Cromatografa

Rafael I. Uribe Acevedo

Residente de primer ao Toxicologa Clnica U. de A.
Derechos de autor, 2013. Solo para uso educativo, no para uso comercial. Prohibida su distribucin sin autorizacin de la Universidad de Antioquia.

Cromatografa
Sistema analtico que permite separar los diferentes
componentes de una muestra problema por distribucin
entre dos fases, una estacionaria y otra mvil, con el fin de
identificarlos y/o cuantificarlos.

Fase Mvil: Efecto de desplazamiento ejercido sobre los

componentes de la mezcla por una fase mvil, que puede ser
un liquido o un gas, sobre una fase estacionaria.

Fase estacionaria: Efecto de retencin producido sobre los

componentes de la mezcla por una fase estacionaria, que
puede ser slida o lquida, anclada a un soporte slido.

Tipos de cromatografa
Segn la naturaleza de la fase estacionaria y de la fase mvil.
a. Slido Liquido (Estacionaria= Slida y la Mvil = Liquida)
b. Liquido Liquido (Estacionaria= Liquido anclado a un
soporte solido)
c. Liquido Gas (Estacionaria= Liquido no voltil impregnado
en un slido y la Mvil = Gas)
d. Slido Gas (Estacionaria = Solida y la Mvil = Gas)

Tipos De Cromatografa
Segn el tipo de interaccin que se establece entre los
componentes de la fase mvil y la fase estacionaria.
a. Absorcin (Estacionaria = Slido polar capaz de adsorber a
los componentes de la mezcla mediantes
interacciones de tipo polar)
b. Particin (Separacin por solubilidad de los componentes de
la mezcla en las fases estacionaria y mvil,
ambas liquidas)
c. Intercambio Inico (Estacionaria= Slido con grupos funcionales
ionizables cuya carga se pueden
intercambiar con los iones de la fase mvil)

Modos de Trabajar la Cromatografa

Capa fina
Capa fina de alta eficiencia (HPTLC)
Columna
Liquida de alta presin

Gas
Papel

Cromatografa De Capa Fina

Tcnica utilizada para separar los componentes puros de
una mezcla, de acuerdo con su polaridad.

Elementos:
Cromatoplaca : Hoja de vidrio de 20 x 20 cm, recubierta
con el soporte o sorbente.
Eluyente: Solvente o mezcla de solventes.
Cubeta: Contiene al eluyente y a la cromatoplaca.

Cromatografa De Capa Fina

Principio del mtodo.
Capa uniforme de un absorbente mantenido sobre una placa
que puede ser de vidrio, aluminio u otro soporte, sobre la cual
corren las sustancias a separar por medio de un solvente (fase
mvil). La fase mvil es liquida y la estacionaria solida y polar
(slica gel)

El eluyente generalmente es menos polar que la fase

estacionaria (slica gel) por tanto, entre mas rpido se desplace
un componente ser menos polar.

Cromatografa De Capa Fina

El valor de referencia depende de las condiciones bajo las
cuales se corre la muestra (Absorbente, eluyente, T, etc.)

La reproductibilidad de la
tcnica es de +/- 20% por lo
cual se recomienda correr
un duplicado en la misma placa.

Organofosforados, carbamatos,
organoclorados, anticoagulantes,
estricnina y piretroides.

Cromatografa De Capa Fina

Tcnica:
La mezcla a analizar se deposita a una pequea distancia del
borde inferior de la placa y se introduce en una cubeta que
contiene la fase mvil.

La fase mvil asciende a lo largo de la placa por capilaridad,

desplazando los componentes de la mezcla a diferentes
velocidades, provocando su separacin.

Cuando el frente del disolvente se encuentra prximo al

extremo superior de la placa se saca y se visualiza.

