mvil alcance la parte superior de la lmina, detenga el
desarrollo de la cromatografa, retire la lmina, marque el frente del solvente.
9.- Marque dbilmente el rea de cada banda separada en la primera dimensin, y deje
secar.
10.- Como fase mvil para desarrollar la segunda dimensin, se utilizaran 10 ml. de una
solucin de Acetato de etilo: Metanol: cido actico: agua destilada en proporciones
2:4.8:0.2:3 (v/v).
11.- Poco antes de que la fase mvil alcance la parte superior de la lmina, detenga el
desarrollo de la cromatografa, retire la lmina, marque el frente del solvente.
12.- Marque dbilmente el rea de cada banda separada en la segunda dimensin, y deje
secar.
13.- Roci la lmina con una solucin de H 2SO4 al 5 % en etanol, o con el reactivo panisaldehido-H2SO4.
14.- Hornear el papel a 105 C de 5 a 15 minutos hasta que aparezcan las bandas. Marcar la
posicin central de cada una de las bandas observadas y calcule el factor de retencin para
ambas dimensiones (Rf) segn:
Rf =

Distanciarecorridaporelcompuesto
Distanciarecorridaporelsolvente

Cuestionario
Estructuralmente hablando, cual es el principal factor que determina que la betanina haya
presentado un Rf ms alto?
Qu factor dificulta la separacin de estas betalanas?
Partiendo de las fases mviles utilizadas, podra usted proponer una combinacin fases
mviles para mejorar la resolucin de la separacin de las betalanas?

Tratamiento de residuos
La solucin de Acetato de etilo: Metanol: cido actico: agua destilada se neutraliza el pH
y diluir antes de desechar al lavabo con abundante agua ya que es muy peligrosa
almacenarla para su confinamiento por ser el acetato de etilo muy inflamable.

SECCIN

III

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA

Prctica 8

Cromatografa en columna de carotenos


Introduccin
En 1903 el botnico ruso Tswett, logr la separacin de los componentes de una mezcla de
pigmentos vegetales mediante una columna de vidrio rellena de CaCO 3, al hacer pasar a
travs de ella una disolucin de los mismos en ter de petrleo. La adsorcin
cromatogrfica fue el primer mecanismo de separacin descrito. En 1931, los
investigadores Kuhn, Winterstein y Lederer introducen el empleo de columnas rellenas con
Al2O3, para la separacin de sustancias lipofilicas. Las sustancias de naturaleza hidrfila,
como los constituyentes de las protenas, polisacridos, alcaloides y componentes de los
cidos nucleicos, no fueron separadas eficientemente hasta que Martin y Synge 1941,
introducen el empleo de columnas rellenas de Silica gel.
La cromatografa en columna es el mtodo ms utilizado para la separacin y
purificacin de compuestos orgnicos, slidos o lquidos, a escala preparativa. La fase
estacionaria (adsorbente) se coloca en una columna de vidrio que termina en un

estrechamiento con una llave y se impregna con el eluyente (fase mvil). La mezcla a
separar se deposita en la parte superior de la columna y la fase mvil atraviesa el sistema
(Figura). Los compuestos se van eluyendo disueltos en el eluyente, se van recogiendo
ordenadamente en fracciones de pequeo volumen (1,2,...) y se analizan por CCF. Los
productos van saliendo de la columna segn su polaridad, primero salen los menos polares
que son los menos retenidos por el adsorbente y los ltimos los ms polares por su mayor
retencin en la fase estacionaria. El adsorbente ms utilizado para este tipo de
cromatografa es el gel de slice y en segundo lugar la almina. El tamao de partcula del
adsorbente es importante para la separacin y su eleccin depende en gran medida de que la
elucin de la cromatografa se realice por gravedad o a media presin. En una elucin a
media presin se pueden emplear tamaos de partcula ms pequeos, que permiten una
separacin ms eficaz. Sin embargo, en una elucin por gravedad el uso de tamaos de
partcula pequeos impedira el flujo del disolvente. Antes de realizar una separacin en
cromatografa de columna hay que elegir adecuadamente el disolvente haciendo ensayos en
CCF (Skoog, 2001); (Sierra, 2010).

