PRACTICA N° 9

QUÍMICA BIOINORGANICA DEL ZINC

I. OBJETIVOS
- Determinar la actividad de la fosfatasa alcalina en la hidrólisis del
paranitrofenilfosfato.
- Graficar una curva de la hidrólisis del paranitrofenilfosfato, por acción
de la fosfatasa alcalina.

II. FUNDAMENTO TEORICO

El zinc es un elemento esencial en nuestro organismo, siendo fundamental para el

desarrollo y la función de todas las células del sistema inmune, y para la transmisión
de información genética. It has catalytic or structural roles in a wide range of
proteins ( ), including anthrax lethal factor ( ). Tiene función catalítica o estructural
en una amplia gama de proteínas, laRecruitment of Zn 2+ activates some bacterial
enterotoxins ( ) and is being used as a drug design strategy for enhancing the
potency of organic serine protease inhibitors ( ). presencia de Zn 2 + activa ciertas
enterotoxinas bacterianas y está siendo utilizada como una estrategia de diseño de
fármacos para aumentar la potencia de los inhibidores de la proteasa de serina
orgánica .
La fosfatasa alcalina cataliza la hidrólisis de monoésteres del ácido ortofosfórico
con alcoholes primarios, secundarios, fenoles y mononucleotidos, mostrando una
actividad máxima a valores de pH de alrededor de 8 ó mayores, actúa sobre los
esteres fosfóricos liberando fosfato inorgánico, de acuerdo a la siguiente acuación:
FAL
Fosfato de p-nitrofenilo + H2O → p- nitofenol + HPO42- + 2H+

Reacción enzimática
La enzima presenta, una cierta actividad de fosfatotransferasa y contiene cuatro
iones Zn (II) por molécula dos de los cuales cumplen un rol estructural en la
estabilización de la estructura cuaternaria, constituida por dos sub unidades y los
otros dos son los responsables de la actividad catiónica

La fosfatasa alcalina recibe el nombre de orto-fosfórico-monoéster hidrolasa.

Estas enzimas proceden de la ruptura normal de las células sanguíneas y de otros
tejidos, muchas de ellas no tienen un papel metabólico en el plasma excepto las
enzimas relacionadas con la coagulación y con el sistema del complemento.

La fosfatasa alcalina consiste de dos cadenas de polipéptidos que al plegarse,

contiene regiones considerables de estructuras secundarias Alfa y Beta, así como
también menos regiones plegadas sólidamente de espiral aleatoria, mostradas en el
listón modelo.

Las otras proteínas se pliegan de manera diferente. Algunas proteínas como la seda,
contienen únicamente estructura secundaria Beta; otros, como mioglobina,
contienen únicamente hélices Alfa.

Las regiones de hélices Alfa, están representadas en la figura por listones enrollados
azul claro, y las regiones Beta están representadas por los listones azul obscuro
listones planos. Las regiones de espiral aleatoria (ninguna estructura regular) se
muestran con las hebras más delgadas.

Estructura de la fosfatasa alcalina

La fosfatasa es una enzima clasificada dentro de las hidrolasas. Las fosfatasas

alcalinas son enzimas que se encuentran presentes en casi todos los tejidos del
organismo, siendo particularmente alta en huesos, hígado, placenta, intestinos,
riñón. Tanto el aumento, así como su disminución en plasma tienen significado
clínico. Las causas de un aumento de FAL:

 Enfermedad ósea de Paget, obstrucciones hepáticas, hepatitis, hepatoxicidad por

medicamentos y osteomalacia.

Las causas de una disminución de FAL:

 Cretinismo y déficit de vitamina C

  Condiciones fisiológicas que elevan las fosfatasa alcalinas

1) Crecimiento: Durante la niñez y adolescencia aumentan las fosfatasas alcalinas

de origen óseo y los niveles pueden llegar a ser 3 veces los de un adulto normal.
2) Embarazo: Las fosfatasas alcalinas de origen placentario explican las
elevaciones que se producen durante el embarazo y que pueden llegar doblar los
niveles al fin del embarazo.
3) Diferencias por edad y sexo: Las fosfatasas alcalinas son más altas a partir de
los 60 años. En adultos jóvenes los hombres tienen niveles más altos que las
mujeres. A partir de los 60 años, los niveles son más elevados en mujeres.
Causas de elevación de fosfatasas alcalinas

El primer paso frente a una elevación de fosfatasas alcalinas consiste en confirmar

su origen hepático mediante la medición de otras enzimas que se elevan en la
colestasia. La enzima más utilizada para este propósito es la gama glutamil
transpeptidasa. Las enfermedades que causan elevaciones de fosfatasas alcalinas de
origen hepático pueden dividirse en enfermedades colestásicas extra e intra-
hepáticas, y enfermedades infiltrativas.

