DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DE GLUTAMINA-SINTETASA

Introduccin

La sntesis de la glutamina es un proceso fundamental, en el organismo pues su grupo amida
constituye la fuente de tomos de nitrgeno de distintas molculas importantes como:
aminocidos, nucletidos, carbamil-fosfato (precursor de nucletidos). Por otra parte en forma de
glutamina es transportado el amoniaco en los organismos amonotelicos, impidiendo as alta su
alta toxicidad.

La enzima se ha obtenido de diversas como son: cerebro de oveja, guisantes, microorganismos
como la Eschericha coli, etc.

La glutamina sintetasa es especfica para el ATP. El L-glutamato puede ser sustituido por el D-
glutamato. El amoniaco, hidroxilamina o hiodracinas son todos igualmente activos cuando el
glutamato esta presente.



La enzima requiere de Mg
2+ p
ara su actividad, mientras que el Ca
2+
la inhibe por competencia con
el citado activador. Tambin es inhibida por fluor y p-mercuribenzoato. La glutamina sintetasa es
una enzima reguladora y en la Eschericha coli esta sometida a una serie de controles, siendo
modulada negativamente por triptfano, carbomil-fosfato, histidina, CTP, AMP, glicina y alanina,
compuestos en cuya sntesis participa la glutamina ya sea en forma directa o indirecta, excepto en
los dos ltimos compuestos.

En la prctica se aislara la enzima y posteriormente se comprobaran algunas de sus propiedades.
Se utilizaran como sustrato la hidroxilamina en lugar de amoniaco, por lo que el producto formado
ser el glutamil-hidroxamato, que forma un compuesto coloreado con la solucin de cloruro ferrico
en medio cido, lo que permitir que pueda ser cuantificada la actividad de la glutamina-sintetasa.

Reactivos
Arvejas secas
Solucin de NaHCO
3
1 mol / L
Solucin de glutamato de sodio 1 mol /L; pH 7,5
Solucin de clorhidrato de hidroxilamina 1 mol / L; pH 7,5
Solucin amortiguadora de TRIS-HCl 0,8 mol / L; pH 7,5
Reactivo de cloruro frrico en medio cido (FeCl
3
)
Solucin de CaCl
2
1 mol / L
Solucin de MgSO
4
1 mol / L
Solucin de ATP 0,025 mol / L

Materiales
Hielo
Mortero
Centrfuga
Membrana de dilisis
Agitador magntico
Pipetas
Tubos de ensayo
Probeta
Bao de hielo
Embudos
Gasa
Bao mara
Espectrofotmetro
Cronometro
Vaso de precipitados

Marcha Experimental

A. Extraccin de la enzima glutamina-sintetasa.
1. Homogenice en un mortero 5 g de guisantes mantenidos en H
2
O durante la noche anterior
adicionando porciones de NaHCO
3
1 mol / L fro hasta un total de 15 mL. Mantenga la
preparacin durante 20 min en un bao de hielo.
2. Centrifugue en fro la suspensin durante 15 min a 5 000 r / min, filtre el sobrenadante por una
gasa.
3. Dialise el extracto enzimtico (sobrenadante) durante 1 h con agua destilada, cambiando el
agua cada 15 min.

B. Ensayo enzimatico

1. Prepare los siguientes tubos (los nmeros representan mL) segn la tabla siguiente:


Tubos

1 2 3 4 5
Solucin amortiguadora de TRIS-HCl, pH 7,5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
ATP 0,025 mol / L ---- 1.5 ---- 1.5 1.5
Glutamato 1 mol / L 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
MgSO
4
1 mol / L ----- 0.2 0.2 ---- 0.2
CaCl
2
1 mol / L ---- ---- ---- ---- 0.2
clorhidrato de Hidroxilamina 1 mol/ L 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
Enzima (extracto) ---- 1.5 1.5 1.5 1.5
H
2
O destilada 3.4 0.2 1.7 0.4 -----
Incube los tubos durante 20 min a 30 C
Reactivo de cloruro ferrico 2.25 2.25 2.25 2.25 2.25


2. Filtre cada tubo y determine la absorbancia de los filtrados a 540 nm

Presentacin de los resultados
1. Determine la concentracin de glutamil-hidroxamato en cada tubo. El Coeficiente de extincin
molar (), relaciona la absorbancia con la [protena]. En el caso de la GS es 0,89 mM
-1
x cm
-1
.
Absorbancia = x [C] x l l = 1 cm.
2. Determine la actividad de la enzima por mL de extracto y por minuto en cada tubo.
3. Discuta los papeles del ATP; Mg
2+
Ca
2+
y el proceso de dilisis.