Figura. Columna preparada con de silica gel

Objetivo
Separar una mezcla de compuestos de polaridad semejante por fraccionamiento mediante
cromatografa en columna.

Materiales

Reactivos

2 Vaso de precipitados de 600 mL


4 Vaso de precipitados de 100 mL
1 Probeta de 10 mL
30 Tubos de 13x100
1 Bureta
1 Embudo chico
1 Esptula chica
1 Gradilla para tubos
1 Capilar de vidrio
5 Pipetas Pasteur
1 Papel filtro Whatmann # 1
1 Plancha elctrica
1 Magneto chico para agitacin
1 Lmpara UV
1 Termmetro
1 Regla para medir en mm
1 Tabla para picado
1 Tijeras o cuter
Papel aluminio

Etanol grado
Acetato de etilo
Hexano
Agua destilada
Perlas de Iodo
Slica gel 60
Extracto de caroteno

Procedimiento
Preparacin de la columna
1.- Tome un bureta de 25 ml. limpia sin residuos de jabn o detergente y colquele en el
fondo un pequeo trozo de papel filtro de 0.9 cm de dimetro. El objetivo es que el papel
sirva de filtro, para que permita el paso de los compuestos en solucin pero que evite la
salida de la resina. Tambin puede emplearse un pequeo trozo de algodn previamente
lavado con hexano.
2.- Coloque la bureta en un soporte universal, asegrese de que quede bien sujeta y
nivelada. Puede ayudarse de un nivel de agua con burbuja de aire para hacerlo.
3.- Sobre la bureta coloque un embudo de vidrio limpio sujeto con un soporte universal. No
deje que el embudo se recargue en la columna.
4.- Debajo de la bureta coloque un vaso de precipitado limpio de 100 ml.
Preparacin de la resina y Empacado de la columna
1.- Si no utiliz una bureta como columna es necesario calcular el volumen de la misma.
Para ello mida dimetro y longitud. Si utiliz una bureta como columna, el volumen ya est
dado, pues la bureta esta graduada.

2.- En base a la cantidad de muestra que se dese separar, determine la cantidad de slica gel
a utilizar en base a la relacin de saturacin 1:30 (muestra/adsorbente), y activarla a 100 C
por 1 hora. Le sugerimos utilizar 0.5 g de muestra y 15 g de slica gel, o cantidades
menores.
3.-Dejar enfriar la slica lo ms posible y agregarle un volumen de la fase mvil a utilizar
procurando que el lquido cubra el volumen ocupado por la slica.
4.-Con la ayuda de una esptula pequea, mezclar la slica y eliminar la totalidad de las
burbujas atrapadas entre el lquido.
5.- Incline el vaso con la slica sobre el embudo y con la ayuda de una esptula pequea
vaci la slica dentro de la bureta. Procure que la slica siempre quede embebida en el
solvente y que una vez empacada no se formen burbujas de aire dentro de ella.
Si no pudo vaciar toda la slica dentro de la bureta, abra la llave y deje salir lentamente el
solvente, colctelo y vacelo en el recipiente donde le quedo slica sin empacar. Vuelva a
agregar la slica a la bureta y evite dejar la slica empacada sin solvente
6.- Deje que la slica se compacte por accin de la gravedad, espere por 15 a 30 minutos.
7.- Abra nuevamente la llave de la bureta y deje salir lentamente el solvente. Justo cuando
el lquido se posicione en el mismo nivel de la slica cierre la llave de la bureta.
8.- Por ultimo coteje que la columna est bien centrada y nivelada, de lo contrario la
muestra no se separar correctamente.
Preparacin y aplicacin de la muestra
La aplicacin de la muestra se puede realizar de dos formas:

Mtodo A
1.- Tom una cantidad de muestra de carotenos y re suspndala en la mnima cantidad de
solvente necesario.
2.- Con ayuda de una pipeta Pasteur de vidrio coloque la muestra dentro de la columna
sobre la slica empacada. Hgalo gota a gota y de manera lenta y sin prisa. Observara que la
muestra es adsorbida por la slica.
3.-A medida que la muestra se deposite en la slica usted tendr que abrir lentamente la
llave de la bureta para permitir que un poco de solvente salga y que la muestra se

introduzca en la slica para que usted pueda seguir depositando la muestra restante. ES
IMPORTANTE cerrar la llave una vez que la muestra se introdujo en la slica.
4.- De manera cuidadosa coloque un pequeo trozo de algodn (previamente lavado con
hexano) dentro de la bureta, por debajo de la boca de la misma.
Mtodo B
1.- Cuando sea difcil disolver la muestra o como mtodo alternativo de aplicacin de
muestra, se utiliza este procedimiento. Para ello, tom una cantidad de muestra definida y
re suspndala en la mnima cantidad necesaria de un solvente polar y voltil.
2.- Mezcle la muestra con una cantidad definida de adsorbente, utilice 5 g de adsorbente
por cada gramo de muestra.
3.- Elimine el solvente voltil colocando la mezcla en un evaporador rotatorio a baja
temperatura.
4.- Una vez que la mezcla adsorbente mezcla est seca, depostela sobre la columna de
manera homognea.
Elusin de la muestra
Antes de iniciar con la separacin de la muestra usted debe de tener en claro de qu forma
realizara la elusin, mediante la adicin continua de una fase mvil con polaridad creciente,
o con la adicin de una fase mvil isocrtica. Tales condiciones pueden ser determinadas
utilizando cromatografa en capa fina y en dos dimensiones.
1.- Para una fase mvil isocrtica prepare por lo menos una cantidad equivalente a tres
volmenes de columna.
2.- Por las paredes de la bureta agregue lentamente la fase mvil (mezcla de 60 ml de
hexano, 20 ml de acetato de etilo y 20 ml de etanol). Evite que la muestra sea extrada de la
slica. Si esto sucede, lo recomendable es abrir la llave de paso y seguir agregando poco a
poco ms fase mvil hasta que la muestra se introduzca en la slica por lo menos 0.5 cm
ms. Luego se puede cerrar la llave de paso y continuar agregando ms fase mvil a la
columna.
3.- Una vez que la fase mvil ha sido agregada a la columna, abra la llave de la columna
para que inicie el proceso de separacin de la muestra, mantenga un flujo constante de
salida.

4.- En un vaso de precipitados colecte el 95% del primer volumen de columna (volumen
muerto), despus de ello colecte las eluciones con tubos de ensaye numerados en
volmenes de 5 ml.
5.- Para dar seguimiento al proceso de separacin, realice para cada tubo de ensaye impar
una cromatografa en capa fina. Utilice la misma fase mvil con la cual la columna est
siendo eluda. En base al patrn de bandas observado bajo luz UV o revelado con vapores
de Iodo, agrupe las elusiones en fracciones.
6.- Evapore las fracciones en bao de agua hasta casi sequedad, y realice una cromatografa
en capa fina a cada una de ellas. Observe si las diferentes fracciones comparten bandas en
comn y concluya los resultados obtenidos.
Falta decir que las fracciones se pueden agrupar por nmero, volumen o Rf de las bandas
observadas

Tratamiento de residuos
Los residuos de hexano, acetato de etilo y etanol se diluyen antes de desechar al lavabo con
abundante agua ya que es muy peligrosa almacenarla para su confinamiento por ser el
acetato de etilo muy inflamable.

Prctica 9

Cromatografa en columna cuantitativa de


betaninas
Introduccin

En la cromatografa en columna la separacin se consigue haciendo fluir la mezcla a travs


de una columna de adsorbente. Los compuestos emergen de la columna a tiempos
diferentes, y pueden ser recogidos en fracciones separadas.
En una columna cromatogrfica se deben tener en cuenta los siguientes trminos:

matriz de la columna. Sustancia que est empapada de solvente y que se


empaqueta en la columna. Tambin se denomina el lecho de la columna.

longitud de la columna. Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la


columna.

volumen de la columna. Volumen total de gel que se empaqueta en una columna


cromatogrfica.

volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que tiene que atravesar la


columna para asegurar que se ha reemplazado completamente.