Colestasia extra-hepática: cálculos biliares, tumores

Colestasia intra-hepática: cirrosis biliar primaria
Enfermedades infiltrativas: Linfoma, metástasis, tuberculosis, sarcoidosis y
micobacterias atípicas (virus del SIDA).

La actividad de la fosfatasa alcalina puede determinarse experimentalmente usando

como substrato una solución de p-nitrofenil fosfato el cual se hidroliza por acción de
la enzima en p-nitrofenol. La concentración del p-nitrofenol se determina
espectrofotométricamente, para ello se mide la absorbancia de patrones de p-
nitrofenol. El sustrato p-nitrifenilfosfato no absorbe a esta longitud de onda por lo
tanto no interfiere en la determinación del p-nitrofenol.

El rango normal es de 44 a 147 UI/L (Unidades internacionales por litro), aunque

éstos valores pueden variar ligeramente de un laboratorio a otro, al igual con la edad
y el sexo de la persona. Los niveles altos de FA normalmente se observan en niños
que presentan un aumento repentino en su crecimiento y en las mujeres
embarazadas.

III. PARTE EXPERIMENTAL

a) Materiales
- Espectrofotómetro visible
- Pipetas
- Tubos de ensayo
- Fiolas
- Embudos
- Papel filtro
- Mortero
 b) Reactivos

- Amortiguador de bicarbonato – carbonato de sodio, pH = 10 ; (55ml de

solución de Na2CO3 0.1M y 45 ml de NaHCO3 0.1M )

- Solución de sustrato p-nitrofenilfosfato (5m mol/L en amortiguador

alcalino)

- Patrones de p-nitrofenol (50  mol/L ) disolver 69.6 mg de p-nitrofenol

en 100 ml de amortiguador alcalino. Diluir esta solución 1 a 100 ml. con el
amortiguador. Las soluciones anteriores deben estar siempre recientemente
preparadas.
- Solución de Manitol 200 mM

- Solución de Cl2Mg 3mM

- Suero de hígado triturado (licuar 100 g. de hígado mezclando con 50 ml

de agua destilada, filtrar y aforar a 50 ml.)

III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Pipetear en cada uno de los tubos, las cantidades indicadas y agitar

Determinación de la Fosfatasa Alcalina

Tubo Tampón Manitol Cl2Mg pNP pNP Muestra Reacción NaOH Abs.
pH:10.2 200 3mM 1mM 10mM Suero 3M 405
mM (Patrón Sustrato nm
)
Blanco 0.8 ml 1 ml 1 ml --- --- --- Incubar a 10 ml
1 0.7ml 1 ml 1 ml 0.1 ml --- --- 30°C 15 10 ml
min.
2 0.6 ml 1 ml 1 ml 0.2 ml --- --- 10 ml
3 0.5 ml 1 ml 1 ml 0.3 ml --- --- 10 ml
Muestr 0.8 ml 1 ml 1 ml --- 1 ml 1 ml 10 ml
a

Muestra.- Agregar 0.8 ml de amortiguador de carbonato-bicarbonato a 1 ml. de la

solución de sustrato p-nitrofenilfosfato, 1 ml de Manitol 200 mM, 1 ml de Cl2Mg 3mM
y mezclar vigorosamente. A un tiempo cero agregue 0.2 ml de suero (Muestra), Incubar
a
30°C por 15 min y agregar 10 ml de NaOH 3M para detener la reacción. Leer la
longitud de onda a 405nm
Blanco.- preparar lo mismo que la muestra, excepto que en vez del suero se usa
amortiguador. Leer la longitud de onda a 405nm
Patrón.- Preparar una serie de soluciones patrones de p-nitrofenol, leer la longitud de
onda a 405nm y hacer un gráfico de la extinción a 405 nm en función de la
concentración, que será la curva patrón.
Se puede leer la absorbancia (A) inicial de la muestra, poner en marcha el cronómetro y
leer la absorbancia cada minuto durante 3 minutos.
Calcular el promedio del incremento de absorbancia por minuto (A/min).

REPORTE DE RESULTADOS N° 9

QUÍMICA BIOINORGANICA DEL ZINC

NOMBRES Y APELLIDOS: __________________________________________

1. Cuáles son las características de la Fosfatasa alcalina?

2. Cuáles son las ecuaciones químicas que se dan en la experiencia?

3. Hacer un gráfico ploteando la concentración de pNitrofenol (μM) frente a la

absorbancia

Concentración de los patrones Absorbancias

1.
2.
3.

4. Interpolar los valores de absorbancia obtenidos en el ensayo enzimático.

5. Expresar los resultados obtenidos como U/L (μmol/min/L).

6. Usando datos experimentales, determinar la actividad de la fosfatasa alcalina

7. Que otro sustrato puede emplearse en el experimento, explicar?

8. Discusión de resultados

9. Conclusiones.
10. Bibliografía