Cromatografa De Capa Fina

Cromatografa De Capa Fina

Solventes mas comunes de menos a mas polar:
Hexano

Acetonitrilo

Ciclohexano

Acetato de etilo

Tetracloruro de carbono

Acetona

Tolueno

Etanol

Benceno

Dioxano

Cloroformo

Metanol

Diclorometano

Agua

Cromatografa De Capa Fina

Adsorbentes mas comunes:
Gel de slice
Oxido de Aluminio o Almina
Celulosa
Poliamidas

Cromatografa De Capa Fina

Reveladores mas comunes:
Luz UV

Introduccin de la placa
en vapores de yodo

Rocio con una solucin de agua/H2SO4 1:1, despus

calentar intensamente hasta carbonizar los compuestos.

Cromatografa De Capa Fina

Factores que influyen en la separacin:
T : Entre <, mas se absorbe en la fase estacionaria.
Corrientes de aire
Contaminantes (deben limpiarse con una mezcla de
cloroformo y metanol)
Pureza de los disolventes

Cromatografa De Capa Fina

Anlisis Cualitativo:
Comparacin entre la altura de migracin de la sustancia a
identificar Vs. Altura de estndar de la sustancia esperada.

La altura de migracin
es especifica para cada
sustancia en condiciones
cromatograficas definidas.

RF (Rate factor) = (DM) Distancia recorrida por el compuesto

(DF) Distancia recorrida por el disolvente

Cromatografa De Capa Fina

Anlisis semicuantitativo:

Comparacin del tamao e intensidad de la mancha de la

sustancia problema Vs. Patrones de diferentes
concentraciones.

El grado de exactitud lo determina el No. de diluciones de

los patrones empleados.

Cromatografa De Capa Fina

Anlisis cuantitativo: 2 mtodos.
A. Raspado: Se raspa la mancha de inters y luego con el
solvente adecuado se extrae la sustancia, a continuacin se
determina la cantidad mediante titulacin o lectura
colorimtrica.
Desventaja: Requiere cantidades grandes de la sustancia.

B. Densitometra: Con un densitmetro se mide la intensidad de

la luz reflejada directamente sobre la placa.
Ventajas: Menor tiempo y trabajo. Buena exactitud y
reproductibilidad
Rta/ En papel milimetrado en forma de picos cuya rea es
proporcional al tamao de la mancha .

Placa Bsica y estricnina

En un embudo de separacin servir 10 ml de la muestra y
verificar el pH con el papel indicador, dependiendo de este,
llevarlo a un pH bsico con NaOH 0,5 N.

Adicionar 25 ml, de cloroformo y agitar por 3 min, (abrir la llave

del embudo para liberar la presin por volatilidad del
cloroformo)

Separar las dos capas formadas y filtrar la capa inferior (fase

orgnica)

Placa Bsica y estricnina

Poner el embudo de filtracin con el papel filtro sobre el
equipo de filtracin y en la parte inferior poner la capsula de
evaporacin previamente marcada.

Dejar caer el cloroformo (fase orgnica) que queda en la

parte inferior del embudo de separacin.

La capsula con el solvente se lleva a la campana de

extraccin y se deja evaporar a sequedad.

Placa Bsica y estricnina

Con regla y lpiz, hacer lneas en el sentido que corri la silica
con 1cm de distancia. Marcar el borde inferior a 1cm de la
base con lneas punteadas (siembra) y el punto final a 10 cm
de este.

Redisolver la capsula de la muestra con 0,5 ml de cloroformo,

y con un capilar sembrarla 20 veces en el mismo sitio del
punto de siembra de la placa, evitando romper la slica.

Placa Bsica y estricnina

Redisolver los controles con 0,5ml de cloroformo y con un
capilar sembrar 5 veces en el mismo sitio del punto de
siembra.

Poner la placa en la cmara de saturacin que contiene

Metanol: Amoniaco (100:1,5) y dejarla correr hasta el punto
final del recorrido.

Retirar y dejar secar la placa para ser revelada por

aspersin con el reactivo de Dragendorff.

Placa Bsica y estricnina

Observar la aparicin de las manchas tpicas de cada
control y compararlas con la muestra.

El mtodo es cualitativo y el limite de deteccin para

drogas de naturaleza bsica y neutra es de al menos
1ug/ml.

Muestras: Orina ocasional, contenido gstrico y muestras no

biolgicas.