Comnmente se suele usar como adsorbente almina o slice. Las fases mviles se usan en
funcin de la polaridad de los compuestos a separar (Skoog y cols: 2001).
Objetivo
Separar dos grupos de compuestos conocidos mediante cromatografa en columna y
determinar su concentracin en la muestra de extracto de betanina.
Materiales
Materiales
2 Vaso de precipitados de 600 mL
4 Vaso de precipitados de 100 mL
1 Probeta de 10 mL
1 Bureta 25 ml
1 Embudo chico
1 Esptula chica
1 Soporte Universal y pinzas
1 Pipeta serolgica de 1 ml
Procedimiento
Preparacin de la columna

Reactivos
Metanol
Acetato de etilo
Agua destilada
Slica para columna gel
60
Papel filtro
cido actico glacial

1.- Tome un bureta de 25 ml. limpia sin residuos de jabn o detergente y colquele en el
fondo un pequeo trozo de papel filtro de 0.9 cm de dimetro. El objetivo es que el papel
sirva de filtro, para que permita el paso de los compuestos en solucin pero que evite la
salida de la resina. Tambin puede emplearse un pequeo trozo de algodn previamente
lavado con hexano.
2.- Coloque la bureta en un soporte universal, asegrese de que quede bien sujeta y
nivelada. Puede ayudarse de un nivel de agua con burbuja de aire para hacerlo.
3.- Sobre la bureta coloque un embudo de vidrio limpio sujeto con un soporte universal. No
deje que el embudo se recargue en la columna.
4.- Debajo de la bureta coloque un vaso de precipitado limpio de 100 ml.
Preparacin de la resina y Empacado de la columna
1.- En base a la cantidad de muestra que se dese separar, determine la cantidad de slica gel
a utilizar en base a la relacin de saturacin 1:30 (muestra/adsorbente), y activarla a 100 C
por 1 hora. Le sugerimos utilizar 0.5 g de muestra y 15 g de slica gel, o cantidades
menores.
2.-Dejar enfriar la slica lo ms posible y agregarle un volumen de la fase mvil a utilizar
procurando que el lquido cubra el volumen ocupado por la slica.
3.-Con la ayuda de una esptula pequea, mezclar la slica y eliminar la totalidad de las
burbujas atrapadas entre el lquido.
4.- Incline el vaso con la slica sobre el embudo y con la ayuda de una esptula pequea
vaci la slica dentro de la bureta. Procure que la slica siempre quede embebida en el
solvente y que una vez empacada no se formen burbujas de aire dentro de ella.
Si no pudo vaciar toda la slica dentro de la bureta, abra la llave y deje salir lentamente el
solvente, colctelo y vacelo en el recipiente donde le quedo slica sin empacar. Vuelva a
agregar la slica a la bureta y evite dejar la slica empacada sin solvente
5.- Deje que la slica se compacte por accin de la gravedad, espere por 15 a 30 minutos.
6.- Abra nuevamente la llave de la bureta y deje salir lentamente el solvente. Justo cuando
el lquido se posicione en el mismo nivel de la slica cierre la llave de la bureta.
7.- Por ultimo coteje que la columna est bien centrada y nivelada, de lo contrario la
muestra no se separar correctamente.
Preparacin y aplicacin de la muestra

1.- Tom una cantidad de extracto de betanina y re suspndala en la mnima cantidad de


solvente necesario.
2.- Con ayuda de una pipeta de 1 ml coloque la muestra dentro de la columna sobre la slica
empacada. Hgalo gota a gota y de manera lenta y sin prisa. Observara que la muestra es
adsorbida por la slica.
3.-A medida que la muestra se deposite en la slica usted tendr que abrir lentamente la
llave de la bureta para permitir que un poco de solvente salga y que la muestra se
introduzca en la slica para que usted pueda seguir depositando la muestra restante. ES
IMPORTANTE cerrar la llave una vez que la muestra se introdujo en la slica.
4.- De manera cuidadosa coloque un pequeo trozo de algodn (previamente lavado con
hexano) dentro de la bureta, por debajo de la boca de la misma.
Elusin de la muestra
1.- Para una fase mvil isocrtica prepare por lo menos una cantidad equivalente a tres
volmenes de columna, mezclando 48 ml de metanol, 20 ml de acetato de etilo, 2 ml de
cido actico glacial y 30 ml de agua destilada.
2.- Por las paredes de la bureta agregue lentamente la fase mvil. Evite que la muestra sea
extrada de la slica. Si esto sucede, lo recomendable es abrir la llave de paso y seguir
agregando poco a poco ms fase mvil hasta que la muestra se introduzca en la slica por lo
menos 0.5 cm ms. Luego se puede cerrar la llave de paso y continuar agregando ms fase
mvil a la columna.
3.- Una vez que la fase mvil ha sido agregada a la columna, abra la llave de la columna
para que inicie el proceso de separacin de la muestra, mantenga un flujo constante de
salida.
4.- En un vaso de precipitados colecte el 95% del primer volumen de columna (volumen
muerto), despus de ello colecte las eluciones con tubos de ensaye numerados en
volmenes de 5 ml.
5.- Para dar seguimiento al proceso de separacin, realice para cada tubo de ensaye impar
una cromatografa en capa fina. Utilice la misma fase mvil con la cual la columna est
siendo eluda.
6.- Determinar la concentracin espectromtrica de la betanina y betaxantina utilizando la
ecuacin de la ley de Lamber Beer.

Cuestionario
1.- Realice la grfica del cromatograma en hoja milimtrica.
2.- En la muestra utilizada cul de los compuestos se obtuvo en mayor concentracin?
Tratamiento de residuos
La solucin de Acetato de etilo, Metanol, cido actico, agua destilada se puede desechar
al lavabo con abundante agua ya que es muy peligrosa almacenarla para su confinamiento
por ser el acetato de etilo muy inflamable.

SECCIN

IV

PURIFICACIN DE PROTENAS

Prctica 10

Aislamiento de Bromelina
Introduccin
Las enzimas proteolticas catalizan la hidrlisis de los enlaces peptdicos de protenas y
participan en variados procesos fisiolgicos, al estar involucradas en todo el ciclo de vida

de las protenas desde su biosntesis, control de destino y activacin, hasta su degradacin.


Se clasifican en clases y familias que estn ampliamente distribuidas en animales, plantas y
microorganismos.
La bromelina miembro de la familia papana, ha sido aislada de rganos de plantas de la
familia Bromeliaceae. Se extrajo por primera vez del jugo de la pia a finales del siglo
XIX. Es la ms abundante de las cisteino-proteasas identificadas en extractos de rganos de
la pia .Las aplicaciones de estas biomolculas con fines alimenticios y teraputicos son
muy variadas, algunas se reconocen como remedios naturales, otras como frmacos
modificadores de la respuesta biolgica. La mayor y ms antigua aplicacin de la bromelina
es como ablandador de carnes. Es tambin efectiva en la produccin de hidrolizados y
medios de cultivo. Tiene varias acciones farmacolgicas: aumenta la absorcin de otros
medicamentos, inhibe la agregacin plaquetaria y se ha utilizado como digestivo,
antinflamatorio, as como en la formulacin de vacunas. En estudios recientes se demostr
su actividad antitumoral y se ha informado que la bromelina induce respuestas del sistema
inmune (Badui, 2006); (Corzo y col: 2009).
Objetivo
Aislar la bromelina mediante el protocolo de precipitacin con sulfato de amonio

Materiales
2 Vaso de precipitados de 600 mL
4 Vaso de precipitados de 100 mL
1 Probeta de 100 mL
8 Tubos para centrifuga
1 Embudo chico
1 Esptula chica
1 parrilla con agitacin
1 Pipeta serolgica de 1 ml
1 magneto
Termometro 100 oC
Cuba hidroneumtica
Procedimiento

Reactivos
NaOH (1M)
cido tricloroactico 10%
Agua destilada
Solucin de casena-azo al 0.2 %
buffer de extraccin
Hielo
NH4SO4

Extraccin de la bromelina (extracto original o crudo)

1.- Cortar 50 g de pulpa de pia en pequeos trozos y triturarla en una licuadora


2.- Aadir 75 ml. del buffer de extraccin a la pulpa triturada y homogenizar en la
licuadora.
3.- Filtrar la suspensin homognea para eliminar la fibra y obtener el sobrenadante.
(Utilizar cuatro capas de gasa sobrepuestas como filtro)
4.- Centrifugar en tubos para centrifuga (cnicos) el sobrenadante colectado por filtracin,
3000 r.p.m. por 30 minutos.
5.- Rescatar el sobrenadante (extracto clarificado) y almacenarlo en bao de hielo, o a 4 C.
6.-Medir actividad enzimtica mediante el ensayo azo-casena del extracto clarificado.
Fraccionamiento con sulfato de amonio
1.- Colocar 50 ml. del extracto clarificado (crudo) en un vaso de precipitados de 100 ml. y
mantenerlo en bao de hielo con agitacin constante.
2.- Utilizando la tabla anexa, determine la cantidad en gramos de sulfato de amonio
necesario para llevar la muestra a los siguientes puntos de saturacin: 0 al 20 %, 20 al 30
%, 30 al 60% y del 60 al 70 %.
3.-Con la ayuda de una pequea esptula agregar lentamente el sulfato de amonio a la
muestra, debe de evitarse la presencia de cristales de sal en el fondo del vaso.
4.-Dejar la muestra en agitacin por 5 minutos, luego dejar reposar por 5 minutos.
5.- Centrifugar la muestra a 3000 r.p.m. por 10 minutos, y separar el sobrenadante del
precipitado. Registrar el volumen del sobrenadante y mantenerlo en bao de hielo con
agitacin constante.
6.- Tomar una alcuota del sobrenadante y medir actividad enzimtica mediante el ensayo
de azo-casena.
7.- Tomar una alcuota del precipitado, re suspenderlo en buffer de extraccin y medir
actividad enzimtica mediante el ensayo azo-casena
8.- Una vez que se ha obtenido la primera fraccin (las protenas contenidas en el
sobrenadante saturado con un 20 % de NH 4SO4, y las protenas que precipitaron con ese
porcentaje de saturacin) la muestra debe de llevarse al siguiente punto de saturacin que es
del 30 %. Para ello debe de utilizarse la tabla anexa, y determinarse la cantidad en gramos
de NH4SO4 que ha de aadirse a la muestra en base al volumen registrado en el paso 5.
9.- Con la ayuda de una pequea esptula agregar lentamente el sulfato de amonio a la
muestra para saturarla al 30 %, debe de evitarse la presencia de cristales de sal en el fondo
del vaso.
10.- Dejar la muestra en agitacin por 5 minutos, luego dejar reposar por 5 minutos.
11.- Centrifugar la muestra a 3000 r.p.m. por 10 minutos, y separar el sobrenadante del
precipitado. Registrar el volumen del sobrenadante y mantenerlo en bao de hielo con
agitacin constante.

12.- Medir actividad enzimtica mediante el ensayo de azo-casena de una alcuota del
sobrenadante, y de una alcuota del precipitado re suspendido en buffer de extraccin.
13.- Continuar con el fraccionamiento la muestra repitiendo los pasos del 8 al paso 12.
Guardar cada una de las fracciones obtenidas en cada punto de saturacin (sobrenadante y
precipitado) para la siguiente prctica.
Evaluacin de la actividad enzimtica (Proteasa) con casena-azo
1.-A 1 ml. de extracto proteico (extracto clarificado o fraccin) agregar 1 ml. de una
solucin de casena-azo al 0.2 % en buffer de extraccin.
2.- Mezclar e incubar en bao de agua por 5 minutos a 55 C.
3.- Detener la reaccin con 2 ml. de TCA al 10% (cido tricloroactico) e incubar la mezcla
a temperatura ambiente por 15 minutos.
4.- Eliminar de la mezcla los componentes insolubles por centrifugacin a 3000 r.p.m por
15 minutos.
5.- Tomar 2 ml. del sobrenadante y mezclarlos con 2 ml. de NaOH (1M). Leer la
absorbancia a 440 nm.

CUESTIONARIO

Tratamiento de residuos
El cido tricloroactico se enva a confinamiento.
El sulfato de amonio y el hidrxido de sodio se ajustan su pH para desechar en el lavabo.

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